Аннотация результатов, полученных в 2014 году
Научные работы, проведенные в 2014 году, носят междисциплинарный характер и включают исследования по следующим направлениям: - ХИМИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ включают экспериментальное изучение процесса открытой нами новой реакции пиранозид-фуранозидной перегруппировки, влияния на её эффективность реакционных условий, разработку препаративных методов её проведения, а также синтез конкретных целевых углеводных производных, отвечающих фрагментам полисахаридных антигенов опасных патогенов рода Aspergillus и Enterococcus, необходимых для выполнения других частей проекта, включая получение функционализированных гликоконъюгатов для биологических исследований и олигосахаридных моделей для спектрального и конформационного анализа. - ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ – спектральный (ЯМР) и теоретический (in silico моделирование) конформационный анализ синтезированных нами фуранозидсодержащих соединений. Теоретические исследование ключевых стадий пиранозид-фуранозидной перегруппировки с помощью квантово-химических расчетов ab initio, в том числе расчётов энергий активации лимитирующей стадии процесса перегруппировки, на примерах широкой серии модельных соединений. - СТРУКТУРНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ – анализ всех синтезированных олигосахаридных производных с помощью аналитических и спектральных методов для подтверждения их строения, а также установление структуры дигетерогликана из Enterococcus. - ГЛИКОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ – исследование биологической активности синтезированных фуранозидсодержащих производных, в том числе их распознавания углеводсвязывающими белками (антитела, лизоцим). С использованием экспериментальных (химических) и теоретических (расчетных) методов была изучена реакционная способность широкой группы пиранозидных субстратов в условиях пиранозид-фуранозидной перегруппировки. Показано влияние размера скелета пиранозида, аномерной конфигурации и наличия заместителя при О-2 на эффективность указанного химического процесса. Выясненные закономерности подтверждены результатами теоретических расчётов ab initio Полученные результаты суммированы в статье, опубликованной в высокорейтинговом (IF 5.7)специализированном журнале [1] (см. ниже). Учитывая приоритетность данной работы, ей посвящен рисунок на обложке журнала. Впервые синтезированы гетеросахариды, отвечающие структуре фрагментов галактоманнана клеточной стенки опасного микопатогена Aspergillus fumigatus. Данные соединения различаются типом гликозидной связи между галактозными и маннозными звеньями [(1→3)- или (1→6)], представленными в составе галактоманнана. Получение указанных соединений включает пиранозид-фуранозидню перегруппировку и последующую регионаправленную функционализацию фуранозидного продукта. Разработанная синтетическая схема существенно эффективнее, чем изучавшиеся ранее в зарубежных лабораториях подходы к получению олигогалактофуранозидов, родственных фрагментам галактоманнана, что в итоге и позволило синтезировать столь сложные пентасахариды. Полученные результаты суммированы в статье, опубликованной в специализированном международном журнале, а вторая статья направлена для опубликования в рейтинговом журнале Organic & Biomolecular Chemistry (RCS) (см. ниже статьи [2] и [5]). Исходя из синтезированных спейсерированных гетеросахаридов, структурно родственных фрагментам галактоманнана микопатогена Aspergillus fumigatus, были синтезированы поливалентные неогликоконъюгаты с бычьим сывороточным альбумином (БСА) и моновалентные с биотином. Данные гликоконъюгаты в настоящее время используются в качестве иммуногенов для иммунизации лабораторных мышей, а также в качестве покрывающих антигенов для анализа углеводной специфичности иммуноглобулинов методом иммуноферментного анализа и поверхностного плазмонного резонанса (SPR от Surface Plasmon Resonance). Впервые синтезированы моно- и дисахаридные производные, отвечающие фрагментам дигетерогликана из бактерий рода Enterococcus, а также дисахаридные блоки для сборки на следующем этапе проекта более длинных цепей, отвечающих олигомерам повторяющегося звена дигетерогликана. Полученные уже в 2014 году соединения использованы в качестве моделей при установлении строения дигетерогликана, а также при изучении углеводной специфичности антител, опсонизирующих бактерии Enterococcus faecalis. Полученные результаты рассмотрены в двух статьях, в высокорейтинговом (IF 5.7) специализированном журнале (см. ниже статьи [1] и [3]). Методами молекулярной динамики с использованием экспериментов по ядерным эффектам Оверхаузера (ЯМР-ЯЭО) проведён конформационный анализ полученных галактофуранозидов. Выявлено существенное