Аннотация результатов, полученных в 2014 году
Сформирована междисциплинарная международная команда ученых и привлеченных консультантов-специалистов по эпигенетическим исследованиям. Научная группа включает в себя эпидемиолога окружающей среды, изучающего влияние химических веществ на репродуктивное здоровье, эпидемиолога, являющегося экспертом в области геномики и эпигеномики сперматозоидов, репродуктивного эндокринолога, токсиколога-биолога, и молекулярных биологов-генетиков. Для учета препубертатной экспозиции была выбрана экспозиция самым токсичным конгенером группы диоксинов – 2,3,7,8 ТХДД. Из 117 участников, когорты 516 мужчин, проживающих в городе Чапаевск, Самарской области и собравших образцы семени, была сформирована субкогорта, включающая 109 молодых мужчин с информацией о препубертатной экспозицией 2,3,7,8 ТХДД. Вся субкогорта (n=109) была разделена на 3 квантили с низкой препубертатной экспозицией (0,35-2,2 пг\г), со средней экспозицией (2,3-3,9 пг\г) и высокой экспозицией (4,0-12,1 пг\г). Концентрация сперматозоидов в образцах семени различалась в зависимости от препубертатной экспозиции. Высокая экспозиция сопровождалась снижением концентрации сперматозоидов и более высокой распространенностью низкой концентрации (ниже 20 млн/мл), рисунки 1, 3. Результаты влияния препубертатной экспозиции 2,3,7,8-ТХДД на снижение концентрации сперматозоидов среди субпопуляции одного города в проспективном 11-летнем исследовании получены впервые в мире и являются отличной основой для выявления сопутствующих эпигенетических изменений, как маркеров воздействия химических веществ, в частности, диоксинов. Была отработана методика бисульфитной конвертации ДНК на образцах крови и спермы человека (7 образцов). Был выбран протокол с использованием Kit: EZ DNA Methylation-Lightnin Kit (Zymo Research, #D5030). Анализ результатов с помощью ПЦР и секвенирования показал воспроизводимость и высокую специфичность данной методики. Количество и качество конвертированной ДНК позволяют проводить последующее приготовление библиотек и глубокое секвенирование. Была отработана методика иммунопреципитации хроматина для образцов семени с использованием H3K4Me3 антител. Количество выделенного ДНК позволяет проводить последующее приготовление библиотек и глубокое секвенирование. Были созданы фрагментные библиотеки для глубокого секвенирования геномов на основе образца ДНК полученного с помощью ChIP и H3K4Me3 антитела для секвенирования с использованием платформ Иллюмина HiSeq 2000. Была также разработана альтернативная методика для приготовления библиотеки, которая работает с одноцепочечной ДНК, полученной при бисульфитной конвертации. Реагенты для изготовления библиотеки были заказаны. Для пробного секвенирования были использованы фракции фрагментов геномной ДНК. Отработана методика эксперимента с лабораторными Вистар крысами, включающая следующие методики: размножения; бесстрессовой экспозиции крыс СОЗ в период беременности и лактации; эвтаназии, предотвращающей возникновение изменений тканей животных под воздействием стресса; роста и развития потомства крыс; анатомирования и сбора биологических образцов, а именно тканей печени, мозга, абдоминальной, подкожной и бурой жировой ткани, мышечной ткани, яичек, гипофиза, плазмы крови и лейкоцитов крови. Собраны, заморожены в жидком азоте или зафиксированы в формалине и хранятся в 70% этаноле биологические образцы самок Вистар крыс и их потомства. На основании анализа литературы подобраны методики для сбора и консервации эпидидимальной спермы, и оценки качества сперматогенеза на основе гомогената яичек. Подготовлены обзоры литературы для запланированных статей, которые планируется опубликовать в 2015 году: «Epigenetic reprograming by dioxins», «Interaction between Aryl Hydrocarbon Receptor and Circadian system with an emphasis on reproduction», «Endocrine disrupting chemicals and epigentic changes in sperms». 7 декабря 2014г был проведен международный семинар на английском языке "Токсикология, Эпигенетика и Репродукция" в рамках двухдневной конференции "Геномика и Эпигеномика", проводимой на средства грантов РНФ, полученные ИОГен. На семинаре участниками международной научной группы и приглашенными лекторами было представлено 7 докладов. В мероприятии приняло участие 16 российских и 11 зарубежных ученых, а также 19 российских молодых ученых. Также в день проведения семинара была проведена школа для молодых ученых с образовательными лекциями на русском языке по геномике и эпигеномике.

