Аннотация результатов, полученных в 2014 году
В процессе выполнения НИР регламент патентных исследований выполнен полностью. За отчетный период проведено 11 экспериментов на животных (крысы (Wistar), крупный рогатый скот (Bos Taurus), кролики (Oryctolagus cuniculus), куры (Gallus gallus). Разработаны методики, основанные на принципах и подходах, изложенных исполнителями в МУК 4.1.1482-03; МУК 4.1.1483-03 и защищенные патентами RU 2230491; 2302640; 2478956 и др. Анализ биообразцов проводился с помощью единой взаимосвязанной аналитической системы, объединяющей методы ИСП-АЭС и ИСП-МС. Для определения Al, As, Cd, Co, Cr, Cu, Fe, Mn, Ni, Pb, Se, Si, Sn, Ti, V использовался масс-спектрометр Elan 9000 (Perkin Elmer, США), определение Ca, Mg, P, Zn, K, Na проводилось на атомно-эмиссионном спектрометре Optima 2000 V (Perkin Elmer, США). Техническая компетенция подтверждена аккредитацией РОСС RU. 0001.22ПЯ.05. По итогам экспериментов на модели Oryctolagus cuniculus, крыс Wistar сформированы базы данных показателей концентраций и пула двадцати пяти химических элементов в тканях тела животных при различной нутриентной обеспеченности в т.ч. при минералдефицитной диете и др. Подтверждена информативность элементного состава шерсти при индивидуальной оценке величин пула токсичных элементов в организме - Al, Cd, Hg, Pb, Sr. Прогнозирование общего пула эссенциальных и условно-эссенциальных микроэлементов (МЭ) в организме по составу шерсти возможно в донозологический период. При этом элементный состав шерсти животных согласовано изменялся с размером пула этих веществ в организме по 11 элементам – P, K, Na, Fe, Co, Se, I, Cr, Ni, V, B. Выявлено увеличение концентраций в шерсти Zn, Mn, Si на фоне уменьшения общего пула в организме. При дизадаптации, сопровождающейся нарушением гомеостатических механизмов и изменением состава крови, элементный состав шерсти менее информативен. На основании ранее полученных результатов и данных исследования на модели 120 животных (крупный рогатый скот) разработана методика взятия образцов биосубстратов животных для изучения элементного статуса. Исследованы образцы шерсти (с затылочной части головы, проекции первого хвостового позвонка, в проекции медианны 12-го ребра, в области подгрудка, холки, кисти хвоста): на содержание 25 элементов; соответствие независимых выборок (состава) одной совокупности; скорость отрастания; степень загрязненности; соотношение и элементный состав компонентов шерсти (остевые волосы, пух и др.). На основании обобщения всего материала было сделано заключение о целесообразности отбора проб с холки. Этот вывод основывается на следующих результатах. По степени загрязненности – наименьшее содержание примесей наблюдалось в пробах шерсти с холки и подгрудка: 8,14±1,02; 9,01±0,73 % в стойловый период и 4,80±0,83; 5,42±0,71% в пастбищный период по массе соответственно. Суммарное загрязнение для других четырех мест было достоверно большим, с максимальными значениями для кисти хвоста, составивших 84,3±8,65% в стойловый и 28,8±3,21% в пастбищный период. Целесообразность выбора участка тела для сбора образцов шерсти обусловлена не-одинаковым элементным составом этого биосубстрата, собранного с различных участков. Как следует из полученных данных, расхождения в элементном составе шерсти, собран-ной с различных мест, определялись неодинаковой скоростью роста различных компонентов шерсти. Выявили, что наибольшая скорость роста характерна для остевых волос с холки 0,38±0,033 мм/сут, что достоверно на 79% (Р<0,001) превосходит аналогичные показатели для подгрудка, на 29% (Р<0,001) для ости с области проекции I хвостового по-звонка. Достоверно интенсивнее (0,221±0,02 мм/сут) растут пуховые волокна на поверхности кожи первого хвостового позвонка. Элементный состав пуховых и остевых волокон также различен. Это определяет большую объективность методики отбора средних проб с участка тела крупного рогатого скота почти лишенного пуховых волокон – холки. В тоже время формирование элементного состава шерсти крупного рогатого скота на различных участках тела происходит по одним и тем же законам. Этот вывод подтверждается верностью пошаговой проверки гипотезы, согласно которой средние значения двух выборок относятся к одной и той же совокупности. Целесообразность отбора проб шерсти для элементного анализа с холки определяется и более высокой скоростью роста остевых волос, что важно в практической работе. Согласно разработанной методике взятия образцов шерсти КРС средняя проба шерсти (4-5 г) формируется путем объединения образцов, собранных с 3-5 мест холки, скорректированных по длине, соответствующей обрастанию в оцениваемый период времени с учетом скорости отрастания волос - 0,38 мм/сут. Обработка баз данных элементного состава клинически здоровых животных