Аннотация результатов, полученных в 2014 году
Отлажена методика синтеза чистых и допированных атомами металлов магнитных железосодержащих наночастиц на основе микроволнового синтеза. Высокодисперсные чистые и допированные атомами металлов магнитные наночастицы магнетита получали по реакции В. С. Элмора с использованием технологии микроволнового синтеза. Для усиления магнитных свойств полученных наночастиц проведены эксперименты по частичному замещению трехвалентного железа редкоземельными элементами (в концентрации не более 10%), в частности, европием (Eu) и самарием (Sm). Проведен тестовый синтез чистых и допированных редкоземельными элементами (европий (Eu) и самарий (Sm)) магнитных железо-содержащих наночастиц на основе Fe3O4. Проведена лабораторная диагностика распределения по размеру, атомной и электронной структур, морфологии чистых и допированных атомами металлов магнитных железосодержащих наночастиц. Изучено влияние чистых и допированных атомами металлов магнитных железо-содержащих наночастиц на рост и цитологические характеристики культур опухолевых и немалигнизированных, в частности, иммунокомпетентных, клеток in vitro, а также на рост ксенографтов некоторых опухолей человека. Проведено изучение влияния на рост опухолей in vivo наночастиц меди, железа и цинка, а также наночастиц магнетита и проведен сравнительный анализ их эффектов и эффектов допированных атомами металлов магнитных железосодержащих наночастиц. Изучен противоопухолевый эффект наночастиц некоторых биогенных металлов - меди, железа и цинка. В экспериментах на клеточных культурах К562, Х653, HeLa были показаны выраженные дистрофические изменения опухолевых клеток, повышение гибели малигнизированных клеток путем апоптоза и некроза при инкубации с наночастицами (НЧ) железа и цинка. При этом немалигнизированнные клетки (лимфоциты) сохраняли жизнеспособность. Проведено исследование токсических эффектов чистых и допированных атомами металлов магнитных железосодержащих наночастиц в сравнении с влиянием наночастиц магнетита и некоторых переходных биогенных металлов. У мышей без опухолей после введения исследованных наночастиц изменения в органах иммунной системы были минимальными, токсического действия на них не установлено, при исследовании крови и костного мозга также не было отмечено выраженных изменений иммунологических показателей. Получена информация об эффективных режимах использования наночастиц магнетита и меди у самцов и самок крыс и мышей с опухолями различных гистотипов и различной кинетикой роста. Проведен сравнительный анализ токсичности новых и ранее исследованных наноматериалов и выявлены безопасные для экспериментальных животных дозы допированных атомами металлов магнитных железосодержащих наночастиц.

Аннотация результатов, полученных в 2015 году
В рамках проекта за 2015 год проводились исследования по направлениям – разработка методик синтеза и получение широкого спектра наночастиц различного размера, состава, структуры и морфологии, и определение фундаментальных закономерностей их взаимодействия с опухолевыми тканями при модуляции активности регуляторных систем организма, с помощью методов активационной терапии. Разработаны методики синтеза и получены чистые и допированные атомами металлов магнитные железосодержащих наночастицы различного состава, размера и структуры. Варьирование методик синтеза позволяет получить наночастицы различного размера и формы. Частицы наименьшего размера (4,5 нм) получали модифицированным соосаждением в микроволновой печи с добавлением наночастиц золота в качестве затравки. Частицы наибольшего размера (30 нм) получались варьированием классического метода соосаждения. Микроволновым синтезом получали частицы размером 6-17 нм. Использование микроволнового полиольного синтеза в основном приводило к образованию сферических частиц. Сольвотермальный синтез с использованием 2,2'-бипиридина в качестве стабилизатора позволяет получить наностицы в виде игл, а модифицированный метод соосаждения с ультразвуковой обработкой реакционной смеси в процессе синтез - наночастицы в виде пластинок. Полученные наночастицы характеризовались разной степенью агломерированности. Наименее агрегированные частицы получались в случае микроволнового синтеза в системе олеиламин/олеиновая кислота. Установлено влияние природы и состава органического растворителя, а также условий микроволнового синтеза на средний размер, размерное