Аннотация результатов, полученных в 2016 году
Был осуществлен синтез, установлена структура и изучена реакционная способность новых N2-, S2- и O2-алициклических ди- и тетрахлороклатрохелатных предшественников с инкапсулированным ионом железа(II) для их последующего использования в молекулярной индустрии биологически-активных клеточных комплексов металлов. Разработаны синтетические стратегии и эффективные синтетические процедуры для синтеза граммовых количеств новых ди- и тетрагалогеноклатрохелатов железа(II) как перспективных макробициклических предшественников клеточных комплексов металлов – потенциальных биологических эффекторов. Гексагалогеноклатрохелатные предшественники были получены с высокими выходами, используя прямую темплатную конденсацию на соответствующем ионе металла как матрице. Их нуклеофильное замещение с бинуклеофилами, образующими устойчивые шестичленные алициклические реберные фрагменты, было проведено постадийно, приводя к соответствующим ди- и тетрагалогеноклатрохелатным предшественникам. Нуклеофильное замещение виц-дигалогеноклатрохелатов вторичными алифатическими аминами как N-нуклеофилами приводит к образованию моноаминных клеточных комплексов как продуктов замещения только одного из двух атомов хлора в виц-положении одного и того же реберного хелатного фрагмента. Такая частичная функционализация позволила получить соответствующие моногалогеноклатрохелаты, которые претерпевают дальнейшее нуклеофильное замещение под действием более активных нуклеофилов, таких как первичные алифатические амины и тиолят-анионы. В случае анионных форм этилендиамина и 1,2-этандитиола как N2- и S2-бис-нуклеофилов, генерированных in situ в присутствие триэтиламина, нуклеофильное замещение приводит к образованию устойчивых шестичленных алициклических реберных заместителей в их макробициклических лигандах. Для этилендиамина как N2-бис-нуклеофила удалось получить с умеренным выходом только моно-N2-алициклический тетрахлороклатрохелат железа(II). Постадийное нуклеофильное замещение под действием анионных производных 1,2-этандитиола позволило получить как моно-, так и диреберно-замещенные S2-алициклические тетра- и дихлороклатрохелатные предшественники. Тетрахлороклатрохелат железа(II) с S2-алифатическим заместителем претерпевает дальнейшее нуклеофильное замещение одного из двух его дихлороглиоксиматных фрагментов, приводящее к N2,S2-алициклическому дихлороклатрохелату с тремя неэквивалентными реберными хелатирующими цепочками. Нуклеофильное замещение с анионными производными пирокатехина, генерированными in situ в присутствие триэтиламина, позволило получить ди- и тетрахлороклатрохелатные предшественники с инкапсулированным ионом железа(II), содержащих O2-шестичленный(-е) циклический(-е) фрагмент (-ы). Такие моно- и бис-пирокатехолатные макробициклические продукты были получены с относительно высокими выходами, используя молярные соотношения реагентов 1:1 и 1:2. Трис-пирокатехолатный клеточный комплекс с эквивалентными реберными фрагментами был получен с низким выходом в жестких условиях проведения реакции нуклеофильного замещения с использованием большого избытка пирокатехина при высокой температуре. Были получены и охарактеризованы методом РСА метиловые эфиры всех шести возможных орто-, мета- и пара-изомеров монорёберно-функционализированных дикарбоксифенилсульфидных клатрохелатов железа(II), их монофункционализированные аналоги и клатрохелатные предшественники. Амид-содержащие клатрохелатные комплексы с терминальными оптически-активными группами были получены с использованием стандартных синтетических подходов исходя из этих же клатрохелатных предшественников. Было установлено, что взаимодействие этих клеточных комплексов с белками приводит к возникновению их молекулярной асимметрии, приводящей к появлению сигналов в спектрах кругового дихроизма (КД) в диапазоне 350 – 600 нм. Этот хирооптический ответ обусловлен селективной фиксацией их FeN6-координационных полиэдров в одной из возможных TP–TAP искаженных конформации при образовании вышеуказанных супрамолекулярных ансамблей с белками. Эти искажения зависят от химического строения молекулы клатрохелата (т.