Аннотация результатов, полученных в 2015 году
Был разработан короткий высокоселективный синтез (-) - erogorgiaene и его C11-эпимера. Ключевые стадииуправления стерехимической направленности включают каталитическую асимметричемкое кротлтрование, анионую Окси-Коуп перегрупировку и катионную циклизацию. Установленно, что (-) - Erogorgiaene показывает перспективную противотуберкулезную активность против штаммов M. tuberculosis с множественной лекарственной устойчивостью.

Аннотация результатов, полученных в 2016 году
С целью получения аналогов эргорджина, а также наработки вещества в граммовых количествах были предложены и апробированы несколько путей синтеза необходимых молекул, исходя из коммерчески доступных дешевых природных терпенов. Все из предложенных методов возможно осуществить в асимметрическом варианте. Для осуществления поставленной задачи нами последовательно был апробирован каждый из методов. При масштабировании синтеза эргорджина было обнаружено несколько проблем незаметных в миллиграммовых количествах, которые были успешно решены и реализованы в синтезе трех граммов эргорджина. Был синтезирован ряд аналогов эргорджина предложенным ранее методом. В Результате проделанной работы были синтезированы соединения: a) норпроизводные эргорджина, для изучения влияния наличия или отсутствия метильных групп на активность соединений; b) более гидрофильные аналоги для улучшения растворимости производных эргорджина; c) гетероциклические аналоги эргорджина. Еще один подход к оптимизации структуры эргорджина с целью повышения его гидрофильных свойств заключался в комбинировании его структуры с соединениями используемыми для лечения туберкулеза с множественной лекарственной устойчивостью или их аналогами. Одним из таких перспективных соединений из которого легко получаются водорастворимые соли является линезолид. Для реализации поставленной цели была изучена и оптимизирована азо-еновая циклизация. Также были отработаны методы дезаминирования получаемых соединений двумя методами. Все синтезированные аналоги эргорджина были переданы на биологический скрининг. Было отработанно несколько подходов для изучения механизма действия эргорджина на микобактерии. В частности было установленно, что наряду с активизацией систем антиоксидантной защиты (sodA, katG), общего стрессорного ответа (rpoS) и множественной антибиотикотолерантности (mar, cadA, micF, ldcС) как ответ на воздействие эргорджина в субингибитороной концентрации зарегистрировано значительное подавление spoТ, продукт которого, ppGpp, является ключевым регулятором персистообразования. Было установлено, что исследуемое соединение сам по себе не обладает редокс-циклирующими свойствами и не способен генерировать активные формы кислорода. Однако его воздействие на обменные процессы микроорганизмов сопровождается формированием неспецифического окислительного стресса, вызывающего защитную реакцию бактериальных клеток в виде возрастания уровня экспрессии антиоксидантных генов. Ранее такая реакция описана для представителей бактерицидных антибиотиков. Обнаруженное нами достоверно значимое снижение уровня экспрессии гена spoТ при воздействии эргорджина на клетки E. coli послужили основанием для предварительного предположения о том, что данный ген мог бы играть роль мишени воздействия исследуемого вещества. В последнее время продукт данного гена, гуанозин тетрафосфат (ppGpp), рассматривается как одна из наиболее важных малых регуляторных молекул, участвующих в механизме формирования персисторного состояния в клетках микроорганизмов, в том числе микобактерий. Исходя из этого, нами была поставлена задача создания генетических конструкций, включая репортерные генные слияния и нокаутные мутации в гене spoT, для более подробного изучения его роли в адаптации бактерий к антибиотикам. На первом этапе с нами сконструирован мутант Escherichia coli, который несет делеции в двух генах: relA, кодирующем ppGpp-синтетазу, и spoT, продуктом которого является ppGpp синтетаза/гидролаза. Полученный нокаутный ppGpp0-мутант демонстрировал штаммоспецифичные фенотипические признаки: неспособность к росту на минеральной среде и склонность к образованию удлиненных форм клеток на богатой среде в экспоненциальной фазе роста. Результаты измерения уровня персистообразования на богатой среде выявили снижение частоты персистенции в нокаутном штамме в стационарной фазе. Таким образом, подтверждена вовлеченность генов, чьи продукты ответственны за образование ppGpp, в процесс персистообразования. Было установлено, что эргорджин оказывает бактерицидное действие на клетки M. smegmatis независимо от стадии периодической культуры. Он способен также вызывать гибель покоящихся форм микобактерий, обладающих высокой степенью толерантности по отношению к антибиотикам, традиционно используемым в лечении микобактериальных инфекций. Кроме того, в сублетальных концентрациях эргорджин препятствует образованию биопленок микобактериями, что указывает на его возможную роль как блокатора межклеточных взаимодействий по типу Quorum Sensing. Более подробно см. https://www.gazeta.ru/science/2016/07/29_a_9718169.shtml