распределение и степень агломерации частиц. Проведена лабораторная диагностика распределения по размеру, атомной и электронной структур, а также морфологии допированных атомами металлов магнитных железосодержащих наночастиц различного состава, размера и структуры. Определены типы образующихся оксидов железа. Для этого синтезированные материалы исследовали различными экспериментальными методиками. Варьирование методик синтеза позволяет получить как магнетит, так и маггемит или смесь этих оксидов. Только микроволновой синтез в глицерине при температурах до 275º С приводил к образованию α-Fe2O3. Поверхностный слой, состоящий из маггемита (γ-Fe2O3), составляет относительно небольшую долю по сравнению с фазой магнетита, для чистых наночастиц (~30 нм) составляет ~0.9 нм, а для допированных самарием наночастиц (~10 нм) составляет ~0.3 нм. Проведены измерения спектров XANES и EXAFS для образцов допированных атомами металлов магнитных железосодержащих наночастиц различного состава, размера и структуры. Анализ спектров поглощения позволил определить структуру, параметры локальной атомной структуры, степень окисления железа и редкоземельных элементов в допированных магнитных наночастицах, положение ионов допирующих элементов в структуре магнитных наночастиц. Исследован процесс окисления наночастиц в виде наноразмерных порошков и коллоидных растворов. Определены магнитные характеристики (намагниченность, магнитный момент) наночастиц с помощью вибрационного магнитометра и данным рентгеновского магнитного кругового дихроизма (XMCD). Синтезированные чистые и допированные редкоземельными элементами магнитные наночастицы показывают в основном суперпарамагнитное поведение. Установлено, что допирование наночастиц редкоземельными элементами в небольшом количестве позволяет улучшить их магнитные характеристики. Установлено, что допирование наночастиц редкоземельными элементами в небольшом количестве позволяет уменьшить средний размер наночастиц, получить узкое распределение по размерам, повысить стойкость к окислению. Разработаны методики и проведен тестовый синтез функционализированных наночастиц для рентгеновской фотодинамической терапии. Проведены эксперименты по оценке потенциала наночастиц со свойствами рентгенофотосенсибилизаторов для рентгеновской фотодинамической терапии. Проведены биологические исследования чистых и допированных атомами металлов магнитных железосодержащих наночастиц различного состава, размера и структуры. Инкубация человеческой крови с допированными наночастицами металлов не оказывает повреждающего действия на мембранные рецепторы, характеризующие иммунофенотип лимфоцитов, не вызывает усиления их апоптотической и некротической гибели. При этом недопированные НЧ магнетита, по-видимому, могут влиять на ранние этапы активации Т-лимфоцитов основных субпопуляций, вызывая выраженное угнетение экспрессии CD38 на CD3+CD4+ клетках и незначительную стимуляцию экспрессии маркеров CD69 и CD25 преимущественно на CD3+CD8+ клетках. Допирование НЧ магнетита европием, но не самарием, предотвращает их проапоптогенное действие на моноциты крови, возможно, вследствие модуляции фагоцитарной активности последних. Несмотря на различие использованных доз в 100 раз, не отмечено дозо-зависимого эффекта ни на один из исследованных параметров. В целом полученные данные предполагают, что допирование НЧ магнетита, особенно европием, делает их более инертными по отношению к иммунокомпетентным клеткам доноров. При микроскопии фильтров диффузионных камер, вживленных животным, содержавших фрагменты опухолей легких человека, было отмечено, что под влиянием магнитных железосодержащих НЧ происходит повышение числа клеток с дистрофическими изменениями после введения НЧ железа на 20-30% по сравнению с контролем. У крыс без опухолей и животных-опухоленосителей показано отсутствие токсического влияния исследованных наночастиц при их использовании в "большой" дозе (разовая доза - 17.7 мг/кг, соответствующая ей суммарная доза – 106 мг/кг). Гистологическое и гистохимическое исследование печени, легких, почек, надпочечников, органов иммунной системы (тимус, селезенка), а также тканей зоны введения не выявило выраженных признаков структурно-функционального повреждения клеток и надклеточных образований. При перитуморальном введении НЧ магнетита структурные нарушения в клетках мышечной ткани были отмечены только непосредственно в местах введения. В