Аннотация результатов, полученных в 2015 году
Используя данные эпидемиологического когортного исследования в Чапаевске, которое является «родительским» для текущего исследования, впервые в мире получены результаты, демонстрирующие выраженную отрицательную связь сравнительно малых уровней хронической экспозиции диоксинами на раннем периоде жизни с ухудшением качества семени 10 лет спустя в восемнадцатилетнем возрасте. Диоксины являются стойкими химическими веществами, нарушающими работу эндокринной системы (endocrine disrupting chemicals, ХВНРЭС), распространение которых в окружающей среде остается актуальным, особенно в городах Российской Федерации с развитым автотранспортом и в городах с хлорной промышленностью, а также в тех местах, где имеются или планируется строительство мусоросжигательных заводов. Набранная и ежегодно отслеживаемая когорта является уникальной в мире, с учетом строгого лонгитудинального дизайна, высокого индекса отклика среди участников исследования, индивидуальной серии биологических образцов, накопленных с 8 до 20 лет, в которых можно изучать биологические маркеры, как экспозиции, так и изменений эпигенома, а также гормональные маркеры. По данной находке, которая потребовала 12 лет лонгитудинального наблюдения, подготовлена публикация, которая будет подана в JAMA в конце декабря 2015 г. с указанием финансирования РНФ. Также полученные результаты были активно представлены на шести международных конференциях в 2015 году. В частности, на одной из двух ведущих конференций по химическим веществам, нарушающим работу эндокринной системы (ХВНРЭС), поданный абстракт был выбран для устного доклада (8th Copenhagen Workshop on Endocrine Disrupters, Denmark). На международной конференции Российской Ассоциации Репродукции Человека (РАРЧ) доклад о предикторах качества семени, включая экспозицию диоксинами, был отмечен как лучший доклад в сессии «Мужское бесплодие». Результаты также были доложены на конференциях репродуктивных и эндокринологических обществ, в частности, Американского общества репродуктивной медицины, Балтимор, США и Европейского общества детских эндокринологов, Барселона, Испания. В 2015 году в Чапаевске продолжалось рекрутирование молодых мужчин 18-19 лет для сбора образцов семени и лейкоцитов с целью увеличения количества субкогорты. К августу 2015 года удалось получить образцы от 183 мужчин (46% возможных участников, удовлетворяющих критериям для приглашения), в том числе тех, кто уже отслужил в армии и вернулся, по сравнению со 108 мужчинами (27%) на момент написания заявки на исследование в мае 2014 года и 134 мужчинами (34%) на момент начала 2015 года. После многочисленных экспериментов разработаны, валидизированы и с июня 2015 гг внедрены в лаборатории Чапаевска протоколы для фракционирования свежей и размороженной спермы в градиенте плотности коммерческих сред «Isolate», Irvine Scientific. Этот метод позволяет изучать эпигеном двух групп сперматозоидов различной зрелости и протеом семенной плазмы (Jenkins et al., 2015). Разработан и внедрен протокол изолирования ДНК из размороженных образцов сперматозоидов. Протокол описан и будет подан в качестве публикации в «Проблемы репродукции» декабре 2015 г. Выделена ДНК из различных слоев сперматозоидов 51 участника субкогорты с суммарным количеством, описанным в детальной таблице (Таблица 3) Впервые изучена экспозиция 16 конгенерами БДЭ в России, оцененная по сыворотке 51 мальчика 10-11 лет, собранной в 2005-2007 гг. Обнаружено, что только 11 