Аннотация результатов, полученных в 2016 году
Для решения задачи детального изучения новой уникальной грибной биолюминесцентной системы на первый год выполнения проекта было запланировано получение очищенного препарата люциферазы – фермента, ответственного за генерацию света в грибах. Работу проводили на биомассе тропического гриба Neonothopanus nambi, которую наращивали в культиваторах. В результате предварительных исследований был найден способ многократного увеличения интенсивности биолюминесценции мицелия N.nambi путем его вымачивания и отмывки в дистиллированной воде. Установлено, что люциферазная активность не секретируется в культуральную жидкость, а локализована исключительно в клетках гриба. Разработана методика получения гомогенной люциферазы, включающая четыре основных этапа: приготовление лизата N.nambi, концентрирование целевого белка, его хроматографическую очистку, нативный гель-электрофорез. Процедура разрушения клеток мицелия на первом этапе включала заморозку биомассы, механическое перетирание в ступе, обработку ультразвуком. Экстракцию целевого фермента проводили из микросомальной фракции, содержащей практически всю люминесцентную активность и полученной в результате двухступенчатого центрифугирования безъядерного супернатанта. Максимальная концентрация люциферазы достигалась путем солюбилизации ее в мицеллы детергента додецилмальтозида. Очистку люциферазы проводили в несколько стадий, с применением анионообменной хроматографии на DEAE-Sepharose и гель-фильтрации на Superdex 200. На следующей стадии была применена методика электрофореза очищенного препарата с целью нахождения полосы, соответствующей люциферазной активности. Электрофорез проводили как в денатурирующих, так и в нативных условиях. Требуемого надежного результата удалось достигнуть только в последнем случае. Для конечного этапа была разработана процедура двумерного электрофореза в натуральных условиях с последующей детекцией биолюминесценции, для чего гель инкубировали в смеси, содержащей синтетический грибной люциферин. В итоге удалось выявить светящееся пятно. Последующая окраска геля серебром позволила достоверно локализовать целевой белок и вырезать его из геля. Была проведена серия таких экспериментов, в результате чего гомогенная люцифераза была выделена в количестве, достаточном для проведения секвенирования по Эдману (N-концевое секвенирование) и масс-спектрометрического секвенирования. Для решения задачи определения структурных фрагментов молекулы люциферина грибов, ответственных за люминесцентную реакцию, и получения аналогов люциферина грибов с измененными спектрами биолюминесценции, было синтезировано шесть производных люциферина, содержащих различные донорные заместители в бензольном ядре: (E)-3,4-дигидрокси-6-(4-гидроксистирил)-2H-пиран-2-он; (E)-3,4-дигидрокси-6-(2-(6-гидроксинафталин-2-ил)винил)-2H-пиран-2-он; (E)-3,4-дигидрокси-6-(2-(тиофен-2-ил)винил)-2H-пиран-2-он; (E)-6-(2-(1H-индол-3-ил)винил)-3,4-дигидрокси-2H-пиран-2-он; (E)-6-(4-(диэтиламино)стирил)-3,4-дигидрокси-2H-пиран-2-он; (E)-6-(2-(1,2,3,5,6,7-гексагидропиридо[3,2,1-ij]хинолин-9-ил)винил)-3,4-дигидрокси-2H-пиран-2-он. Из них все, кроме тиофен-содержащего аналога, проявили биолюминесцентные свойства. Изучены спектральные характеристики этих пяти соединений. Максимум биолюминесценции для нафталин-содержащего производного смещен относительно природного люциферина в красную область, в то время как для четырех других аналогов наблюдается смещение в синюю часть спектра. По полученным данным, активность аминосодержащих аналогов люциферина (E)-6-(4-(диэтиламино)стирил)-3,4-дигидрокси-2H-пиран-2-он и (E)-6-(2-(1,2,3,5,6,7-гексагидропиридо[3,2,1-ij]хинолин-9-ил)винил)-3,4-дигидрокси-2H-пиран-2-он превышает активность природного люциферина в 2 и 4 раза, соответственно. Производные с нафталиновым и индольным ядром малоактивны. Самый близкий к люциферину аналог, содержащий фенольный заместитель вместо катехольного, проявляет активность, равную 75% активности природного люциферина. Таким образом, установлено, что в реакции биолюминесценции ключевую роль играет пираноновый фрагмент люциферина грибов, в то время как катехольный фрагмент выполняет роль ауксохромного заместителя. Возможность широкого варьирования структуры полученных аналогов в области ароматического ядра люциферина без потери люминесцентной активности ясно указывает на то, что реакция биолюминесценции затрагивает только пираноновый фрагмент молекулы грибного люциферина. Для установления структуры продукта реакции биолюминесценции грибного люциферина – оксилюциферина – инкубировали субстрат реакции с белковым экстрактом гриба N. nambi, содержащим люциферазу. При этом отслеживали динамику образования продуктов по ВЭЖХ. Установлено, что первоначально образующийся из люциферина оксилюциферин, деградирует, распадаясь на четыре производных. На основании данных структурного анализа этих четырех молекул, была предложена формула самого оксилюциферина грибов как (2Z,5E)-6-(3,4-дигидроксифенил)-2-гидрокси-4-оксогекса-2,5-диеновой кислоты. Для подтверждения данной структуры был проведен встречный синтез. Полученное соединение совпало с нативным оксилюциферином по хроматографической подвижности, форме пика и спектру поглощения. На основании суммы полученных данных была предложена схема двухстадийной реакции биолюминесценции высших грибов.

