Аннотация результатов, полученных в 2015 году
Данная работа посвящена поиску ключевых клеточных микроРНК, участвующих в регуляции взаимодействий «вирус-хозяин» (для высокопатогенных вирусов гриппа H5N1 и вируса Эбола), и оценке эффективности использования этих микроРНК в качестве мишеней для противовирусной терапии. Методом обратной генетики были получены и охарактеризованы рекомбинантные вирусы гриппа А (ВГА) с полноразмерным и удаленным геном NS1. Вирусные штаммы были сконструированы на основе вакцинного штамма IVR-116, адаптированного к росту на культуре клеток Vero, и содержали гены НА и NA (6:2 реассортанты) от вируса гриппа А/курица Курган/5/05 (H5N1). В процессе клонирования в геномном фрагменте NS у одного из рекомбинантных штаммов генетическая последовательность, кодирующая белок NS1, была полностью удалена. В результате чего исходная последовательность NS фрагмента была укорочена, что, однако, не отражалось на способности данных вирусов образовывать мРНК белка NS2 (NEP). Полученные рекомбинантные штаммы были охарактеризованы по ростовым характеристикам на интерферон-дефектной (Vero) и интерферон-компетентной (MDCK) культурах клеток. Было показано, что рекомбинантный штамм, имеющий делецию открытой рамки считывания белка NS1, и, соответственно, не способный подавлять систему иммунного ответа хозяина, демонстрировал сниженные ростовые показатели в иммунокомпетентной системе. Прежде чем приступить к анализу клеточной экспрессии и поиску ключевых микроРНК, участвующих в клеточном ответе на вирусную инфекцию, необходимо выбрать и охарактеризовать клеточную модель этой инфекции. В связи с этим, провели выбор клеточных линий,на которых планируется дальнейшее исследование, и основных инфицирующих доз и сроков инфекции, на которых предполагается изучать экспрессию клеточных микроРНК (Даниленко и соавт, 2016). Также выбрали методы валидации этой модели (статья подготовлена в рамках текущего гранта РНФ и направлена в журнал Journal of Immunological Methods). Провели анализ литературы и базы данных miRBase по клеточным микроРНК, экспрессия которых меняется при заражении клеток вирусом гриппа. Литературный обзор по данному вопросу будет направлен в печать в начале 2016 года. Среди клеточных микроРНК – потенциальных мишеней для противовирусной терапии – можно выделить следующие: miR193, miR-709, miR-223, miR-21, miR-200a, miR-34, miR30a, Let-7, miR-491, miR-654, miR-7, miR-132, miR-146a, miR-187, miR-200c, miR-1275, miR-24, miR-30, miR-29, miR-125b, miR-192, miR-191 и miR-99b, miR-766. Вместе с тем, очевидно, что к настоящему времени, как мы и ожидали, нет четкого представления о том, какие именно клеточные микроРНК могут играть важную роль в регуляции взаимодействий «вирус-клетка» при ВГА инфекции, и, соответственно, могут быть рассмотрены в качестве объекта для противовирусной терапии. В связи с этим на следующем этапе работы будет проведена оценка экспрессии микроРНК в ответ на инфицирование клеток рекомбинантными вирусами гриппа H5N1 с полноценным и удаленным геном NS1 методами микрочипов и NGS. Только по результатам экспериментальной работы и сопоставления с данными литературы будут выбраны микроРНК для дальнейшей работы. Так как доставка малых РНК является одной из ключевых проблем терапии, основанной на использовании явления РНК-интерференции, в 2015 году также провели сравнение различных типов носителей для доставки двунитевых коротких интерферирующих РНК (киРНК) в клетки (Бондаренко и соавт., Петрова и соавт, 2015, Unksov уе al., 2015). Исследовали способность к комплексообразованию с киРНК ряда коммерческих производных хитозана, полиэтиленимина и Lipofectamine2000. По совокупности данных анализа для дальнейшей подробной оценки доставки киРНК в клетку были выбраны препараты модифицированного хитозана Q-348, обогащённого четвертичными аминогруппами (предоставлены «НИИ нефтехимического синтеза» им. А.В. Топчиева РАН). Они образовывали наиболее стабильные комплексы с киРНК в концентрациях, не токсичных для клеток. Для комплекса хитозана Q-348 с флуоресцентно меченой киРНК методами флуоресцентной и конфокальной микроскопии и лазерной проточной цитофлуориметрии достоверно показали эффективную и быструю доставку флуоресцентно меченых киРНК в различные типы клеток. По результатам проведенного анализа различных носителей в качестве основного носителя для доставки киРНК был выбран хитозан Q-348. Таким образом, на первом этапе исследования в 2015 году были выполнены все запланированные работы, необходимые для изучения на втором этапе профиля экспрессии клеточных микроРНК в ответ на инфицирование вирусом гриппа и выбора микроРНК, являющихся потенциальными мишенями для терапии гриппа.