образцов из 51 (22%) имели значения выше предела обнаружения. Максимальное значение концентрации ПДЭ-47 составило 353 пг/г липидов, что существенно ниже (более чем в 100 раз) медианного значения 46900 пг/г липидов среди семилетних девочек в американском когортном исследовании CHAMACOS (Bradman et al., 2012). Завершен токсикологический эксперимент с лабораторными крысами. Подготовлен банк высококачественных биологических образцов, включающий хорошо аннотированные образцы сперматозоидов и широкий спектр соматических тканей, собранных на различных стадиях развития крыс: эпидидимальные сперматозоиды, мозг, печень, гипофиз, абдоминальный жир, подкожный жир, бурая жировая ткань, плазма крови, лейкоциты крови, мышечная ткань, яички. У экспонированных крыс вес яичек достоверно изменен на 120 постнатальный день по сравнению с весом яичек контрольных животных. Другие показатели общего и репродуктивного здоровья (ано-генитальная дистанция, содержание глюкозы в крови после 2-х часового голодания, вес, температура тела, и подвижность эпидидимальных сперматозоидов) не были изменены. Образцы спермы были собраны из каудальной части эпидидимуса с использованием протокола, разработанного в лаборатории Др. Пилзнера. Данный протокол позволяет существенно повысить эффективность изоляции ДНК спермы с одновременной очисткой от соматических клеток. Для оптимизация этого метода и оценки качества выделения ДНК из спермы для последующего анализа метилирования, был проведен гено-специфичный анализ метиляции локуса Н19, импринтируемого по отцовской линии. Обнаруженный высокий уровень метилирования локуса Н19 (близкий к 100%) свидетельствует что наши методы позволяют выделять высококачественную ДНК эпидидимальных сперматозоидов, очищенную от ДНК соматических клеток, и потому пригодную для анализа метилирования. Был оптимизирован метод для анализа профиля изменения метилирования ДНК с использованием RRBS-seq метода. Этот метод дает разрешение до уровня 1 нуклеотид и таким образом открывает возможность для анализа уровня метилирования в подавляющем большинстве промоторов и CpG-островков. RRBS предполагает использование рестриктаз, в особенности Msp1, для расщепления геномной ДНК в ЦЦГГ участках для обогащения ЦпГ динуклеотидами с ГЦ-богатыми локусами. Этот подход дает смещение в сторону увеличения доли фрагментов соответствующих ЦпГ островкам и не позволяет регистрировать значительную долю изменений метилирования других участков ДНК, например энхансеров, расположенных вне ЦпГ. Чтобы предотвратить сдвиг в сторону ЦпГ островков и зарегистрировать больше данных из других участков ДНК, мы использовали двойное энзиматическое расщепление ДНК с помощью Msp1 а также Taqα1. Taqα1 распознает и расщепляет геномную ДНК в ТЦГА последовательностях. Образцы спермы, обработанные двумя энзимами, демонстрируют сдвиг в размере библиотеки между 200 - 300 нуклеотидами и увеличение выхода метилированной ДНК в среднем на 9%. RRBS был далее оптимизирован для использования со 100 нг очищенной геномной ДНК с NuGEN Ovation RRBS Methyl-Seq System. Использование названной системы позволяет избежать проблемы низкого разнообразия нуклеотидов в RRBS. благодаря использованию адапторов со случайным набором нуклеотидов в начале каждого фрагмента. Это снимает необходимость в использовании PhiX, и дает увеличение количества фрагментов, которые могут быть получены в каждом сиквенировании. Оценка качества библиотек была произведена с испльзованием Tapestation High Sensitivity Screen Tape (Agilent). Мы также оптимизировали биоинформатический анализ данных RRBS. Испльзуемый нами кит, помимо баркодов, включает N6 последовательности, позволяющие удалять PCR повторы. Из-за этого програмное обеспечение Illumina не способно автоматически демултиплексировать данные. Поэтому на первом этапе анализа мы конвертируем необработанные результаты секвенирования (bcl файлы) в fastq файлы с помощью bcl2fastq программы, установленной на нашем сервере. Затем оцениваем качество данных и удаляем адаптерные последовательности с помощью fastx toolkit с последующим удалением последовательностей разнообразия программой NuGEN python script. Очищенные fastq файлы используются для сопоставления со стандартным геномом программой Bismark, разработанной для сопоставления бисульфит-конвертированной ДНК. После сопоставления мы обрабатываем полученные sam файлы программой NuDup (NuGEN) для удаления PCR повторов. Наконец, bam фаилы с удаленными повторами анализируются Bismark Methylation Extractor для определения дифференциально метилированных последовательностей. Мы также используем Gene Set Enrichment Analysis (GSEA) для анализа функциональных групп генов, участвующих в сперматогенезе и DAVID Bioinformatics Resources 6.7 для определения кластеров дифференциально метилированных групп генов. Опубликован обзор «Environmental Susceptibility of the Sperm Epigenome During Windows of Male Germ Cell Development» и ряд работ, впервые в мире демонстрирующих выраженную отрицательную связь сравнительно малых уровней хронической экспозиции диоксинами на раннем периоде жизни с ухудшением качества семени 10 лет спустя в восемнадцатилетнем возрасте у российских мужчин, проживающих в городе Чапаевск, Самарская область («Association of Prepubertal Serum Dioxin Concentrations with Semen Quality in a Prospective Cohort of Young Russian Men»; «Prepubertal and Pubertal Predictors of Semen Quality in a Prospective Cohort Study of Russian Young Men: Focus on Endocrine-Disrupting Chemicals»). В лонгитудинальном исследовании изучены и опубликованы другие предикторы качества семени («From Prepuberty to Adulthood: Semen Quality and Its Predictors in a Prospective Cohort Study of Russian Young Men»; «Предикторы качества спермы российских мужчин: проспективное исследование от препубертата до молодого возраста» Два семинара с элементами школы молодых ученых "ENDOCRINE DISRUPTING CHEMICALS, EPIGENETICS AND REPRODUCTION" (51 участник) и "ENVIRONMENTAL EPIDEMIOLOGY AND TOXICOLOGY: FOCUS ON EPIGENETICS" (35 участников) были проведены в Москве. В целом, осмыслена концепция новой науки «Эпигенетическая эпидемиология» (Michels, 2010, Michels, 2012, Waterland and Michels, 2007), позволяющая изучать роль эпигенетических изменений в развитии заболеваний, и раскрывающая механизмы связи изменения эпигенома с факторами экспозиции и появлением неблагоприятных изменений здоровья, в частности, ухудшения репродуктивных показателей. Эпигенетическая эпидемиология имеет особое значение в изучении влияния химических веществ, нарушающих работу эндокринной системы (ХВНРЭС, endocrine disrupting chemicals). Лонгитудинальный дизайн когортного исследования со сбором индивидуальных биологических образцов в течение времени для изучения как биологических маркеров экспозиции, эпигенетических маркеров, так и маркеров эффекта воздействия, в частности гормональных, является наиболее сильным инструментом новой науки. Разработана стратегия дальнейшего наблюдения за когортой российских мужчин (Приложение 9).