Аннотация результатов, полученных в 2017 году
Для решения задачи детального изучения новой уникальной грибной биолюминесцентной системы на второй год выполнения проекта было запланировано получение библиотеки кДНК гриба Neonothopanus nambi. Для этого сначала из биомассы биолюминесцентного мицелия этого гриба выделили препарат суммарной РНК, а затем обогатили данный препарат мРНК с помощью магнитных частиц, несущих олигонуклеотиды олиго-dT. На следующем этапе на матрице этого обогащённого препарата РНК синтезировали ДНК-РНК гибрид и амплифицировали кДНК гриба Neonothopanus nambi с получением библиотеки двуцепочечной ДНК. Данную библиотеку подготавливали к высокопроизводительному секвенированию на платформе Illumina с помощью лигирования адаптеров TruSeq (Illumina) и проводили специфическую амплицикацию с праймерами от производителя для обогащения молекулами, успешно прошедшими лигирование. Полученный ПЦР-продукт очищали и благодаря вырезанию из агарозного геля для электрофореза соответствующей полосы обогащали последовательностями длиной 300-500 пар оснований. После этого препарат ДНК денатурировали в NaOH 0,1М и растворяли в HT1 буфере (Illumina), доводя до концентрации 10 pM. Затем генерировали кластеры в cBot (Illumina), используя набор реагентов TruSeq PE Cluster Kit v3-cBot-HS и проводили секвенирование по протоколу парного прочтения (2x100bp) с помощью китов Hiseq200 и TruSeq SBS chemistry. Демультиплексирование проводили с помощью CASAVA-1.8.2 (Illumina). Парные прочтения, полученные на платформе Illumina, анализировали и удаляли из них фрагменты последовательностей адаптеров, а также последовательности нуклеотидов, имеющие низкие значения Phred. Затем из данных удаляли короткие прочтения длиной менее 75 нуклеотидов. Оба этапа проводились программой Trimmomatic c использованием следующих параметров: ILLUMINACLIP:../TruSeq3-PE-2.fa:2:30:10 LEADING:10 TRAILING:10 SLIDINGWINDOW:5:15 MINLEN:70 HEADCROP:10. Полученные процессированные последовательности подвергались дальнейшей фильтрации: проводилась очистка от потенциальных контаминантов c помощью программы Bowtie2 и базы данных Genbank RefSeq. Наконец, из оставшихся прочтений проводили сборку транскриптома Neonothopanus nambi de novo с помощью программы Trinity, используя параметры, заданные в программе по умолчанию. Для получения аминокислотной последовательности люциферазы проводили гидролиз белка в полиакриламидном геле. Фрагмент полиакриламидного геля, соответствующий белковой полосе или пятну вырезали и подготавливали для проведения масс-спектроскопии с получением пептидной смеси. Для данной пептидной смеси проводили масс-спектрометрическое исследование с помощью метода LC-MS. Среди полученных масс-спектрометрических данных, обработанных оператором, производили поиск кандидатов на роль люциферазы в транскриптоме N. nambi. В результате были идентифицированы несколько возможных генов-кандидатов, которые были впоследствии клонированы в бактерии E. coli. Однако результаты проверки активности дали неоднозначные результаты, не позволяющие с уверенностью идентифицировать люциферазу, что, как выяснилось впоследствии, было связано с неоптимальными условиями экспрессии белков, а также тем фактом, что люцифераза гриба N. nambi является мембранным белком, что затрудняет его правильное сворачивание в клетках прокариот. В связи с полученными данными, было принято решение создать библиотеку кДНК гриба N. nambi и клонировать ее в дрожжи для последующей идентификации клона, экспрессирующего люциферазу. Для установления нуклеотидной последовательности гена новой люциферазы N. nambi была создана библиотека кДНК. Для этого из свежего мицелия гриба N. nambi была выделена тотальная РНК, обогащена фракцией мРНК и использована в качестве матрицы для синтеза библиотеки кДНК. Данная библиотека была заклонирована в вектор GAP-pPic9K для экспрессии в