Аннотация результатов, полученных в 2016 году
Проведенные исследования в рамках проекта включают следующие результаты. Алгоритм обработки получаемой спектральной информации по сигналу комбинационного рассеяния света представляет собой выделение необходимого диапазона спектра, вычитание базовой линии и различные статистические манипуляции (такие как анализ главных компонент или проекция на латентные структуры) с использованием специального программного обеспечения. Нами были использованы программы OPUS версии 7.0 и The Unscrambler версии 10.3. В ходе проведенных исследований было установлено, что для проведения анализа получаемой спектральной информации целесообразно использовать дипазон частотных сдвигов 400 – 2400 см-1 (для анализа спектров КР гликированных и негликированных белков на алюминиевых подложках и при фиксации на них наночастиц золота) и 500-1500 см-1 (при анализе спектров на наноструктурах сребра). Вычитание базовой линии проводится по 64 точкам нижних экстремумов спектра с четырьмя дополнительными итерациями функции Rubberband в алгоритме. Обработанные вышеописанным образом спектры можно использовать для многопараметрического анализа с использованием метода главных компонент и прочих статистических приёмов. Для проведения анализа полученных спектров методом анализа главных компонент (АГК) использовали программный пакет IBM SPSS 21. Для преобразования полученных данных из формата .DPT в формат, удобный для использования в пакете IBM SPSS 21, был разработан специальный «скрипт» - CSG, трансформирующий данный формата .DPT в формат программного пакета Excel 2010, позволяющий корректно отображать исходные спектральные данные в среде IBM SPSS 21. Для проведения количественного анализа по величинам интенсивности отдельных пиков использовали представление в среде OPUS c последующим представлением градуировочных зависимостей в программе OriginPro 7.0. Для проведения количественного анализа методом проекции на латентные структуры (ЛПС) исходные данные преобразовывали в формат Excel с помощью «скрипта» CSG. Полученные данные экспортировали в среду программного пакета MatLab. Далее средствами MatLab осуществляли анализ методом ПЛС. При исследовании возможности относительного и абсолютного определения уровней гемоглобина в крови с использованием различных способов подготовки проб крови была проведена оценка возможностей количественного определения гликированного (HbA1c) и негликированного гемоглобина (HbA) методами спектроскопии комбинационного рассеяния. В работе использовали лазер с длиной волны 785 нм. Спектры КР получали с использованием прибора «innoRam BWTek» (США). При оценке метода подготовки пробы использовали следующие критерии: возможность регистрации сигнала КР молекул гемоглобинов, воспроизводимость получения спектров КР при последовательных измерениях, долговременная стабильность измеряемых сигналов КР, достаточная интенсивность сигналов КР для проведения количественного анализа. Наилучшие результаты были получены с использованием метода нанесения и высушивания капли раствора (НВКР). В качестве подложки использовалась алюминиевая фольга. В экспериментах, направленных на качественный и количественный анализ гемоглобинов использовали нормализацию и усреднение по нескольким спектрам. Определение гликированной и негликированной форм гемоглобина проводилась на основе: селективного анализа спектров и селективной адсорбции гликированной формы гемоглобина. Селективный анализ спектров показал, что в области 464 – 1640 см-1 хорошо виден набор характерных для гемоглобинов пиков. Разностный спектр этих двух форм позволяет выделить области, характерные для гликированной формы гемоглобина. Наиболее полное сравнение спектральных данных, полученных для различных форм гемоглобина можно провести, используя метод анализа главных компонент (АГК). Основные различия проявились в значениях первой главной компоненты. Для гликированной формы гемоглобина счета первой главной компоненты группируются в положительной области. Таким образом, на основании анализа разностных спектров и анализа спектров КР методом АГК можно утверждать, что спектры КР гликированного гемоглобина достоверно отличаются от спектров КР негликированной формы и их можно разделить с высокой надежностью. Селективную адсорбцию HbA1c проводили на поверхности НЧ золота, модифицированных производными фенилбороновой кислоты. На основании анализа разностных спектров и анализа спектров КР методом АГК можно утверждать, что и в этом случае спектры КР гликированного гемоглобина достоверно отличаются от спектров КР негликированной формы и их