Аннотация результатов, полученных в 2016 году
В отчетном 2016 году удалось реализовать все запланированные задачи. Все результаты получены впервые в мире. Полногеномное секвенирование 8 образцов сперматозоидов. Проведено парноконцевое полногеномное бисульфитное секвенирование и проведен биоинформатический анализ 8 образцов сперматозоидов, собранных в 18 лет, по 4 из групп максимальной и минимальной перипубертатной (в 8-9 лет) экспозиции ТХДД. Изучены полногеномные профили метилирования с целью выявления последовательностей ДНК, дифференциально метилированных (дифференциально метилированные регионы, ДМР) в зависимости от перипубертатной экспозиции. Библиотеки для WGBS были приготовлены с использованием 100-150 нг ДНК и TruSeq DNA кита для метилирования (Illumina) согласно инструкции от производителя. Контроль качества библиотек был произведен с помощью Bioanalyzer (Agilent). Качественные библиотеки были отсеквенированы на HiSeq 2500 (Illumina) со средним количеством ридов на образец 216 млн. Первичные данные, выровненные данные и данные для анализа хранятся на сервере ИОГен. Примерное значение среднего покрытия было равным- 4х (используя значение размера генома человека в 2.7 гигабаз). Полученные профили метилирования имели требуемую тканеспецифичность. Оценка уровня метилирования генома в CpG контексте (табл. 9) совпадает с ранее опубликованными данными (70-75%) для человеческих сперматозоидов (Jenkins et al., 2014; Molaro et al., 2011). После выравнивания на референсный геном GRCh38 с использованием Bismark (версия 0.16.1) (Krueger and Andrews, 2011) и bowtie-2 (версия 2.2.9) (Langmead and Salzberg, 2012), согласно рекомендациям ENCODE (ENCODE, 2011), мы ограничили весь последующий анализ использованием CpG только с покрытием 10 и выше. Подготовка библиотек и RRBS образцов сперматозоидов и лейкоцитов для RRBS Подготовка и секвенирование RRBS библиотек человека проводилось в лаборатории эволюционной геномики НИИ ФХБ имени А.Н. Белозерского МГУ после подписания Договора о сотрудничестве между ИОГен и НИИ ФХБ имени А.Н. Белозерского МГУ. С учетом того, что после фракционирования размороженного после хранения семени в градиенте плотности выход сперматозоидов в «нижний» слой снизился, для большинства образцов были подготовлены библиотеки из преимущественно верхнего слоя, состоявшего из сперматозоидов меньшей плотности. Для пробоподготовки библиотек были использованы следующие наборы реагентов: Ovation® RRBS Methyl-Seq System 1–16 (NuGeN, USA) и EZ DNA Methylation-Lightning™ Kit (ZymoResearch, USA). Пробоподготовку проводили согласно инструкциям производителя. Для очистки применялись гранулы Agencourt AMPure XP (Beckman Coulter, USA). Контроль качества библиотек проводили тремя методами. На основании данных контроля качества были отобраны библиотеки для последующего секвенирования (Приложение 3). Секвенирование библиотек проводилось на приборе HiSeq2000 согласно инструкциям производителя, в два этапа, в июле 2016 и сентябре 2016 года. Секвенирование проводилось одноконцевым прогоном, совмещённым с индексным, длина основного чтения при запуске Hi-Seq 2000 в июле - 46 нуклеотидов, в сентябре – 57 нуклеотидов, длина индексного чтения – 12 нуклеотидов. Всего было секвенировано 87 библиотек, из них 46 - лейкоцитов, 41 – сперматозоидов. Первичные данные, выровненные данные и данные для анализа хранятся на сервере ИОГен. Для изучения гетерогенности метилома в разных фракциях сперматозоидов в одном эякуляте - для 3 мужчин были подготовлены и секвенированы библиотеки из двух слоев фракционирования сперматозоидов. Для одного мужчины были приготовлены две библиотеки из одного слоя для оценки воспроизводимости результатов анализа метилома. Анализ ДМР в зависимости от перипубертатной экспозиции диоксинами по данным WGBS в сперматозоидах и по данным RRBS в сперматозоидах и лейкоцитах Для