дрожжах Pichia pastoris. Линеаризованную библиотеку плазмид кДНК использовали для трансформации штамма Pichia pastoris GS115 электропорацией. Трансформированные клетки рассевали по чашкам Петри с твёрдой питательной средой и выращивали до состояния отдельных различимых колоний. Конечная библиотека кДНК N. nambi содержала около 1 миллиона колоний дрожжей. Каждую чашку Петри с трансформантами опрыскивали раствором люциферина гриба и анализировали с помощью IVIS Spectrum CT (PerkinElmer). Из светящихся клонов выделяли геномную ДНК и проводили амплификацию со специфических праймеров на встраиваемую последовательность. Все секвенированные клоны содержали одну и ту же последовательность, соответствующую последовательности гена nnLuz. Наконец, в наши планы входило клонирование гена новой люциферазы N. nambi, получение бактериального и/или эукариотического штамма-продуцента рекомбинантной люциферазы. Нами были выбраны бактериальный вектор pET23b, дрожжевой вектор pGAP-Kan, и вектор для экспрессии в культурах клеток млекопитающих C1. На основе данных векторов были созданы плазмиды, кодирующие ген nnLuz, которые были названы, соответственно, nnLuz/pGAP_Kan, nnLuz/pET23, nnLuz/C1. Работа данных ДНК-конструкций была проверена в клетках соответствующих организмов: nnLuz/pGAP_Kan в дрожжах P. pastoris GS115, nnLuz/pET23 в бактериях E. coli BL21 CodonPlus (DE3) и nnLuz/C1 в культурах человеческих клеток HEK293T, HeLa и культуре мышиных клеток CT26. В каждом из случаев в ответ на добавление люциферина грибов к клеткам возникала биолюминесценция, которую можно было детектировать люминометром Glomax 20/20 (Promega). С помощью векторов nnLuz/pGAP_Kan, nnLuz/pET23 были созданы штаммы-продуценты рекомбинантной люциферазы: штамм дрожжей P. pastoris GS115 и штамм бактерий E. coli BL21 CodonPlus (DE3), соответственно.

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
В результате работ, выполненных в течение 2018 года, наша научная группа смогла приблизиться к пониманию пространственной структуры белка из принципиально нового семейства, не имеющего описанных гомологов, - люциферазы грибов. В связи с уникальностью открытого нами фермента, и низкой предсказательной силы алгоритмов, рассчитывающих трёхмерные пространственные структуры для белков, структура гомологов которых не описана экспериментально, нам удалось получить слабо достоверную модель трёхмерной структуры люциферазы. Однако нами были вполне успешно определены консервативные участки, необходимые для функционирования люциферазы, предсказаны элементы вторичной структуры (6 альфа-спиралей и от 5 до 6 бета-участков для люцифераз различных грибов). С помощью экспериментальных подходов направленного и случайного мутагенеза мы определили роль цистеиновых остатков в белке люциферазы N. nambi: в частности, при точечных заменах на сериновые остатки или остатки, типичные для люцифераз других грибов наблюдалось падение люминесценции в различной степени; при случайном мутагенезе выявлялась тенденция к исчезновению люминесцентной активности при замене аминокислотных остатков Asp127, Arg136, Ser144, Asp173, Arg176, Glu237, Glu238, что дает основание для дальнейших исследований путем сайт-направленного мутагенеза именно этих аминокислот. Была разработана методика выделения функционально-активной люциферазы nnLuz-CHis, проэкспрессированной в клетках P. pastoris, анализ спектра кругового дихроизма это препарата указывает на то, что люцифераза, выделенная после экспрессии в клетках P.pastoris обладает выраженной вторичной структурой и может быть использована для дальнейшего установления её структуры методами рентгеновской кристаллографии, а также ЯМР. Кроме того, нами были созданы специфичная количественная тест-система на кофейную кислоту, работающая в пределах концентраций субстрата от 10 mkM до 12,5 mM. При этом предел детекции тест-системы достигает 50 пмоль.