можно разделить с высокой надежностью. Количественный анализ образцов HbA можно проводить на основе пиков в области 464–1640 см-1, величины счета первой главной компоненты и на основе метода «проекция на латентные структуры» (ПЛС). Как и в случае с негликированным гемоглобином количественный анализ образцов HbA1c можно проводить на основе пиков в области 464 – 1640 см-1, величины счета первой главной компоненты и на основе метода «проекция на латентные структуры» (ПЛС). Применение методов НВКР и ПЛС. В этом случае были использованы смеси двух форм гемоглобина (негликированный человеческий гемоглобин и гликированный человеческий гемоглобин). Общая концентрация гемоглобинов во всех смесях составляла величину 10 мг/мл. В работе использовали 5 смесей с различным процентным содержанием гликированной формы гемоглобина (4, 10, 15, 20 и 25%). Коэффициент линейной корреляции для полученной градуировочной зависимости составляет величину 0,984. Это удовлетворительный результат, позволяющий прогнозировать успешную разработку метода на основе НВКР и ПЛС. При оценке возможностей дополнительного усиления сигнала гигантского комбинационного рассеяния на наночастицах золота и серебра на диэлектрических подложках, изготовленных из оксидов металлов были проведены исследование режимов напыления, влияния толщины, способов предварительной обработки. Были исследованы диэлектрические трехмерные структуры двух типов: на основе массива игл в диэлектрическом кремнии и массива прямоугольных полосчатых резонаторов на основе полиметилметакрилата на золотом подслое на подложке из кремния. Массив диэлектрических игл. Подложка на основе диэлектрических игл представляет собой регулярный массив остроконечных структур, сформированных в подложке из диэлектрического кремния методом плазмохимического травления. Для изучения усиливающих свойств структуры на её поверхность наносили наночастицы золота диаметром 56 нм с иммобилизованной на их поверхности ГКР-меткой - 5,5'-дитиобис-2-нитробензойной кислотой (ДТНБ). Распределение величины ГКР сигнала наночастиц позволяет изучить особенности усиления на разных участках игл, на вершинах, на боковых поверхностях, между иглами. За первый год выполнения проекта разработан новый класс оптических композитных метаматериалов на основе периодических микро резонаторных структур, фокусирующих гигантские электромагнитные поля на поверхности метаматериала. Методом электронно-лучевой литографии изготовлен метаматериал на основе периодических полос полиметилметакрилата (ПММА) с периодом 670-680 нм на пленке из золота. Параметры структуры выбраны таким образом, чтобы молекулы белков с размерами до 20 нм разместились в области локализации гибридных металло-диэлектрических резонансных мод. Проведено комплексное исследование оптических свойств созданного метаматериала. На поверхность метаматериала были иммобилизованы наночастицы золота (НЧЗ) среднего размера (56±1) нм, покрытые ДТНБ. Измерения нормированного на количество золота сигнала КР от конъюгата НЧЗ-ТНБ показали, что основные спектральные линии ДТНБ (326 см-1, 1060 см-1, 1338 см-1, 1558 см-1) усилены от 2 до 6 раз в структурированной области по сравнению с пленкой. Разработанные метаматериалы являются эффективными, усиливающими сигнал ГКР структурами и могут быть использованы в целях анализа содержания гликированного альбумина и гемоглобина в крови человека Подложки для усиления сигнала комбинационного рассеяния на основе серебряных покрытий были получены методом электронно-лучевого распыления в вакууме. Процесс распыления проводили на подложки из слюды. Подложки были охарактеризованы с помощью методов атомно-силовой микроскопии, эллипсометрии, сканирующей электронной микроскопии и рентгеновской фотоэлектронной спектроскопии. Анализ спектров эллипсометрических коэффициентов подложек показал, что в макромасштабе они обладают оптическими характеристиками, соответствующими регулярным металлическим пленкам серебра. Одновременно с этим детальные исследования микроструктуры показывают нерегулярные пористые образования со сложным складчатым строением. Анализ микроструктуры показывает, что размер пор варьируется от 150 до 300 нм, площадь поверхности, занятой порами, составляет 8 – 25 % в зависимости от параметров процесса распыления. Шероховатость пленок не превышает 2 нм. Химическое строение пленок анализировали с помощью рентгеновской фотоэлектронной спектроскопии (РФЭС). Общий РФЭС содержит в основном пики серебра, с дополнительными сигналами, связанными с кислородом, углеродом и незначительным количеством меди. С целью оптимизации количественного