е. от её конституционной изомерии – орто-, мета-, пара-положения функционализирующих оптически-активных групп этой молекулы), пространственной ориентации и конформации пендантных рёберных карбоксифенилсульфидных заместителей и сольватации. Установлено, что трис-диоксиматный клатрохелат железа(II) с двумя присущими амино-группами претерпевает электрофильное присоединение 1,10-фенатролин-5,6-диона и фенантрен-9,10-диона, приводящее к клеточным комплексам с полиароматическими аннелированными реберными заместителями; полученные клеточные комплексы претерпевают лиганд-центрированные редокс-процессы. Монорёберно-функционализированный макробициклический трис-диоксимат железа(II) c аннелированным гетероциклическим диметилхиноксалиновыми фрагментом был получен нуклеофильным замещением соответствующего дихлороклатрохелатного предшественника под действием анионного производного 4,5-диметил-1,2-фенилендиамина и последующим окислением генерированного in situ аминного макробициклического интермедиата под действием PbO2. Методом ЭСП изучена кинетика разложения клатрохелатов железа(II) с реберными орто-, мета-, пара-карбоксифенилсульфидными заместителями, в том числе, в условиях, моделирующих биологические среды для тестирования in vitro. Установлено, что скорость разложения клатрохелата увеличивается при увеличении pH. Использование 1,4-диоксана в качестве растворителя вместо ДМСО существенно (приблизительно в два раза) замедляет процесс разложения клатрохелата. 1,4-диоксан, как менее донорный растворитель, является предпочтительным по сравнению с ДМСО, для проведения длительных биохимических и спектральных экспериментов. Обнаружена зависимость химической устойчивости клатрохелата от положения карбоксильных групп в его реберных карбоксифенилсульфидных заместителях. Методом сдвига равновесия были определены константы устойчивости немакроциклических трис-комплексов железа(II) с алициклическими -диоксимами. В случае шести- и восьмичленных алициклических -диоксимов эти константы приблизительно на три порядка выше таковой для их семичленного аналога, что было объяснено более высоким напряжением в таком алицикле. Начато изучение кинетики синтеза клатрохелатного метилборатного трис-октоксимата железа(II). Установлено, что скорости первой и второй стадии этой реакции являются близкими, что объяснено конформационными переходами в их объемных циклооктановых реберных фрагментах. Ряд моно- и бис-клатрохелатов железа(II) был протестирован в качестве транскрипционных ингибиторов ДНК-полимеразы в in vitro системе, основанной на полимеразной цепной реакции; IC50 всех протестированных клеточных комплексов находятся в микромолярном диапазоне их концентраций. Для ряда комплексов с терминальными биорелевантными группами величины IC50 находятся в нижнем микромолярном диапазоне. Наибольшую in vitro ингибированную активность в системе ДНКП имеют моноклатрохелаты железа(II) с двумя карбоксифенилсульфидными реберными заместителями. Монокарбоксифенилсульфидные клатрохелаты железа(II) продемонстрировали существенно меньшую активность, по сравнению с орто-, мета- и пара-измерами их дикарбоксифенилсульфидиных аналогов. Дикарбоксифенилсульфидные клеточные комплексы значительно более активны, чем их бис-клатрохелатные аналоги. Переход от ди- к гексакарбоксисульфидным клатрохелатам не приводит к дальнейшему уменьшению IC50.