Аннотация результатов, полученных в 2016 году
Данная работа посвящена поиску ключевых клеточных микроРНК, участвующих в регуляции взаимодействий «вирус-хозяин» для высокопатогенных вирусов гриппа А (ВГА) H5N1, и оценке эффективности использования этих микроРНК в качестве мишеней для противовирусной терапии. С использованием экспрессионных микрочипов Agilent а также методом высокопроизводительного секвенирования нового поколения – NGS (платформа MiSeq, “Illumina”, США) были получены профили экспрессии микроРНК для клеточной модели А549: контрольных незараженных клеток, и клеток, инфицированных рекомбинантными ВГА, полученными на первом этапе исследования, с полноразмерным геном NS1(далее full) и вирусом с делецией NS1 гена (далее delta). Проанализированные данные микрочипа выявили число аннотированных микроРНК транскриптов – 2006, 1247 из которых составляют зрелые микроРНК. После этого сигнал был проанализирован методом PCA, с помощью которого была обнаружена группировка образцов по биологическим условиям вдоль координаты PC1, общая картина свидетельствовала об удовлетворительной воспроизводимости эксперимента. Данные, полученные после секвенирования образцов микроРНК, были выравнены на геном человека. Процент уникально выравнивающихся последовательностей был менее 10% в каждом случае, хотя общий процент выравнивания составил 60–80%. Квантификация выравнивания позволила оценить процент прочтений, попадающих на микроРНК, который составил около 2–3% библиотеки (150–250 тыс. прочтений). Полученные после квантификации данные были использованы для расчета изменений в экспрессии (log2 отношения экспрессии) генов микроРНК в трех возможных сравнениях: вирус full к контролю, вирус delta к контролю и вирус full к вирусу delta. Полученные значения были сопоставлены с результатами после гибридизации библиотек микроРНК на микрочипе Agilent. Результаты свидетельствуют о низкой сходимости измерений – коэффициент корреляции для трех групп сравнений менялся в диапазоне от –0.06 до +0.10. Несмотря на трудности в количественном определении микроРНК, нужно отметить, что секвенирование позволило выделить несколько изменяющихся, при заражении ВГА микроРНК, индукция или супрессия которых описаны ранее в литературе (обзор Горшков и др., 2017), например miR-146a-5p, miR-141-3p, miR-221-3p, miR-21-5p, miR-98-5p, miR-15b-3p, miR-24-2-5p, miR-331-3p. Среди этих микроРНК было выявлено большое количество, вовлеченных в важнейшие сигнальные пути клетки, активируемые во время вирусной инфекции, такие как TGF-β, INF-kB, MAPK сигналинг и другие (Горшков и др., 2016). Многие выявленные клеточные микроРНК имеют опосредованное или прямое влияние на индукцию про-воспалительных цитокинов и хемокинов, обуславливая провирусное подавление иммунного ответа, или же активируя его в целях антивирусной защиты клетки. Для последующего изучения действия микроРНК на гены цитокинов, изменяющих свою экспрессию под действием рекомбинантных ВГА, была разработана и апробирована система количественной детекции мРНК цитокинов IL-1β, IL-2, IL-4, IL-6, IL-10, IL-12β, IL-18, IFN-γ и TNF-α человека с использованием мультиплексной ПЦР в режиме реального времени (Plotnikova et.al., 2016). Также из данных, полученных NGS, следовало, что значительная фракция полученных прочтений также выравнивается на ранее не описанные микроРНК с очень высоким покрытием в неаннотированной части генома. С фундаментальной точки зрения огромный интерес представляет поиск микроРНК, закодированных в геноме самого вируса гриппа А. Этот вопрос подробно рассматривается в нашем обзоре, характеризующем роль микроРНК в патогенезе ВГА (Горшков и др, 2017). В рамках данной работы мы остановились на исследовании последовательностей восьмого сегмента NS генома ВГА человека и свиньи (Vasin et.al., 2016), с целью выявления возможного шпилечного предшественника микроРНК. Были выявлены две области соответствующей вторичной структуры, в положениях 82-148 и 497-564, обладающие нехарактерной консервативностью первичной нуклеотидной последовательности, приводящей к несинонимическим заменам в первичной структуре