соседних с ними мышечных волокнах не наблюдали какие-либо признаки структурных нарушений. В случае наличия опухолей изменения внутренних органов исследованных животных коррелировали с выраженностью противоопухолевого эффекта и отражали антистрессорное влияние изучавшихся нанофакторов, особенно отчетливо проявившееся в микрокартине органов иммунной системы. В случая неэффективности воздействий не было выявлено заметных отличий от микрокартины органов у крыс-опухоленосителей контрольной группы. Перитуморальное введение «больших» доз НЧ магнетита и допированных самарием НЧ магнетита крысам с лимфосаркомой Плисса приводило к нормализации исследованных показателей эндогенной интоксикации у большинства опытных животных. Это выражалось в увеличении общей и эффективной концентрации альбумина, и в снижении уровня молекул средней массы, отражающих уровень накопления токсических лиганодв. Эффекты НЧ магнетита в «большой» дозе различались у крыс с лимфосаркомой Плисса, крыс с саркомой 45 и мышей линии С57 Black с меланомой В 16. У крыс с лимфосаркомой Полисса была отмечена полная и частичная регрессия опухоли в 20-50% случаев. В случае саркомы 45 эффект проявлялся в торможении (до 3 раз) роста и регрессии опухолей (полной или частичной) более чем у половины животных (до 80 %). У мышей противоопухолевый эффект наблюдался в 40-80% случаев. Он выражался в торможении роста опухоли на 75-78% и/или в увеличении продолжительности жизни с момента визуализации опухоли до 1.5 и более раз. Случаев выраженной регрессии меланомы В 16 не наблюдалось. При этом у мышей было отмечено весьма значительное варьирование выраженности эффекта в разных экспериментах, выяснение причин которого требует дополнительного изучения. У крыс применение НЧ магнетита в «малой» дозе (разовая доза 1.25 мг/кг) оказывало более выраженный эффект, чем использование этих нанофакторов в обычной дозе (разовая доза 17.7 мг/кг). Это выразилось в увеличении на треть числа животных, у которых была отмечена регрессия опухоли, а также в увеличению числа случаев полной регрессии опухоли в 2 раза. В случае применение НЧ меди в "малой" дозе наибольший противоопухолевый эффект был получен при интратуморальном введении. В отличие от НЧ меди, при использовании НЧ магнетита, допированных самарием, в "малой" дозе наибольший эффект был отмечен при внутрибрюшинном введении. Следующим по эффективности было интратуморальное введение, способствовавшее, в свою очередь, более выраженному противоопухолевому влияние по сравнению с результатом, полученным при перитуморальном введении допированных НЧ магнетита. В то же время использование НЧ магнетита без допирования, вводившихся перитуморально, приводило к результату, сходному с эффектом внутрибрюшинного введения допированных НЧ. Вопрос о соотношении противоопухолевой эффективности допированных и не допированных НЧ магнетита на данном этапе не выяснен и нуждается в дополнительном изучении, поскольку весь имеется различие в дисперсности суспензий допированных и не допированных НЧ, которое должно быть нивелировано в ходе дальнейших исследований. При перитуморальном введении наночастиц магнетита, как допированных самарием, так и без допирования, дополнительное применение активационной магнитотерапии у крыс способствовало увеличению на 20-33% числа животных, у которых была отмечена регрессия опухоли, а также в увеличении числа случаев выраженной регрессии опухолей до 2 раз. Это было сопоставимо с эффектами модифицированной цАМФ химиотерапии развившихся опухолей с использованием цитостатика циклофосфана. У мышей линии С57 Black c меланомой В 16 дополнительное общее магнитное воздействие увеличивало продолжительности жизни 40% животных в 2 раза и более при достоверном увеличении продолжительности жизни в целом по группе в 1.5 раза. В экспериментах на животных во всех случаях наблюдалась четкая корреляция противоопухолевого действия исследованных НЧ с их системным антистрессорным влиянием, оценивавшимся с помощью гематологических показателей и морфо-функциональных характеристик состояния органов иммунной системы. Информационные ресурсы по проекту в сети Интернет на русском языке: http://smartmaterials.ml/ru/research/grants/rnf/ на английском языке: http://smartmaterials.ml/research/grants/rnf/

Аннотация результатов, полученных в 2016 году