Аннотация результатов, полученных в 2017 году
Способность клеточных комплексов с инкапсулированным ионом металла (клатрохелатов) к образованию супрамолекулярных ассоциатов с альбуминами БСА и ЧСА была изучена методами флуоресцентной спектроскопии и кругового дихроизма (КД); в частности, было изучено тушение собственной флуоресценции белков и спектры КД гексакарбоксил-содержащих клатрохелатов железа(II), индуцированные их супрамолекулярным связыванием с этими транспортными белками. Возникновение спектров КД с полосами в видимом диапазоне при связывания клатрохелатов с альбуминами объяснено индукцией хиральности – селективной фиксацией клеточного остова молекулы клатрохелата как «гостя» в одной из ее тригонально-призматически (ТП) – тригонально-антипризматически (TAП)–искажённых конформаций ( или ). Зависимости Штерна–Вольмера интенсивности флуоресценции белков от концентрации этих макробициклических эффекторов свидетельствуют об образовании соответствующих супрамолекулярных ансамблей. В случае БСА, эффект такой оссоциации более значителен, чем таковой для аналогичных супрамолекулярных комплексов ЧСА. Сдвиги соответствующих максимумов излучения свидетельствовали об изменениях полярности окружения их триптофанового (Trp) остатка из-за связывания клатрохелатных молекул. Более слабое влияние этих макробициклических эффекторов на флуоресценцию ЧСА объяснено низкой доступностью его единственного остатка Trp, который скрыт в белковой глобуле, тогда как молекула БСА имеет два остатка Trp, один из которых расположен на его поверхности. Насыщение в кривых тушении флуоресценции этих белков наблюдалось при отношении клатрохелатный эффектор – белок приблизительно 5:2. Чтобы оценить влияние связывания клатрохелатных эффекторов на собственную флуоресценцию Trp и тирозильных (Tyr) остатков, было проведено сравнение её тушения при возбуждении с длиной волны 280 нм (когда возбуждаются оба типа остатков) и при 295 нм, когда могут быть возбуждены только остатки Trp. Полученные данные свидетельствуют о аналогичных моделях тушения для всех супрамолекулярных клатрохелат-содержащих ассоциатов с этими альбуминами; их связывание с протестированными клатрохелатами железа(II) влияет, в основном, на флуоресценцию Trp и лишь незначительно на таковую Tyr. Возникновение полос индуцированного (ИКД) в результате супрамолекулярного связывания гексакарбоксифенилсульфидных клатрахелатов железа(II) с БСА и ЧСA изучили в ближнем УФ и видимом диапазонах. Изначально оптически-неактивные клеточные комплексы продемонстрировали возникновение интенсивных полос ИКД как результат их супрамолекулярного связывания с этими альбуминами. Полосы ИКД соответствуют полосам в ЭСП этих макробициклических комплексов, но существенно отличаются от них по интенсивности и максимумам в случае мета-замещенного клеточного комплекса, а также по формам для орто- и пара-изомеров гексакарбоксильного клатрохелата железа(II). Наиболее интенсивные полосы ИКД с положительными знаками наблюдались в случае мета-изомера. Таковые в случае ассоциата его орто-замещенного макробициклического аналога с БСА менее интенсивны, но имеют схожие формы, тогда как полосы ИКД супрамолекулярного комплекса с ЧСА малоинтенсивны. Спектр ассоциата пара-замещенный клатрохелат – БСА характеризуется единственной интенсивной полосой с положительным знаком, тогда как таковой с ЧСА содержит две полосы с отрицательным знаком и одну полосу – с положительным, которые имеют близкую интенсивность. Наблюдаемые различия в полосах ИКД, вызванные связыванием с альбуминами конституциональных изомеров моно-, ди- и гексакарбоксильных клеточных комплексов железа(II) свидетельствуют о том, что число этих способных к сильному супрамолекулярному связыванию терминальных групп критично для устойчивости их супрамолекулярных ансамблей с транспортными белками. Связывание между этими альбуминами и гексакарбоксифенилсульфидными клатрохелатами железа(II) приводит к возникновению полос ИКД, положение, знак и интенсивность которых зависит как от природы макробициклического эффектора, так и от природы белка (БСА или ЧСА). Обнаружена спектральная селективность, связанная с конституциональной изомерией этого эффектора: она наиболее ярко выражена для орто-изомера и менее выражена в случае его пара- и мета-замещенных аналогов. Установлено, что конституциональные орто-, мета- или пара-изомеры гексакарбоксифенилсульфидного клатрохелата железа(II) являются перспективными молекулярными зондами