формата проведения анализа гликированных и негликированных форм альбумина были исследованы возможности модификации полученных плазмонных структур серебра 4-меркаптофенилбороновой кислотой. При сорбции на такую модифицированную подложку гликированного белка бороновая группа ковалентно связывает остатки глюкозы, селективно сорбируя только гликированный альбумин, и в спектре видны полосы белка – пики 893 и 1324 см-1, которые относятся к колебаниям глицина. При сорбции негликированного белка на спектре отражаются только полосы подложки. Таким образом, модификация плазмонных структур серебра бороновыми группами позволяет селективно измерять вклад только гликированного альбумина. Увеличение чувствительности может быть достигнуто за счет проведения автометаллографии (АМГ) с различными видами восстановителей в реакции с золотохлористоводородной кислотой (ЗХВК). Из полученных данных можно сделать вывод, что использование формальдегида в концентрации 0,1 мМ дает дополнительное усиление сигнала ГКР в 40 – 50 раз, а такие восстановители как цитрат натрия и перекись водорода в реакции с ЗХВК также положительно влияют на усиление величины сигнала ГКР. На первом этапе выполнения проекта были проведены работы по разработке подходов к изготовлению микрофлюидных чипов, ориентированных на задачи отделения форменных элементов и смешения жидких проб в различных пропорциях. В ходе первого этапа работы была разработана технология создания мастер форм для изготовления МФЧ из ПДМС, которая использована в дальнейших исследованиях. Разработанная технология реализует изготовление МФЧ с минимальными латеральными размерами от 20 мкм и более при высоте каналов 25, 50 и 75 мкм. Для разбавления пробы крови использовался двухканальный МФЧ, пропорции разбавления в котором регулировалась разницей давлений в соответствующих входных каналах МФЧ. Для манипуляций с МФЧ разработан и собран стенд на базе оборудования компании Dolomite (Великобритания). После разбавления пробы в требуемых пропорциях буфер и проба смешивались в МФЧ различными методами. Показано, например, что для перемешивания пробы в микроканалах МФЧ (в форме меандра) необходима длина канала порядка 10-15см, что может быть реализовано в достаточно компактном линейном размере чипа.

Аннотация результатов, полученных в 2017 году
Впервые исследована возможность управляемого с помощью ультразвука осаждения белка из раствора на поверхность ГКР-активной подложки в структуре микрофлюидного чипа с целью пробоподготовки для последующего снятия спектров КР. Для проведения исследований по разработке биоаналитической платформы для определения гликозилированных белков были созданы и охарактеризованы ГКР-подложки нового типа. Подложки представляют собой специальную серебросоджержащую полимерную пасту толщиной порядка 20 мкм, нанесённую на брусок алюминия толщиной 5 мм. Разработанные подложки просты в приготовлении и использовании и подходят для рутинного анализа большого количества образцов. Описанные в разделе 2 ГКР-активные подложки использовали для селективного определения гликированных белков с помощью фенилбороновой кислоты. Проведено комплексное исследование оптических свойств двумерных тонкопленочных периодических структур в виде диэлектрических микро-гребней и микро-конусов в СВЧ и оптическом диапазоне частот. Проведено компьютерное моделирование, работы по созданию структур, а также экспериментальные исследования, которые продемонстрировали аномальный оптический отклик от исследуемых мета поверхностей за счет возбуждения как диэлектрических, так и гибридных металлодиэлектрических резонансов.

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Человеческий сывороточный альбумин (ЧСА) и гликированный человеческий сывороточный альбумин (ГА) имеют очень сходную структуру. Химически и структурно эти две молекулы практически идентичны, за исключением различий в остатках сахара; и именно это различие позволяет различать два белка на определенной модифицированной поверхности. Поскольку модифицированная ГКР-подложка на основе серебряной пасты обеспечивает качественное хемисорбирование молекул, содержащих остатки сахаров и обеспечивает заметную разницу с контролем, она может рассматриваться как специфическая подложка для количественного определения остатков сахара. В ходе выполнения проекта разработан метод количественного определения ГА в плазме крови человека, основанный на использовании нового ГКР-активного субстрата. Разработана 3D-модель автоматизированной микрофлюидной системы, предполагающая использование поршневых насосов и микроскопа, сопряженного с КР-спектрометром.