белка, но сохраняющей шпилечную вторичную структуру вирусной (+)-РНК. В дальнейшем эти предсказанные микроРНК могут детектированы с помощью системы ПЦР в режиме реального времени. В результате сопоставления полученных экспериментальных и описанных ранее литературных данных было показано, что из всех охарактеризованных в результате NGS секвенирования микроРНК значимо различающихся по профилю для зараженных и незараженных клеток, только 127 имеют совпадения с опубликованными ан 2016 год источниками (модель исследования при этом не учитывалась). Для обеих моделей вирусной инфекции delta и full выявлено 72 микроРНК, профиль которых повышается, и 8, чей профиль снижается. Были отобраны специфические 6 микроРНК: miR-126-3p, miR-194-5p, miR-335-3p, miR-424-5p, профиль которых снижается только при заражении вирусом full; miR-6797-3p и miR-6797-5p, профиль наоборот которых снижается только при заражении вирусом delta. Учитывая ключевую роль белка NS1 во взаимодействиях вируса гриппа с инфицированной клеткой, эти микроРНК представляют собой перспективные мишени для последующих экспериментов по компенсаторной противовирусной микроРНК-терапии. Так как доставка малых РНК в клетку является одной из ключевых проблем терапии, основанной на использовании явления РНК-интерференции, в 2016 году были продолжены исследования поиска оптимальной системы доставки двунитевых коротких интерферирующих РНК (киРНК). Выбранная на предыдущем этапе работы поликатионная система доставки с помощью модифицрованного хитозана Q-348, обогащённый четвертичными аминогруппами («НИИ нефтехимического синтеза» им. А.В. Топчиева РАН) не продемонстрировала достаточной эффективности по доставке плазмидной ДНК. Также было показано неэффективное ингибирование целевого белка NP по механизму РНК-интерференции для доставки киРНК хитозаном Q-348 при заражении клеток А549 эталонным штаммом вируса ВГА человека A/PR/8/34. Таким образом, было принято решение выбрать и проанализировать еще одну систему доставки киРНК в клетки. В сотрудничестве с Первым Санкт-Петербургским государственный медицинским университетом им. акад. И. П. Павлова, RASA-центром Томского политехнического университета и RASA-центром Санкт-Петербургского политехнического университета им.Петра Великого были разработаны и исследованы в качестве носителей для противовирусных киРНК гибридные органические-SiO2 микрокапсулы. Данные капсулы, созданные по известной технологии (Сухоруков и др., 1998) и изучаемые в качестве транспортеров нуклеиновых кислот были модифицированы с добавлением полиаргинина и покрытием SiO2 для обеспечения длительной защиты сиРНК в капсуле при нахождении вне клетки, и более оптимального релиза внутри клеток. Были проведены тесты на токсичность и эффективность доставки киРНК, а также тесты на эффективность ингибирования белка NP ВГА для той же модельной системы in vitro, что и для поликатионных носителей ранее (А549), и дополнительно для MDCK. Для клеток предварительно трансфицированных микрокапсулами, содержащими сиРНК (0,1 мкМ - 5 мкМ), через 24 и 72 часа после заражения вирусом A/PR/8/34, было выявлено двукратное снижение титра вторичного потомства вируса по реакции гемагглютинации, а также снижение уровня белка NP более чем на 90%, по сравнению с контрольными инфицированными клетками. Был продемонстрирован доза-зависимый эффект на снижение вирусной репродукции и ингибирование целевого белка NP в клетках. В результате была выбрана оптимальная система доставки киРНК внутрь клетки, отвечающая всем требованиям емкости, нетоксичности и эффективности доставки, которая впоследствии будет использована в экспериментах по введению в клетки терапевтических малых РНК. Также были получены стабильные экспрессионные плазмиды, кодирующие рекомбинантные белки GP Эбола вируса: полноразмерный и не содержащий иммуносупрессивный домен для дальнейшей работы по проекту. Таким образом, на втором этапе исследования в 2016 году были выполнены все запланированные работы, необходимые для изучения влияния компенсаторной микроРНК-терапии на развитие вирусной инфекции in vitro, на третьем этапе работы в 2017 году.