идентификации ДМР между образцами с высокой и низкой препубертатной экспозицией, мы использовали DMAP (Stockwell et al., 2014), использующую алгоритм на базе скользящего окна для детекции ДМР, который сравнивает дисперсию в метилировании у коротких контигов между группами образцов. Только статистически значимые образцы с изменением в уровне метилирования минимум в 10% между группами с высокой и низкой экспозицией TCDD считались биологически значимыми и были использованы для дальнейшего анализа. Помимо этого, ДМР, содержащие C/T полиморфизы, были удалены из последующего анализа для исключения потенциальной возможности конфаундинга результатов метилирования по статусу генотипа. Количество ДМР в сперматозоидах человека, ассоциированных с перипубертатной экспозицией TCDD в возрасте 8-9 лет, по результатам анализа данных WGBS, представлено в таблице 10. Всего было выявлено 446 ДМР в теле гена с изменением уровня метилирования >=10%. Таблица 11 показывает результаты анализа представленности функциональных групп генов (Functional enrichment analysis) списка генов, ассоциированных с найденными ДМР в сперматозоидах мужчин с перипубертатной экспозицией ТХДД в 8-9-летнем возрасте. По найденным находкам готовится публикация “Peripubertal dioxin concentrations and subsequent sperm methylome profiles of Russian young adults”. После получения данных RRBS образцов сперматозоидов и лейкоцитов субкогорта, состоящая из 51 участника, была разделена на тертили в зависимости от уровня перипубертатной экспозиции, и был произведен поиск ДМР в группах максимальной и минимальной экспозиции. Нами были обнаружены 5 и 4 статистически значимых ДМР (q < 0.05; > 10% разница в метилировании), находящихся в теле генов сперматозоидов и лейкоцитов, соответственно, ассоциированных с экспозицией ТХДД. Табл. 13 и 14 показывают гены (и их функции), ассоциированные с ДМР, имеющих разницу уровней метилирования больше 10% для сперматозоидов и лейкоцитов, соответственно. Один из 5 ДМР в сперматозоидах, MIR3681HG, ассоциирован с некодирующей РНК (нкРНК). Рис. 10 и 11 показывают статистически значимые ДМР похромосомно для сперматозоидов и лейкоцитов, соответственно. В промоторах, с другой стороны, не было найдено статистически значимых ДМР. Кроме того, не было обнаружено пересечения между ДМР в сперматозоидах и лейкоцитах. Была подтверждена гипотеза о связи препубертатной экспозиции диоксинами с измененным профилем метилирования. При анализе пересечения ДМР, ассоциированных с генами, при разной экспозиции, которые бы выявлялись и в сперматозоидах, и в лейкоцитах, а также двумя методами, RRBS и WGBS, были обнаружены 2 гена, общих для WGBS и RRBS сперматозоидов, EYA2, RASSF2 (таблица 15) и 1 ген, общий для WGBS сперматозоидов и RRBS лейкоцитов, THBS2 (таблица 16). Гены, ассоциированные с этими районами, являются функционально интересными. Ген EYA2 вовлечен в репарацию ДНК, участвует в дефосфорилировании H2AX, а также вовлечен в регуляцию процессов развития. Ген RASSF2 является потенциальным онкосупрессором и вовлечен в апоптоз и арест клеточного цикла. Анализ ДМР в зависимости от качества семени по данным RRBS в сперматозоидах и лейкоцитах Предварительные результаты анализа включают в себя 30 статистически значимых (q < 0.05) ДМР, ассоциированных с количеством сперматозоидов. Однако, большинство статистически значимых ДМР имели разницу в уровнях метилирования меньше 10% между группами, разделенными по количеству подвижных сперматозоидов. Табл. 17 показывает гены (и их функции), ассоциированные с 6-ю статистически значимыми ДМР с разницей в уровнях метилирования больше 10%. Интересно, что два из 6 ДМР, BVES-AS1, LOC101929268, ассоциированы с малой некодирующей РНК (мнкРНК), которые являются высокоэкспрессируемыми в семенниках. Рис. 13 представляет собой Manhattan plot, на котором видно, что статистически значимые ДМР