Модифицированным методом соосаждения с использованием микроволнового излучения были получены магнитные частицы оксида железа со структурой шпинели, допированные ионами редкоземельных элементов Sm3+, Gd3+, Eu3+. Средний размер наночастиц составил 15 нм. Магнитные частицы, допированные атомами золота, были получены в растворе олеиламин-олеиновая кислота сольвотермальным и микроволновым методами. Использование микроволнового метода позволило значительно уменьшить время реакции, а также получить сферические неагрегированные частицы со средним размером 5 нм. Были синтезированы материалы для рентгеновской фотодинамической терапии. Микроволновым методом синтеза были получены LaF3:Eu3+, LaF3:Sm3+, LaF3:Gd3+ частицы, а также указанные частицы, покрытые оболочкой LaF3. В качестве потенциального материала для рентгеновской фотодинамической терапии также были получены частицы магнетита полиольным синтезом. Была разработана методика тестирования эффективности генерирования синглетного кислорода под воздействием рентгеновского излучения и собрана экспериментальная установка. Было установлено, что наиболее перспективные материал для проведения рентгеновской фотодинамической терапии – это LaF3:Gd3, покрытый оболочкой LaF3. Для наиболее перспективных лантаносодержаших материалов на основе анализа спектров рентгеновского поглощения XANES и EXAFS были определены особенности локальной атомной и электронной структуры, проведена диагностика распределения по размерам, и установлена морфология образцов. В рамках проекта за 2016 год медико-биологические исследования были посвящены в первую очередь определению и преодолению биологических барьеров, препятствующих клиническому применению нативных, допированных и инкапсулированных наночастиц биогенных металлов и наночастиц для рентгеновской фотодинамической терапии. Необходимость таргетирования не столько первичной опухоли, сколько метастазов (в реальной клинической практике) определяет требование строго внутривенного введения наночастиц с обеспечением как можно более длительной их циркуляции в крови. Однако такой способ введения наночастиц, даже при использовании наиболее эффективных инкапсуляционных агентов, ограничивается взаимодействием наночастиц с иммунными клетками, и в первую очередь – с макрофагами. Ретикуло-эндотелиальная система (РЭС) макрофагов легкого, селезенки и печени эффективно удаляет из кровотока любые наночастицы, размер которых не позволяет им выводиться через почки. В литературе имеются данные о том, что из-за этого биобарьера 95% наносистем, вводимых в кровь, отфильтровываются почками или захватываются РЭС, и не достигают целевых тканей. Для преодоления этого биологического барьера существуют три основных подхода: “маскировка” наночастиц с помощью капсул различного типа; предварительное направленное уничтожение макрофагов ретикуло-эндотелиальной системы; временная инактивация макрофагов ретикуло-эндотелиальной системы. В рамках настоящего проекта использовались два подхода – первый и последний, так как уничтожение макрофагов для достижения терапевтического эффекта является неэффективной и опасной для пациента (или модельного животного) стратегией. Для стабилизации и «маскировки» наночастиц применялось хитозановое покрытие, позволяющее одновременно и стабилизировать частицы в растворе, и повысить время их циркуляции в кровотоке. Однако, как показали гистологические исследования по анализу распределения хитозан-инкапсулированных наночастиц железа в тканях животных-носителей опухолей, при введения таких наночастиц в кровь, несмотря на их покрытие, макрофаги эффективно аккумулируют их и делают биологически недоступными. В связи с наблюдаемым характером распределения наночастиц в клетках и тканях, нами далее была применена технология инактивации макрофагов РЭС. Для этого животным до введения наночастиц проводилась инъекция DSO4 500. Хотя по литературным данным это соединение эффективно в отношении клеток Купфера, нами было показано, что воздействие в указанном режиме позволяет заблокировать РЭС во всем организме животного-носителя опухоли так, что наночастицы распределялись по различным тканям и захватывались клетками этих тканей. Токсических эффектов тестированных наночастиц не наблюдалось ни в одной из тканей, что соответствовало стратегии проекта в 2016 году, заключающейся в отборе для тестирования физиологически неактивных до индукции физическими методами наночастиц. Таким образом, в результате исследования удалось добиться отключения РЭС и сделать наночастицы железа