влияние конфигурации остатка молочной кислотой на конформационное состояние исследуемых соединений. Полученные закономерности позволили на основании спектральных данных установить неизвестную ранее R-конфигурацию молочной кислоты в природном дигетероглюкане из бактерий рода Enterococcus. Сделанный вывод подтверждён и данными деструктивного анализа дигетерогликана. Полученные результаты рассмотрены в статье в высокорейтинговом (IF 5.7) специализированном журнале (см. ниже статью [3]). Впервые синтезирован спейсерированный петаглюкозид, родственный фрагменту α-(1→3)-глюкана клеточной стенки Aspergillus fumigatus, а также его конъюгаты с биотином и белком-носителем БСА. Данные соединения использованы в качестве иммуногена при иммунизации лабораторных мышей и в качестве покрывающих антигенов для анализа углеводной специфичности образующихся иммуноглобулинов. Полученные результаты суммированы в статье, опубликованной в высокорейтинговом (IF 5.7) специализированном журнале (см. ниже статью [4]). Учитывая приоритетность данной работы, ей посвящен рисунок на обложке журнала, а также редакционная статья об авторах и значимости выполненной работы. [1] V.B. Krylov, D.A. Argunov, D.Z. Vinnitskiy, S.A. Verkhnyatskaya, A.G. Gerbst, N.E. Ustyuzhanina, A.S. Dmitrenok, J. Huebner, O. Holst, H.-C. Siebert, N.E. Nifantiev, “Pyranoside-into-Furanoside Rearrangement: New Reaction in Carbohydrate Chemistry and Its Application in Oligosaccharide Synthesis”, Chem. Eur. J., 2014, 20, 16516-16522. Учитывая приоритетность данной работы, ей посвящен рисунок на обложке журнала. [2] V.B. Krylov, D.A. Argunov, N.E. Nifantiev “Preparative synthesis of selectively substituted 1,6-anhydro-α-D-galactofuranose derivatives”, Mendeleev Commun. 2014, 24, 336-337. [3] V.B. Krylov, A.G. Gerbst, D.A. Argunov, A.S. Dmitrenok, A.S. Shashkov, Z. Kaczynski, J. Huebner, O. Holst, N.E. Nifantiev “Definitive Structural Assessment of Enterococcal Diheteroglycan”, Chem. Eur. J., (2015) doi: 10.1002/chem.201405857. [4] B.S. Komarova, M.V. Orekhova, Y.E. Tsvetkov, R. Beau, V. Aimanianda, J.P. Latgé, N.E. Nifantiev “Synthesis of a Pentasaccharide and Neoglycoconjugates Related to Fungal α-(1→3)-Glucan and Their Use in the Generation of Antibodies to Trace Aspergillus fumigatus Cell Wall.” Chem. Eur. J. doi: 10.1002/chem.201404770. Учитывая приоритетность данной работы, ей посвящен рисунок на обложке журнала, а также редакционная статья об авторах и значимости выполненной работы. Кроме этого одна отправлена в редакцию рейтингового специализированного журнала Королевского химического общества (Великобритания) Organic & Biomolecular Chemistry: [5] D.A. Argunov, V.B. Krylov, N.E. Nifantiev “Convergent synthesis of isomeric heterosaccharides related to the fragments of galactomannan from Aspergillus fumigatus”.

Аннотация результатов, полученных в 2015 году
В рамках данного проекта осуществляется комплексное исследование, включающее изучение новой реакции в химии углеводов – пиранозид-фуранозидной перегруппировки, а также междисциплинарное исследование синтезируемых с её помощью фуранозилсодержащих олигосахаридов, отвечающих фрагментам полисахаридных антигенов клинически важных патогенов, в том числе Aspergillus fumigatus, Klebsiella pneumoniae, Enterococcus faecalis и других. Ввиду междисциплинарности данного проекта работы проводятся одновременно в области химических, физико-химических, спектральных и биологических исследований. Ниже по направлениям рассмотрены основные достижения, полученные в 2015 году. ХИМИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Было продолжено экспериментальное изучение пиранозид-фуранозидной перегруппировки с привлечением широкой серии пиранозидных субстратов, в частности, было исследовано влияние природы агликона, защитных групп при О-3 и С-5, конфигураций асимметрических центров на эффективность протекания перегруппировки. В результате проделанной работы были определены рамки применимости и ограничения данной реакции и четко сформулированы требования к структуре субстрата, необходимые для эффективного осуществления изучаемой реакции. Данные исследования позволили существенно расширить область использования данной реакции для субстратов, содержащих заместители с различными функциональными группами. В частности, было показано, что 4-пентенильный заместитель в аномерном положении позволяет эффективно осуществлять изучаемую перегруппировку, а на следующих стадиях 4-пентенил может быть использован в качестве легко уходящей группы при проведении реакции гликозилирования. Данный метод позволяет получать фуранозил-доноры напрямую из пиранозидов и существенно упростить синтетические схемы. Также была разработана препаративная методика пиранозид-фуранозидной перегруппировки на субстратах, содержащих в аномерном положении предшественник спейсерной группы. Разработанные на данном этапе препаративные подходы существенно облегчили получение соединений, необходимых для выполнения спектральных и гликобиологических частей данного проекта. Так, с использованием описанной выше реакции были получены олигосахаридные структуры, отвечающих фрагментам полисахаридных антигенов. В частности, были синтезированы (1) гетеросахариды, отвечающие эпитопному участку галактоманнана A. fumigatus, (2) ди- и тетрасахариды, отвечающие О-антигену липополисахарида (ЛПС) K. pneumoniae, (3) олигосахариды, структурно родственные дигетерогликану из E. faecalis и других. ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ И СПЕКТРАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ Механизм пиранозид-фуранозидной перегруппировки был так же изучен при помощи методов квантовой химии. Были рассчитаны энергии активации и структуры переходных состояний предполагаемой скорость-определяющей стадии реакции. Результаты моделирования позволили дать рациональное объяснение экспериментально наблюдаемому влиянию перечисленных выше факторов (природы агликона, защитных групп, ориентации заместителей и т д.) и на основе этого предположить структуру субстратов, наиболее легко вступающих в реакцию перегруппировки. Методами теоретического компьютерного моделирования и с помощью экспериментальных ЯМР методик были выявлены конформационные параметры гликозидных связей, входящих в состав полисахаридных антигенов изучаемых патогенов. В частности, был осуществлен конформационный анализ и расчет спектральных характеристик соединений, содержащих (1-3)-фуранозил-пиранозидную связь. ГЛИКОБИОЛОГИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ С использованием синтезированных нами в ходе ХИМИЧЕСКИХ ИССЛЕДОВАНИЙ олигосахаридов и гликоконъюгатов было проведено исследование биологической роли фуранозилсодержащих соединений. С привлечением комплекса современных физико-химических методов, включающих иммуноферментный анализ (ИФА), поверхностный плазмонный резонанс (ППР), различные ЯМР методики (STD, ЯМР-титрование), рентгеноструктурный анализ, молекулярный докинг и др было изучено взаимодействие фуранозилсодержащих углеводов с различными белками иммунной системы, в том числе установлена топология углевод-белкового взаимодействия и определены термодинамические характеристики взаимодействия фрагментов ЛПС K. pneumoniae с лизоцимом.

Аннотация результатов, полученных в 2016 году
В 2016 году были проведены комплексные экспериментальные и теоретические исследования пиранозид-фуранозидной перегруппировки, направленные на расширение ее синтетических возможностей и разработку новых, более эффективных схем получения практически значимых фуранозилсодержащих соединений. Было проведено систематическое исследование влияния концентрации и соотношение реагентов, температуры, природы растворителя и других условий проведения пиранозид-фуранозидной перегруппировки с использованием широкого круга моносахаридных субстратов, как нейтральных, так и производных уроновой кислоты. Принципиально новым достижением является осуществленная трансформация сразу в двух и трёх моносахаридных звеньях в составе одного олигосахарида. Уникальность данной реакции заключается в том, что перегруппировке подвергается незащищенная олигосахаридная цепь, что открывает новые возможности для синтетической модификации олигосахаридов. Важно отметить, что на настоящий момент таких методов трансформации олигосахаридной цепи не существовало в мировой науке в принципе. Разработанная методика позволяет синтезировать блоки, востребованные для получения практически значимых олигосахаридов, отвечающих полисахаридам опасных микроорганизмов. Успешная разработка препаративных методов пиранозид-фуранозидной перегруппировки позволила впервые осуществить синтез олигосахаридных лигандов, родственных дигетерогликану – антигенному полисахариду опаснейшего бактериального патогена E. faecalis, содержащих 4, 6 и 8 моносахаридных звеньев. Все олигосахариды были получены в спейсерированной форме, что позволило конъюгировать их с метками и белковыми носителями. Данные неогликоконъюгаты были использованы для скрининга опсонизирующих антител и проведения иммунизаций в рамках гликобиологической части данного проекта. Была разработана новая эффективная стратегия синтеза спейсерированных олигосахаридов, структурно родственных фрагментам галактоманнана одного из наиболее опасных грибковых патогенов - Aspergillus fumigatus («чёрная гниль»), позволяющая использовать универсальный фуранозидный блок для построения как (15)-, так и (16)-гликозидных связей. Данная стратегия была основана на пиранозид-фуранозидной перегруппировке, а также на контролируемой миграции бензоильной группы, позволяющей получать