Аннотация результатов, полученных в 2017 году
В 2017г. были успешно завершены исследования, направленные на создание эффективной системы для подавления репликации вируса гриппа А на основе механизма siРНК-интерференции. В составе созданной нами системы используется коктейль из трёх siРНК, специфически узнающих консервативные последовательности трёх ключевых вирусных генов: NS, PA, NP. В качестве средства доставки siРНК использованы эффективные и нетоксичные гибридные микроносители. Были получены консенсусные последовательности для трёх вирусных генов, и разработаны 11 новых siРНК к вирусным генам NS, PA и NP. Был проведён скрининг антивирусных свойств разработанных siРНК, с использованием Lipofectamine RNAiMAX (LFRNAiMAX) в качестве средства доставки siРНК. Клетки А549 были заражены эталонным вирусом штамма A/PR/8/34 (H1N1) через 4 часа после введения siРНК. Через 24ч после инфицирования, были проведены оценка уровня вирусного белка NP в клетках с помощью ИФА, и вирусного титра на основе РГА. Оказалось, что siРНК PA-1630, NP-717 и NS-777, отобранные для дальнейших исследований, обладают наиболее выраженной антивирусной способностью среди тестированных siРНК. PA-1630 снижает уровень внутриклеточного NP на 70%, NP-717 – на 60%, NS-777 – на 68%. Установлено, что органические микрокапсулы с поверхностной SiO2 – оболочкой, являются полыми, имеют округлую форму и диаметр около 2 мкм. При загрузке SiO2 - микрокапсул (SiO2 – МК) модельной siРНК (ROX-siРНК), siРНК локализуется и эффективно удерживается внутри капсул. Максимальная ёмкость загрузки SiO2 – МК составляет 6.4 пМ/мкл siРНК, значительно превосходя таковую для полиэтиленимина и хитозана. SiO2 – МК эффективно защищают siРНК от деградации. Это крайне важно для использования SiO2 – МК в качестве средств доставки siРНК в клетки. Через 24 ч инкубации с клетками капсулы локализуются в цитоплазме абсолютного большинства (до 92%) клеток, эффективность внутриклеточной доставки ROX-siРНК с помощью SiO2 – МК значительно превосходит эффективность доставки полиэтиленимином (на 70%), Lipofectamine 2000 (на 45%), Lipofectamine RNAiMAX (на 30%). SiO2 – МК не обнаруживают цитотоксического действия при концентрации до 10 капсул на клетку. На клеточной модели мезенхимальных стволовых клеток установлено, что МК ко-локализуются с маркерами эндосомального пути EEA1 (ранние эндосомы), Rab7 (поздние эндосомы), LAMP1 (лизосомы). Эндосомальный мембранный компартмент является важнейшим компонентом, определяющим внутриклеточную динамику МК и функциональность содержащихся в них РНК. Для оценки функциональности доставляемых в клетки с помощью МК РНК, в МК была загружена мРНК репортерного гена eGFP. Через 24 ч после трансфекции в мезенхимальные стволовые клетки, абсолютное большинство клеточной популяции экспрессирует eGFP. Это ясно свидетельствует о цитозольной доставке инкапсулированной РНК и о ее функциональности. Далее, мы провели сравнение ингибирования репликации вируса гриппа A/Puerto Rico/8/34 (H1N1) в клетках A549 при инкубации клеток в течение 24ч с SiO2 – МК, содержащими коктейль из трёх siРНК (PA-1630, NP-717 и NS-777) и при воздействии каждой из данных siРНК, инкапсулированных в SiO2 – МК. Уровень вирусного белка NP (по данным ИФА) достоверно снижался по сравнению с контролем во всех случаях, однако комбинированный сайленсинг трёх вирусных генов обладал существнно большей эффективностью, превосходя, в том числе, действие озельтамивира. Аналогичные результаты были получены при использовании другого метода оценки – ПЦР в режиме реального времени мРНК вирусного матриксного белка М1. Обработка