биодоступными. Однако эффективность применения наночастиц после преодоления этого биологического барьера определяется возможностью концентрирования наночастиц в первичных опухолях и метастазах. Достигнуть концентрирования наночастиц в опухоли можно двумя основными путями: подбором размера наночастиц таким образом, чтобы наночастицы задерживались в опухоли благодаря так называемому эффекту усиленного проникновения и удержания (EPR); и путем функционализации нанокапсул для таргетирования специфических для опухолей элементов поверхности клеток. Наночастицы, тестируемые на животных в рамках проекта в 2016 году выбирались именно с учетом возможности использования эффекта EPR, а для таргетирования были выбраны маркеры клеточной поверхности раковых клеток для последующих исследований. Однако как показали результаты гистологического анализа, желаемого эффекта за счет EPR достичь оказалось невозможно, что, впрочем, согласуется с некоторыми литературными данными. Объяснение этому заключается в том, что аномальная ангиогенная сигнализация опухолей приводит к формированию сосудов, во многом препятствующих проникновению через них в ткани наночастиц. В связи с этим в рамках проекта было необходимо разработать технологию низкоинтенсивного системного воздействия, позволяющего нормализовать сосудистую систему опухолей. Для этой цели на животных с уже сформировавшимися крупными ксенографтными опухолями использовалось соединение SU5416. Результаты исследования показали, что в группе животных, получавших SU5416, по сравнению с контрольной группой количество сосудов капсулы статистически значимо снижалось, количество сосудов в паренхиме опухоли повышалось, и снижалась площадь апоптотической/некротической зоны опухоли. Немаловажным дополнительным результатом этого исследования явился факт достаточно быстрой реорганизации сосудистой сети – столь значительные изменения ангиогенного статуса опухолей были достигнуты всего за 2 недели воздействия на животных-опухоленосителей. Последней крупной биологической проблемой, препятствующих прямому применению наночастиц биогенных металлов переменной валентности была разница в адаптивном потенциале опухолевых и нормальных клеток. Даже несмотря на активное таргетирование с помощью антител, аптамеров или лигандов, добиться концентрирования наночастиц исключительно в опухоли, вероятно, будет невозможно. В связи с этим для снижения побочных эффектов терапии необходима разработка соответствующей технологии защиты нормальных тканей. В данном случае эффективным решением является применение концепции предподготовки организма. Соответствующая целям исследования технология предподготовки организма была разработана на основе низкоинтенсивного системного воздействия редокс-циклическим прооксидантом терт-бутилгидрохиноном (tBHQ). Подобная технология уже применяется при классической химиотерапии и в модельных исследованиях в качестве универсального метода клинической предподготовки организма. Цитотоксический тест показал, что терт-бутилгидрохинон, несмотря на мощную индукцию продукции АФК, не вызывает снижения жизнеспособности клеток in vitro (благодаря индукции защитных клеточных каскадов), и in vivo токсических эффектов при гистологическом исследовании тканей животных после введения tBHQ также выявлено не было. Отдельной группой задач проекта в 2016 году было тестирование in vivo наночастиц для рентгеновской фотодинамической терапии. Тестирование этих частиц требовало использования таких же подходов предподготовки организма и блокировки РЭС, как и при работе с наночастицами биогенных металлов. Наночастицы для РФДТ вводились предподготовленным животным-опухоленосителям, которые через 24 часа подвергались воздействию рентген-излучения. Хотя in vitro наиболее эффективные с точки зрения генерации синглетного кислорода частицы продемонстрировали достаточные для тестирования in vivo показатели, выраженного токсического влияния их in vivo выявлено не было, что, по-видимому, связано с проблемой недостаточного концентрирования наночастиц в опухоли. Таким образом, в результате исследований по проекту в 2016 году была разработана комплексная многоступенчатая технология преодоления самых выраженных биологических барьеров, препятствующих применению наночастиц биогенных металлов в клинической практике, а также была разработана и апробирована система воздействия на животных для целей рентген-фотодинамической терапии.