на структурные различиях макромолекул ЧАС и БСА, а также способны выявлять структурные и конформационные изменения этих макромолекул, вызванные изменением рН. Нуклеофильным замещением дикарбоксилсодержащего гексахлороклатрохелата железа(II) был получен широкий круг клатрохелатов с терминальными полярными и ионогенными (включая протоногенные) группами. Начато изучение кадмий-промотируемых реакций этих карбоксил-содержащих макробициклических предшественников с низкоактивными нуклеофилами; получены первые бифункциональные алкилирующие клатрохелаты, чьи молекулы содержат как реакционноспособный атом хлора, так и реакционноспособную терминальную группу. Разработан простой и эффективный метод синтеза моногексадецилборатных трис-пиразолоксиматных псевдоклатрохелатов цинка, кобальта, железа и марганца(II) использующий one-pot темплатную конденсацию их пиразолоксиматного лигандного синтона с н-гексадецилбороновой кислотой на соответствующем ионе металла как матрице. Установлено, что атомы водорода трех терминальных пиразолильных NH-групп трех пиразолоксиматных синтонов образуют псевдомакробициклический лиганд за счет водородных связей Cl– … (HN)3 с противоионом, что позволяет инкапсулировать ион металла. По данным монокристального РСА для псевдоклатрохелата цинка(II), его кристалл содержит двумерные липидоподобные слои, образованные гексадецильными заместителями. Псевдоинкапсулированный ион цинка(II) в его молекуле находится практически в центре ZnN6-координационного полиэдра, который имеет геометрию ТП с очень незначительным углом искажения в сторону ТАП. Первый клатрохелат с присущим оптически-активным реберным заместителем – моноамидный бис--бензилдиоксиматный клеточный комплекс железа(II) – был получен нуклеофильным замещением его монохлороклатрохелатного предшественника под действием R-(+)-фенилэтиламина. По данным РСА, инкапсулирпованный ион железа(II) находится в центре его FeN6-координационного полиэдра, имеющего геометрию промежуточную между ТП и ТАП; средняя длина связей Fe–N близка к 1.91 Å. Было проведено in vitro тестирование цитотоксичности клатрохелатов железа(II) с двумя терминальными карбоксильными группами по отношению к промиелоцитарным лейкозным клеткам человека. Установлено, что симетрично-замещенные дикарбоксиарильные клатрохелаты и их диалкилсодержащие аналоги проявляют умеренную цитотоксичность в этой тест-системе (на низком микромолярном уровне), тогда как цитотоксичность их несиметрично-замещенных аналогов существенно ниже. Методом ЭСП изучена кинетика разложения гексафункционализированных клатрохелатов железа(II) с реберными орто-, мета- и пара-карбоксифенилсульфидными заместителями в модельных средах: изучено влияние состава буферного раствора, присутствия н-бутилборной кислоты и кислорода воздуха. Установлено, что в боратном буфере разложение модельного клатрохелатного комплекса проходит в меньшей степени, чем в среде фосфатного буфера. Увеличение концентрации н-бутилборной кислоты как сшивающего агента увеличивает устойчивость этого клатрохелата, тогда как использование анаэробных условий не замедляет этот процесс.

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
На настоящем этапе выполнения проекта была изучена способность клатрохелатов железа(II) с шестью карбоксифенилсульфидными реберными заместителями тестировать структурные и конформационные изменения третичной структуры белков, используя ИКД этих клеточных комплексов. Было протестировано их связывание со схожими по макромолекулярной структуре белками, человеческим и бычьим сывороточными альбуминами; их конформационные переходы были индуцированы изменением рН. Все конституциональные изомеры гексакарбоксифенилсульфидного клатрохелата железа(II) с орто-, мета- или пара-расположением их терминальных карбоксильных групп были изучены в качестве молекулярных проб. Образование ассоциатов клатрохелат – альбумин контролировали методами КД и тушения собственной флуоресценции белка. ИКТ была использована для определения термодинамических параметров ассоциатов «гость – хозяин» этих клеточных комплексов с БСА. Действительно, различия в макромолекулах и, следовательно, в структурах транспортных альбуминов БСА и ЧСА приводят к изменениям в расположении сайтов связывания ими лекарственных молекул. Поэтому изменения спектров ИКД ассоциатов БСА и ЧСА с клатрохелатами железа(II), содержащими шесть карбоксильных терминальных групп, вызваны изменениями окружения ансамблей БСА/ЧСА – клатрохелат, которое