Аннотация результатов, полученных в 2017 году
В результате выполнения проекта в 2017 году были синтезированы модифицированные аналоги эргорджина. При разработке методов синтеза необходимых веществ было создано несколько методологий органического синтеза, которые могут быть использованы для построения других молекул, обладающих полезными свойствами, не только в области биологически активных веществ, но новых материалов, красителей и др. Прежде всего к таким методам можно отнести полностью отработанные синтетические методологий, для которых изучены оптимальные условия и границы возможного применения: 1) Метод окислительного декарбонилирования альдегидов, позволяющий удалить из соединения альдегидную группу. 2) Метод каталитической дегидратации амидов карбоновых кислот, позволяющий в мягких условиях с минимальным количеством побочных продуктов получать нитрилы из амидов. Изучено влияние синтезированных веществ на различные штаммы возбудителя туберкулеза. Выявлено истинно действующее вещество и установлен механизм его противомикобактериального действия, согласно которому переход клеток в стационарную фазу сопровождается появлением в них мишени воздействия для данного вещества на белок, который в нормальных условиях синтезирует вторичный мессенджер. Невозможность белка синтезировать вторичный месенджер при воздействии на него исследуемого вещества создает условия для гибели бактериальных клеток вследствие непроизводительных затрат энергии на продолжающиеся биосинтетические процессы в условиях, когда рост и размножение невозможны (стационарная фаза). При этом нарушается также процесс образования персисторных клеток, что в конечном итоге приводит к гибели всей популяции бактерий. Следовательно, в перспективе использование препаратов, созданных на базе нашего вещества в комплексе с другими антибиотиками, создаст условия для радикального лечения хроничеких туберкулезных инфекций и предотвращения рецидивов заболевания. В процессе выполнения направления, связанного с изучением механизмов действия эргорджина и его аналогов, а также установлением мишени его воздействия в клетках микобактерий, разработан ряд методологических подходов, которые могут быть использованы для решения аналогичных или смежных проблем в области фундаментальной и медицинской микробиологии. К таким решениям можно отнести следующие: 1. Генетическое конструирование сверэкспрессионной плазимды, имеющей вставку гена необходимого гена, продуцирующего белок, ответственный за продукцию в клетках вторичного мессенджера. Сконструированная плазмида может быть использована для эффективного поиска и скрининга соединений, которые независимо от их химической структуры, обладают максимальной активностью для подавления активности обнаруженного белка. В этом случае микроорганизм - трансформант, сверхэкспрессирующий белок-мишень для определенного антибиотика, проявляет повышенную устойчивость к нему за счет комплементарного связывания молекул антибиотика с многочисленными копиями сверэкспрессированного белка-мишени и, как результат, инактивации антибиотика. 2. Сконструированный нами штамм E. coli, трансформированный плазмидой в хромосому которого включено репортерное генное слияние, экспрессия которого зависит от активности изучаемого белка, потенциально может быть использована для скрининга соединений, подавляющих активность данного белка. Если соединение обладает такой активностью, то при его воздействии на клетку уровень экспрессии индикаторного гена будет снижаться, что можно наблюдать в онлайн режиме. 3. Разработка UV-HPLC метода определения адениловых нуклеотидов. Одним из признаков, характеризующих переход микобактерий в персисторное состояние, является резкое падение энергетических параметров клеток в виде снижения содержания в них уровня макроэргических соединений, прежде всего АТФ. В ходе выполнения проекта нами разработан удобный UV-HPLC метод определения адениловых нуклеотидов с технологией их экстракции применительно к микобактериям, обладающим клеточной оболочкой, трудно поддающейся разрушению.