расположены на хромосомах 1, 3, 8, 10-12, 17, 19, 20 и X. Прицельный поиск ДМР при экспозиции диоксинами мужчин Произведен прицельный биоинформатический анализ данных, полученных с помощью WGBS в 8 образцах сперматозоидов (4 – с максимальной перипубертатной экспозицией ТХДД и 4 – с минимальной экспозицией) по списку генов, приведенному в таблице 5, включая гены, играющие ключевую роль в процессах, связанных с «диоксиновым», арилгидрокарбоновым рецептором (AhR), гены трансформации ксенобиотиков (CYP1A1, CYP1A2, CYP1B1) а также по гену андрогенового рецептора (AR) и генов, вовлеченных в сигнальную систему AR (таблица 6). Метилированные регионы в теле искомых генов и их промоторных областей не превысили порог в 5% разницы в метилировании между группами по всем искомым генам, за исключением генов F9 и ODC1. Представляется интересной находка ДМР в теле гена NR3C1 (5.1), гена глюкокортикоидного рецептора, гена, полиморфизм которого, наряду с геном ESR1 (эстрогеновый рецептор α), был обнаружен нами среди участников той же Чапаевской когорты, как значимый модификатор влияния перипубертатной экспозиции диоксинами на возраст появления признаков полового развития (Humblet et al., 2013). С помощью WGBS также был обнаружен значимо дифференциально-метилированный участок в районе гена LIN28b. Известно, что данный ген ассоциирован с возрастом наступления менархе и с конечным ростом по данным GWAS (Perry et al., 2014). Приготовление библиотек, секвенирование 36 образцов крыс, перинатально экспонированных BDE-47 Подготовка и секвенирование RRBS библиотек крыс проводилось в Университете Массачусетса, Амхерст, после заключения контракта между ИОГен и Университетом Массачусетса. 36 образцов тканей крыс были секвенированы с помощью RRBS: 12 образцов спермы, собранных на день PND65, 12 образцов спермы, собранных на день PND120 (Robb et al., 1978, Zanato et al., 1994), и 12 образцов печени, собранных на день PND120. Коллектив использовал одинаковые методики для пробоподготовки, приготовления библиотек, секвенирования и биоинформатического анализа образцов человека и крыс, что является специальной задачей исследования и его сильной стороной. Затем был применен тот же подход по поиску ДМР, что и в случае с образцами мужчин. Отдельно был проведен поиск ДМР для сперматозоидов и для лейкоцитов. ДМР с покрытием меньше 10 хотя бы в одной из групп (контрольная или эскпонированная) были отфильтрованы для соответствования требованиям ENCODE (ENCODE, 2011). Анализ ДМР в сперматозоидах у крыс, перинатально экспонированных BDE-47 по данным RRBS. Список генов со статистически значимыми ДМР, имеющими разницу в уровнях метилирования 20% и выше, и находящимися в теле гена или в промоторных частях генов (-1000 н - +500 н от сайта старта транскрипции), был определен для каждой из временных точек, на 65-й и 120-й постнатальный дни. В таблице 18 указано общее количество генов. Всего было найдено ДМР в теле 442 и 375 генов, на 65-й и 120-й постнатальный дни, соответственно, при этом количество генов, ассоциированных с ДМР, общих для двух периодов развития было около 10% (рис. 4). Затем был применен функциональный анализ с использованием биоинформатической базы DAVID (Huangda et al., 2009). Для установления общих механизмов, затронутых в обоих временных точках, мы использовали Ingenuity Pathway Analysis (IPA) и списки генов, ассоциированных с ДМР на каждой из временных точек, для реконструирования молекулярных сетей, которые могли быть подвержены влиянию от экспозиции (IPA, 2014, Kramer et al., 2014). По найденным ДМР, найденных в сперматозоидах в разные периоды онтогенеза при перинатальной экспозиции крыс BDE-47, готовится публикация. Анализ ДМР в печени у крыс, перинатально экспонированных BDE-47 по данным RRBS. В результате анализа в образцах печени крыс, подвергавшихся воздействию BDE-47 перинатально, был найден 