происходит в результате структурных изменений сайтов связывания БСА и ЧСА. Полученные флуоресцентные данные однозначно указывают на то, что супрамолекулярное связывание клатрохелат–белок обусловлено сайтом 1 соответствующей макромолекулы альбумина. Форма и интенсивность спектров КД ассоциатов гексакарбоксифенилсульфидных клатрохелатов железа(II) с альбуминами изменяются при изменении рН среды и, следовательно, они зависят от конформационных переходов третичных структур белков. Это свидетельствует о высокой чувствительности метода КД к супрамолекулярной структуре их ассоциатов с белками-«хозяевами». Установлено, что эти клеточные комплексы являются перспективными молекулярными пробами для мониторинга изменений конформаций белковых макромолекул. В целом, показано, что клатрохелаты железа(II), функционализированные шестью реберными карбоксифенилсульфидными заместителями, способны различать сывороточные альбумины схожей структур (в данном случае, человеческий и бычий альбумины), индуцирующие различные спектры клатрохелат-центрированного КД. Кроме того, изменение формы и интенсивности полос КД этих клеточных проб отражает рН-индуцированные изменения третичной структуры альбуминов. Конституциональная изомерия терминальных карбоксифенилсульфидных групп клатрохелатов железа(II) (наличие их орто-, мета- или пара-изомеров) оказывает значительное влияние как на спектры ИКД, возникающие при их связывании с белками, так и на термодинамические параметры образующихся супрамолекулярных ассоциатов «гость – хозяин». Используя метод ИКТ было установлено, что клеточные комплексы железа(II) с терминальными мета- и орто-карбоксифенилсульфидными группами имеют более высокие константы устойчивости ассоциатов и степень связывания клатрохелата с БСА, чем соответствующий пара-изомер. Таким образом, вышеупомянутые клатрохелаты являются перспективными молекулярными трехмерными платформами для создания КД-проб, способных распознавать специфические элементы поверхности белка. Проведенные исследования тушения собственной флуоресценции белков дизамещенными карбоксифенилсульфидными клатрохелатами железа(II) подтвердили их связывание с сывороточными альбуминами, лизоцимом и бета-лактоглобулином. Их макромолекулы содержат как положительно-заряженные остатки Arg и Lys, которые способны связывать клатрохелатные молекулы с полярными терминальными группами, так и остатки Trp вблизи или внутри их гидрофобных связующих карманов. Конституциональная изомерия этих клатрохелатных «гостей» существенно влияет на величину тушения собственной флуоресценции белка в случае макромолекул альбумина как «хозяев», будучи менее выраженной для лизоцима и бета-лактоглобулина. Прецизионные электростатические (кулоновские) и полярные взаимодействия макромолекул альбумина с вышеуказанными терминальными карбоксильными группами клеточных молекул определяют геометрию и расположение соответствующих ассоциатов «белок –клатрохелат». Взаимодействие дикарбоксифенилсульфидных клатрохелатов железа(II) с инсулином было протестировано с использованием их спектров ИКД. Среди изученных глобулярных белков, их супрамолекулярные взаимодействия с серией изомерных карбоксилфенилсульфидных клатрохелатов железа(II), молекулы которых содержат два эквивалентных или неэквивалентных реберных заместителя, интенсивные полосы КД индуцировались только в случае белков–«хозяев» с «транспортной» функцией. Макромолекулы последних, таких как сывороточные альбумины и бета-лактоглобулин, имеют хорошо сформированные гидрофобные связывающие «карманы» и положительно-заряженные аминокислотные остатки вблизи или внутри этих «карманов». Конституциональная изомерия клатрохелатного «гостя» влияет на интенсивности соответствующих полос КД при его связывании с данным белком–«хозяином». Этот тип изомерии также отвечает за преобладание данного оптически-активного конформера (Λ или Δ) макробициклического остова, который стабилизируется данным сайтом связывания этого белка. С использованием in vitro тест-системы на основе тетразолиевого красителя (МТТ) было также установлено, что конституциональная изомерия вышеупомянутых клатрохелатов железа(II) оказывает влияние на их цитотоксичность по отношению к клеточной линии промиелоцитарной лейкемии человека. Дикарбоксифенилсульфидные клеточные комплексы с неэквивалентными терминальными группами имеют значительно более низкую цитотоксичность, по сравнению с их клатрахелатными изомерами с эквивалентными реберными заместителями.