Аннотация результатов, полученных в 2014 году
Проведен гидролиз белков в 6N соляной кислоте при температуре 105°С в течение 24 часов.и определен изотопный состав углерода 16 аминокислот (аланин, валин, глицин, изолейцин, серин, треонин, аспарагин, аргинин, лизин, цистеин, метионин, фенилаланин, тирозин, триптофан, гистидин, пролин). Показано, что результаты измерения изотопного состава углерода смеси аминокислот, определенные при использовании LC-IsoLink и элементного анализатора, имеют хорошую сходимомть (от 0.06 до 2.75 ‰). Для пробоподготовки образцов в различном агрегатном состоянии был разработан высокотемпературный электрохимический твердоэлектролитный реактор (ТЭР). Он имеет вид тонкой керамической трубки с внешним и внутренним диаметром 2 мм и 1 мм, соответственно. На внутреннюю и внешнюю поверхности трубки реактора наносились электроды из пористой платины. При химической реакции на внутренней трехфазной границе реактора при температуре 950оС происходит изменение химического потенциала кислорода, что приводит к перемещению ионов О2─ через стенку кислородопроводящей керамики из атмосферы внутрь в поток газа-носителя. Продукты реакции в потоке газа-носителе гелия переносятся в ионный источник масс-спектрометра Delta Plus. Полноту окисления органических веществ контролировали путем измерения изотопного состава стандартных образцов. Полное окисление в ТЭР органических соединений было достигнуто при значении рабочего электрода равным -170 мВ. Разработанный реактор имеет очень высокую чувствительность. Количество инжектированного цистеина для измерения изотопного состава серы составляло около 40 мкг или 0.3 нмоль. Благодаря простоте и надежности конструкции, разработанный твердоэлектролитный реактор может с успехом заменить фирменные окислительные и восстановительные реакторы в масс-спектрометрии изотопных отношений, может быть использован в хроматографии и элементном анализе. Биологическое фракционирование изотопов имеет закономерности, связанные с фундаментальными особенностями химии биосинтеза, прежде всего с тем, что все реакции биосинтеза осуществляются под управлением ферментов и совершаются в открытых системах, близких к стационарным. Зигот на стадии своего внутреннего дробления, являясь замкнутой системой, не позволяет восполняться нуклеотидам извне и не покидать её пределы до полного завершения процесса, оставаясь в том же объёме целостной, но уже, более гетерогенной системой. Общее количество нуклеотидов, попавших изначально в зиготу, не изменяется, так как клеточная мембрана зиготы для них непроницаема, а внутри её, de novo, они не синтезируются. В связи с этим, идёт только однонаправленный процесс убывания свободных нуклеотидов, как строительного материала, служащего для образования новых, химически идентичных структур ДНК при матричном синтезе дочерних ДНК (тиражирование ДНК). В ходе исследований этого года по данному проекту были подготовлены и проведены следующие эксперименты. Выделены биологические объекты, выделен делящийся материал и произведены анализы изотопного состава углерода (δ13С) остаточного пула нуклеотидов на разных стадиях дробления зиготы. Экспериментальные исследования проводились с использованием оплодотворённых яиц, синхронно дробящихся зародышей лягушек вида Rana arvalis, отобранных в подмосковных природных водоёмах, из разных стадий дробления зигот (под микроскопом). Зиготы каждой стадии отдельно, подвергли ступенчатой ультрафильтрации. Все операции проводились без использования органических растворителей. После выделения и очистки пула свободных нуклеотидов от остатка гомогената клеточной массы бластомеров, проводилось ВЭЖХ разделение, и изотопное масс-спектрометрирование исследуемых проб на системе LC-IsoLink-DELTA XP (Thermo Finnigan). Изотопный анализ этих проб в результате показал: с углублением процесса дробления зигот, от стадии к стадии происходит изотопное утяжеление остаточного пула свободных нуклеотидов. Далее, как планировалось, были произведены расчеты, направленные на вычисление изотопного эффекта сопровождающего процессы фракционирования при синтезе ДНК.