необходимые гликозил-акцепторы со свободной ОН-группой как при С-5, так и при С-6. Для получения С-5 или С-6 моногидроксильных производных использовались различные условия удаления временной Fmoc-защитной группы при О-6 в использованных субстратах с бензоильной защитой при О-5. При удалении Fmoc-группы в них в стандартных условиях образуются смеси 5-OH и 6-OH производных. Однако, в ходе выполнения проекта нами были разработаны граничные условия, позволяющие селективно получать только первый или второй продукты. Важнейшим преимуществом данного подхода является унификация синтетических блоков, так как одно и то же Fmoc-производное галактофуранозы было успешно использовано как для синтеза олигосахаридных лигандов, родственных дигетерогликану E. faecalis, так и разнообразных структур, отвечающих галактоманнану A. fumigatus. Разработанный гибкий синтетический подход позволил быстро создать библиотеку олигосахаридов, отражающих основные структурные элементы галактоманнана Aspergillus fumigatus. Все олигосахариды были получены в спейсерированной форме, что позволило конъюгировать их с биотиновой меткой и использовать для скрининга антител в рамках гликобиологической части данного проекта. Исключительная актуальность данного направления связана с необходимостью срочной разработки отечественного высокоспецифичного диагностикума для обнаружения галактоманнанового антигена возбудителя аспергилеза. В настоящее время такой диагностикум отсутствует в России, но остро необходим в клинической практике. В 2016 году был синтезирован спейсерированный тетрасахарид, отвечающий галактану I – антигенному полисахариду еще одного опаснейшего патогена - грамотрицательной бактерии Klebsiella pneumoniae. Разработанная синтетическая схема предполагала использование пентенильной группы в аномерном положении в качестве уходящей группы в условиях реакции гликозилирования, а также как временной защитной группы аномерного положения. С использованием комплекса спектральных и теоретических методов было изучено конформационное состояние углеводных остатков в сульфатированных моносахаридах. В результате систематических исследований была получена исчерпывающая информация об особенностях их спектров ядерного магнитного резонанса на ядрах 1Н и 13С, а также величинах близких и дальних гомо- и гетероядерных констант спин-спинового взаимодействия и ядерных эффектов Оверхаузера. При использовании этих данных совместно с результатами теоретических расчетов (квантовая механика в вакууме и с использованием континуальной модели сольватации) нами было впервые доказано существование необычного конформационного состояния промежуточного между 3,OB и 3S1 для ряда сполна сульфатированных пиранозидов, хотя ранее считалось, что данные моносахариды представляет из себя равновесную смесь двух конформеров 1С4 и 4С1. Таким образом, были получены совершенно новые данные о пространственном строении сульфатированных пиранозидов, и созданы их 3D-модели. Данные результаты имеют принципиальное значение для механизма протекания пиранозид-фуранозидной перегруппировки и отвечают за особенную реакционную способность ряда субстратов. Используя синтетические модельные олигосахариды, специальные методы спектроскопии ЯМР (STD) и рентгено-структурный анализ была открыта неизвестная ранее лектиновая функция лизоцима, позволяющая этому защитному белку иммунной системы распознавать клеточные стенки грамотрицательных бактерий. В качестве лигандов лизоцима выступают участки О-цепей бактериальных липополисахаридов. Впервые данное явление было обнаружено нами на примере галактана I бактерии Klebsiella pneumoniae, которая является одним из опасных возбудителей пневмонии, а также ассоциирована с инфекциями мочеполовой системы и госпитальными инфекциями. На основании полученных данных круг лигандов лизоцима может быть значительно шире, что позволяет лизоциму дезактивировать разнообразные патогены. Открытый новый механизм защитного действия лизоцима позволяет создавать новые терапевтические подходы для лечения бактериальных заболеваний. С использованием библиотеки синтетических лигандов определена эпитопная специфичность моноклональных антител против галактоманнана Aspergillus fumigatus. Выявлено два наиболее перспективных высокоспецифичных антитела, распознающих принципиально различные участки цепи галактоманнана. Данные результаты создают необходимую основу для разработки востребованного диагностикума против опасного заболевания - инвазивного аспергилеза. Таким образом, все запланированные на 2016 год исследовательские работы выполнены полностью, а по некоторым направлениям исследования проведены даже в более широком объёме. Кроме того, в ходе реализации проекта, был сформирован задел для продолжения данного исследования на принципиально новом уровне.