621 ген, содержащий ДМР в теле гена с разницей в уровнях метилирования 20% и выше, и 71 ген, содержащий ДМР в промоторном регионе с разницей в уровнях метилирования 20% и выше. Был применен функциональный анализ с использованием DAVID для классификация найденных изменений. Одинаковые ДМР в сперматозоидах на 65-й и 120-й постнатальные дни и в печени крыс. Семь генов были ассоциированы со значимыми ДМР во всех трех наборах данных, сперматозоидах на 65-й и 120-й постнатальные дни и печени: Dapk2, Erich3, Hsd11b1, Kif13a, Polr1b, Popdc2, Sufu. Функциональная аннотация этих генов показана в табл. 21. Данные гены отвечают за базовые механизмы развития и регуляции основных клеточных функций. Эти гены могут быть использованы как потенциальные кандидаты в биомаркеры для детекции репрограммирования тканей в процессе развития из-за воздействия агентов окружающей среды. Понимание роли эпигенетической регуляции этих генов в сперматозоидах на ранних этапах эмбрионального развития является важной целью будущих исследований. Нами также проведено RNA-seq ткани семенников крыс, экспонированных BDE-47, с помощью NextSeq500 sequencing system (Illumina, San-Diego, CA). Образцы РНК, изолированные из ткани семенников со значениями > 9 были использованы для подготовки библиотек. Набор RS-122-2101-TruSeq® Stranded mRNA LT – SetA (Illumina, San-Diego, CA) был использован для изолирования poly(A)+ РНК из 4 г. общей РНК и конструирования цепь-специфичных библиотек. Было выявлено нарушение транскриптома, выражающееся в супрессии генов, вовлеченных в сперматогенез и активации генов, вовлеченных в иммунный ответ. Также нами было показано, что перинатальное воздействие BDE-47 приводит к долгосрочным изменениям в гистон-протаминном обмене в сперматогенезе, что приводит к увеличению ретенции гистонов и увеличению размера головок сперматозоидов. Используя данные эпидемиологического когортного исследования в Чапаевске, которое является «родительским» для текущего исследования, впервые в мире получены результаты, демонстрирующие выраженную отрицательную связь сравнительно малого уровня свинца крови (более 5 мкг\дл) в 8-9 лет с ухудшением качества семени 10 лет спустя в восемнадцатилетнем возрасте (Minguez-Alarcon et al., 2016a). Свинец, как токсичный металл, может обладать как прямым гаметотоксичным эффектом, так и опосредованным, через нарушения регуляции гормональной системы и через эпигенетические механизмы репрограммирования. Было проведено гормональное исследование семенной плазмы молодых мужчин, собранных после внедрения протокола многоцелевого фракционирования свежего семени в лабораториях Чапаевска и после проведения фракционирования размороженного семени. Проведено определение 7 гормонов (тестостерон, эстрадиол, ЛГ, ФСГ, пролактин, ДГЭА-С, ТТГ) в 93 образцах семенной плазмы. Всего в период с июня 2015 года реализовано 55 многоцелевых фракционирований свежего семени от 31 участника когорты. Проведено два международных семинара. Первый "GENETIC AND EPIGENETIC MARKERS OF ENVIRONMENTAL EXPOSURE был организован в Москве 24 мая 2016. На семинаре с элементами школы молодых ученых были представлены лекции и последние неопубликованные достижения в области эпигенетических маркеров экспозиции химическими веществами. 9 сентября 2016 года в рамках XXVI Международной Конференции РАРЧ (7-10 сентября 2016), посвященной 30-летию ЭКО в России был организован Международный симпозиум “ФАКТОРЫ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ И РЕПРОДУКТИВНАЯ ФУНКЦИЯ», на который приглашались все специалисты в обрасти репродуктологии, посещавшие этот представительный форум в 1200+ участников. В текущем году исследование было широко представлено на пяти международных конференциях, а также на двух Всероссийских конференциях с международным участием. Во всех докладах было указано на получение финансовой поддержки от РНФ.