Аннотация результатов, полученных в 2015 году
1. Для изучения изотопного эффекта в процессе полимеризации было налажено получение пептидов коротких белков биогенного и химического происхождения. Биогенные пептиды с массой 2379 Да получали из фикоцианина путем гидролиза с помощью трипсина. Химический синтез пептидов будет осуществлен путем наращивания пептидной цепи по методу SPPS (Solid Phase Peptide Synthesis). Был оптимизирован способ получения фикоцианина (ФЦ) высокой степени чистоты из цианобактерии Arthrospira platensis. Из полученного фикоцианина выделены пептиды трипсического гидролизата, ставшие образцами для последующего химического твердофазного синтеза пептидов, аналогичных по аминокислотному составу. Синтезирован 21-членного пептида NH2-GEMLSTAQIDALSQMVAESNKR-COOH (пептид 1) и 8-членного пептида NH2-SWYIEALK-COOH (пептид 2). Пептид 2 синтезировали методом твердофазного пептидного синтеза на смоле НМР с присоединенным остатком Fmoc-Lys(Boc) фирмы «Applied Biosystems» (США), емкость смолы 0.60 ммоль Fmoc-аминокислоты/г. Синтез проводили с использованием пептидного синтезатора 433А «Applied Biosystems» (США) в масштабе 0,1 ммоля (реакционный сосуд 8 мл), загрузка 167 мг смолы, согласно процедуре FastMoc, описанной в инструкции к синтезатору. Таким образом, была отработана методика получения пептидов, которые были гидролизованы для измерения изотопного состава углерода. 2. Исследование биологических эффектов при изотопозамещении среды метаболизма, а так же экспериментальное изучение индивидуальных изотопно-модифицированных соединений in vivo и in vitro. Осуществлёно in vivo – синтез и выделение препарата 13C-SAM, а также произведено его испытание in vitro биохимических взаимодействиях. Было изучено влияние 13C-SAM препарата на экспериментальных животных и культурах клеток. В результате экспериментов выявлено: 1. Отсутствие 13С в среде метаболизма, приводит к полной утрате репродуктивных функций, как у растений, так и у животных. 2. При значительном избытке 13С (в эксперименте до 98%) у экспериментальных животных, так же происходит утрата репродуктивных функций. 3. Проведены экспериментальные испытания, полученных in vivo в нашей лаборатории 13С –SAM: - при in vitro метилировании ДНК 13С–SAM (на базе ФИБХ РАН) получено десятикратное превышение в метилировании, по отношению к 12С-SAM. - в эксперименте на культуре раковых клетках (на базе института биохимии им. А. Н. Баха РАН) получена разница в действии 13С–SAM и 12С-SAM. Изотопно - модифицированный препарат - 13С–SAM, в 2 раза сильнее подавляет метаболизм онкоклеток. - при дроблении зигот лягушек экспериментально исследовано действие 13С –SAM и 12С-SAM, инкорпорированных через мембрану в состав яйцеклеток. В результате в опыте с 13С–SAM наблюдалась остановка эмбрионального развития зародышей на стадии гаструляции. При этом в группе с 12С-SAM эмбриональное развитие успешно завершилось. 3. Подбирались условия проведения сопряженной реакции образования пептидной связи и гидролиза АТФ в водной фазе, при «подсушивании» с помощью вакуумного насоса. Пока образование олигопептидов не обнаружено. Проведена сопряженная реакция образования пептидной связи и гидролиза АТФ в сухом виде из глутаминовой кислоты и АТФ при нагревании (95 °С) в течение 24ч. За время инкубации проходит 5 циклов: нагревания до 95 °С и охлаждения до 20 °С. Показано, что в присутствии АТФ, происходит образование олигопептидов глутаминовой кислоты. Вероятно, образующийся при гидролизе АТФ неорганический фосфат может выступать в роли катализатора для образования пептидной связи. 4. Обнаружено различие между изотопно_фракционной характеристикой нафтидов кальдеры Узон (Камчатка) и продуктов термогидролиза биоты. В свою очередь, изотопно_фракционная характеристика термогидролизованной биоты оказалась подобной соотношению изотопных составов соответствующих фракций Богачевской нефти. Совпадение изотопных диаграмм Богачевской нефти и гидротермально превращенной биоты доказывает, что Богачевская нефть имеет биогенную природу. Углеводороды кальдеры Узон (Камчатка) являются в основном продуктом гидротермальной переработки биомассы микроорганизмов и остатков растений, обитающих в сфере круговорота термальных вод. 5. Показано, что по совокупности геохимических данных, характеризующих Толбачинские алмазы (Камчатка), можно предположить, что они образовались в соответствии с предложенной Э.