клеток A549 комбинацией из трёх инкапсулированных siРНК вызывает сильный и специфический антивирусный эффект для вирусов гриппа А нескольких субтипов (H1N1, H5N2, H7N9), приводя к снижению титра вирусного потомства на 2-4 lg TCID50/мл. Таким образом, предлагаемая нами система для siРНК-терапии гриппа, основанная на гибридных микроносителях, содержащих коктейль из siРНК к консервативным областям трёх вирусных генов, является действенным и универсальным антивирусным инструментом. Вторым важнейшим направлением работы в 2017 году было исследование возможности использования компенсаторных микроРНК для противовирусной терапии гриппа in vitro. В результате проведённого профилирования клеточных микроРНК при вирусном заражении, был составлен список из 12 микроРНК - потенциальных мишеней для компенсаторной микроРНК-терапии гриппа in vitro. В ходе скрининга противовирусного потенциала выбранных микроРНК в клетках А549, через 24 часа после доставки микроРНК электропорацией, их заражали вирусом А/Kurgan/05_ full (H5N1) в дозе 300 TCID50/мл (0,04 moi) и через 24 часа после заражения оценивали титр вирусного потомства методом РГА и цитотоксическое действие по МТТ тесту. Данные РГА свидетельствуют о двукратном снижении вирусной репродукции для всех исследуемых микроРНК, кроме miR-16 и miR-29c, с максимальной эффективнстью для miR-615. МТТ тест показал, что только одна из тестируемых микроРНК - let-7a оказывает протективное действие на клетки А549, повышая процент выживших клеток до 80% по сравнению с 60% выживаемостью в инфекционном контроле. Далее мы провели ИФА-оценку противовирусного потенциала компенсаторных микроРНК, по снижению уровня NP в клетках A549 и культуральной среде, содержащей вирусное потомство. Через 72 часа после заражения вирусом А/Kurgan/05 (H5N1), наблюдается достоверное снижение уровня белка NP в клетках и культуральной среде после профилактического введения следующих микроРНК: let 7a, miR-16, miR-24. Почкование вирусного потомства ингибируется также miR-29c, miR-125b и miR-194. В итоге, для дальнейших экспериментов были отобраны 4 микроРНК: let-7a, miR-16, miR-24, miR-194. В данной части работы был использован эталонный вирус гриппа А подтипа Н1N1 A/Puerto Rico/8/34. Дополнительные копии 4х выбранных микроРНК доставляли в виде комбинации с помощью гибридных SiO2-микрокапсул, за 24 часа до заражения. Отмечено достоверное снижение вирусного белка NP в клетках, через 72 часа после заражения вирусом A/Puerto Rico/8/34 в дозе 6000 TCID50/ml (0,01 moi) на 90% относительно инфекционного контроля. Мы выполнили трансфекции ранее полученных экспрессионных плазмид, содержащих полноразмерный ген GP вируса Эбола и ген GP с делетированным иммуносупрессивным доменом в несколько клеточных линий (HeLa, A549, HepG2). Оказалось, что экспрессия данного белка высокотоксична для клеток, вызывая массовую гибель клеточных популяций, что делает невозможной ранее предполагавшуюся нами оценку цитокинового профиля клеток, экспрессирующих различные варианты GP. Таким образом, мы успешно использовали малые интерферирующие РНК для эффективного подавления репродукции вируса гриппа А in vitro. Мы продемонстрировали противовирусное действие специфических siРНК, направленных на консервативные участки вирусных генов, при их доставке в целевые клетки гибридными микрокапсулами. Были определены ключевые микроРНК для компенсаторной терапии. Высокоэффективное ингибирование репликации вируса было достигнуто при использовании синтетических аналогов микроРНК, доставляемых гибридными микрокапсулами, компенсирующих сниженный уровень клеточных микроРНК при заражении.