М. Галимовым механизмом синтеза алмазов при возникновении кавитации в быстро движущемся флюиде. Толбачинские алмазы отличаются не-обычным для монокристальных алмазов изотопнолегким углеродом, который ближе всего к углероду в бразильских карбонадо, образование которых в настоящее время связывается с мантийными сильно флюидизированными расплавами или с собственно метансодержащими флюидами. 6. Исследование свойств разработанного кислородпроводящего твердоэлектролитного реактора (ТЭР) на основе диоксида циркония, стабилизированного Y2O3, показало, что при выбранном режиме работы он позволяет проводить практически полное окисление органических веществ в газообразном, жидком и твердом состоянии, имеющих сложную молекулярную структуру, а также проводить полное восстановление воды и других кислородосодержащих веществ. Благодаря простоте и надежности конструкции, разработанный ТЭР может с успехом заменить коммерческие окислительные и восстановительные реакторы в масс-спектрометрии изотопных отношений. Стандартные отклонения результатов измерения изотопного состава углерода для органических веществ, окисленных с помощью ТЭР, изменяются от 0.11 до 0.57‰ и имеют меньшую величину, чем стандартные отклонения при окислении соответствующих соединений в коммерческом реакторе. Градуировочный график зависимости площади сигнала ионного тока кислорода от количества углерода окисленного метана в ТЭР представляет собой прямую линию в диапазоне изменения массы метана от 0.06 до 16 мкг. Предел обнаружения метана составляет 2х10–10 г. Для пробоподготовки белков и отдельных аминокислот была создана новая экспериментальная установка сожжения, позволяющая проводить сжигание представительных проб (до 10 мг и более) off-line и выделять образовавшийся газ СО2.

Аннотация результатов, полученных в 2016 году
1. Изучение сопряженной реакции образования пептидной связи между молекулами аланина и глицина и гидролиза АТФ при ступенчатом нагревании и охлаждении смеси в присутствии воды не выявило заметной полимиризации. Проведенные эксперименты по полимеризации аминокислот показали, что вещество с массой 147,075 соответствующее дипептиду Ala-Gly присутствует уже в исходной смеси. Причем этот пик обнаруживается не в исходном аланине или глицине, а в исходной АТФ (возможно, что это не дипептид, а какое-то другое вещество с одинаковой массой). После нагревания пик остается, но его интенсивность падает примерно в 3 раза. В целом же сигнал этого пика составляет меньше одного процента от количества исходных веществ (т.е. находится на уровне фона). Такая же ситуация наблюдается и с пиком диаланина (с массой 161,092). Его сигнал также присутствует, как в исходном, так и в опыте после нагревания. И интенсивность падает примерно в 2 раза. Дипептид глицина (с массой 133,060) и все возможные трипептиды обнаружить не удалось. 2. Гидролиз фикоцианина трипсином проводили при рН 7,95 в течение ночи (10 ч). Полученные после гидролиза фрагменты фикоцианина разделяли препаративной ВЭЖХ на обращенной фазе (С18) в градиенте ацетонитрила в воде с 0,1% уксусной кислоты. Фракции, времена выхода которых соответствовали временам выхода целевых пептидов SWYIEALK и GEMLSTAQIDALSQMVAESNKR, подвергали анализу методом масс-спектрометрии с ионизацией электрораспылением (для определения молекулярных масс компонентов фракций). 3. Была обоснована теоретическая модель биологического фракционирования изотопов углерода в метаболически-связанной системе ферментных реакций. Для сравнительного изотопного анализа были искусственно синтезированы аналоги биогенных пептидов: 21-членный пептид NH2-GEMLSTAQIDALSQMVAESNKR-COOH (пептид 1) и 8-членного пептида NH2-SWYIEALK-COOH (пептид 2). Пептид 2 синтезировали методом твердофазного пептидного синтеза на смоле НМР с присоединенным остатком Fmoc-Lys(Boc) фирмы «Applied Biosystems» (США). Разработанная методика измерения изотопного углерода аминокислот на изотопном масс-спектрометре, соединенном с жидкостным хроматографом, GC-IsoLink-Delta XP, позволила построить биологический тренд зависимости бетта-фактора от изотопного состава углерода аминокислот синтезированных пептидов. Для выделенных из фикоцианина (ФЦ) аминокислот и измеренных с высокой чувствительностью и селективностью был получен биологический тренд в виде прямой линии. Для искусственно созданных пептидов такой тренд не наблюдался, точки на графике располагались хаотично. 4. Рекомбинантная нуклеотидная последовательность, ответственная за синтез белка помещена в генетический аппарат 1) цианобактерии Synechocystis sp. PCC6803, способной к автотрофной фиксации карбоната; 2) бактерии E.coli , способной расти на «минимально» минеральной среде с глюкозой, либо глицерином в качестве единственного источника углерода, а так же «сложной среде», состоящей из белкового гидролизата с витаминными добавками. Таким образом, получены условия для получения пептида с одинаковой аминокислотной последовательностью в различных метаболических путях на различных источниках углерода. 5. Была создана новая установка и разработан метод, позволяющий определять изотопный состав углерода и азота в уникальных образцах в ограниченном количестве и гетерогенной структуры. На созданной установке GC/ТЭР/IRMS были проанализированы образцы ацетонитрила. Были получены следующие результаты при постоянном потенциале рабочего электрода δ13C=-26.51 ‰ и δ15N=1.52 ‰ и при периодическом изменении потенциала рабочего электрода δ13C=-26.38 ‰ and δ15N=1.61 ‰ . В пределах погрешности измерения полученные результаты совпадают. 6. Было показано, что термогидролиз нефтепроявлений из кальдеры Узон на Камчатке приводит к изменению изотопно-фракционной характеристики и она становится подобной характеристике для Богачевской нефти, месторождение которой находится на расстоянии 70 км от Узона. При этом δ13C величины асфальтеновой и бензол-метанольной фракции возрастают, а бензольной фракции уменьшается. Так как не наблюдается полного соответствия между изотопно-фракционными характеристиками, то, вероятно, Богачевская нефть была образована при более высоких термобарических параметрах и формировалась более длительное время. Если свободное пространство ампулу заполнялось кислородом, то δ13C бензольной фракции изменялась незначительно. Таким образом, было показано, что нефтепроявления в кальдере Узон являются продуктом гидротермальной переработки биомассы микроорганизмов и остатков растений, обитающих в сфере кругооборота термальных вод. Термолиз нефтепроявлений приводит к увеличению зрелости вещества, которое в дальнейшем может служить источником для формирования зрелой нефти. 7. Исследования показали, что отслеживать временной ход цепи взаимодействий биохимических реакций с участием радикальных процессов в режиме реального времени, возможно, только с применением препаратов, изготовленных на основе спиновых ловушек. Совместно с сотрудниками биологического факультета МГУ, экспериментально исследована возможность изучения протекания радикальных процессов в биохимических взаимодействиях с применением метода сополимеризации радикалов. В результате этой работы получены экспериментальные результаты, позволяющие судить об интенсивности протекания радикальных процессов, что дало возможность применить данный метод для изучения вопроса механизма появления эффекта неравноценного метилирования ДНК разноизотопными формами SAM. Получен препарат 13С-SAM, с которым проведена работа по испытанию его на живых системах. Первые результаты испытаний показывают более эффективное его участие в биохимических процессах (метилирование ДНК), чем препарат с естественным содержанием изотопов углерода. Предложены первые теоретические обоснования обнаруженного эффекта, подтверждающиеся в продолжении экспериментальных работ. Так же проведены эксперименты по метилированию ДНК 13С-SAM в искусственно созданном магнитном поле. Сравнительные экспериментальные результаты 13С-SAM с усиленным и естественным магнитным полем, полученных при испытании его на живых организмах, показывают увеличение эффективности действия препарата в усиленном магнитном поле.