позволила рассчитать предварительные значения 25 и 75 центилей концентрации химических элементов в шерсти крупного рогатого скота возраста 18-60 месяцев. Эти значения следующие: Al (15.4; 38,49); As (0,0491; 0,083); B (2,51; 8,69); Ca (1886; 3150); Cd (0,0177; 0,0343); Co (0,0629; 0,126); Cr (0,056; 0,159); Cu (3,9; 5,52); Fe (21,19; 41); Hg (0,0041; 0,01); I (0,37; 0.707); K (437; 691); Li (0,275; 0,62); Mg (380; 749); Mn (14,82; 35,94); Na ( 275; 451); Ni (0,405; 0,851); P (96,01; 213); Pb (0,412; 0,0447); Se (0,323; 0,823); Si (8,21; 31,31); Sn (0,0117; 0,0447); Sr (11,53; 22,7); V (0,102; 0,263), Zn (81.59; 99,16). Введение допущения, по которому значения, лежащие в интервалах 0-25 и 75-100 центилей условно принимаются как «дефицит» и «избыток» рассматриваемого вещества (например, Ca1 и Ca4, Са 2/3 - «норма»), позволило для случаев, при которых коэффициент корреляции между Ca и Mg превысил 0,94, сформировать группы (63,8% наблюдений), описываемые уравнением с показателями качества большими 93,5% (набор условий - Al4+As4+Be4+Cd4+Co4+Cr4+Cu1+Cu4+Fe4+I1+K4+Li4+Mg4+P4+ Si4+Sn4+Zn4. Однако, ввиду малой выборки (n<200) полученные значения центильных интервалов на следующем этапе исследований будут уточнены, что является обязательным условием для наиболее точной диагностики элементозов. По итогам исследований разработан способ отбора шерсти животных для изучения элементного статуса, (заявка № 2014145406 на получение патента РФ на изобретение). В рамках работ по разработке препаратов-МЭ проведены исследования по оценке биологических эффектов разноразмерных фракций элементарного Fe и Cu. В эксперименте на модели цыплят-бройлеров показано, что однократные внутримышечные инъекции наночастиц Fe (80±5 нм) в отличие от агломератов наночастиц (924±29,6 нм) и микрочастиц (10±0,1 мнм) этого элемента сопровождающиеся повышением интенсивности роста на 6-10%. В эксперименте на модели крыс Wistar показаны различия в динамике поступления Fe в кровь при внутримышечном однократном введении лиозолей наночастиц Fe (d=80±5 нм) и агломератов наночастиц Fe (d=418±17,1 нм) в дозировке 2,0 мг/кг массы животных. Пролонгированность элиминации Fe из депо, созданного внутримышечными инъекциями, позволяет рассматривать препараты агломератов наночастиц Fe в качестве источника MЭ при лечении элементозов. Во второй серии исследований дана оценка биологических эффектов многократных инъекций препаратов наночастиц металлов-МЭ на организм животным. В первом эксперименте описаны морфофункциональные изменения тканей в местах введения и обмен химических элементов (25 показателей) многократных внутримышечных инъекциях (1 раз в неделю на протяжении 7 недель) препаратов агломератов наночастиц Fe (d=431±13,8 нм). Внутримышечное введение агломератов наночастиц Fe формирует депо этого элемента, обнаруживаемое в течении более чем 21 суток в миосимпластах мест инъекций, отмечено увеличение железа в макрофагах, в том числе локализуемых в соединительной ткани, окружающей триады печени. Оценка готовности клеток к апоптозу в печени, селезенке, почках выявила экспрессию антитела каспазы-3 только в селезенке (до 2.9±0.06‰). Концентрация Fe в совокупности скелетной мускулатуры (без учёта места инъекции) снижается. Внутримышечные инъекции агломератов наночастиц Fe негативно отражаются на обмене целого ряда химических элементов. В эксперименте дана оценка элементного статуса тканей экспериментальных животных (крысы-самцы линии Wistar) при многократном (1 раз в неделю на протяжении 12 недель) внутримышечном введении наночастиц Cu типа Cu10x в дозе 2,0 мг/кг массы животного. Установлено, что при введении наночастиц Cu в биотических дозах (до 4 мг/кг) не происходят критических изменений концентрации общего пула элементов. Дальнейшее увеличение нагрузки наночастицами Cu на организм вызывает дисбаланс МЭ в печени и селезенке и увеличение экспрессии каспазы-3 в печени до 1,5 ‰ и в селезенке до 8,3 ‰. Установлен зобогенный эффект наночастиц Cu на фоне депрессии обмена йода. Это проявлялось пролиферацией тироцитов, преобладанием мелких, лишенных коллоида фолликул, увеличением количества митозов среди тироцитов в 1,6 раза, увеличением числа клеток, экспрессирующих Ki – 67 с 5,4±0,2 ‰ до 12,6±0,3 ‰.

Аннотация результатов, полученных в 2015 году
В 2015 году проведено экспедиционное обследование различных подвидов Bos Taurus на территории Оренбургской, Челябинской и Курганской областей РФ и создана база данных, включающая результаты исследований элементного состава биосубстратов (шерсть, мышечная ткань и др.) 891 животного. Экспедиционные обследования выявили специфические внутривидовые различия в элементном статусе животных. Элементный состав шерсти животных находился в тесной связи с гендерными и возрастными особенностями сравниваемых микропопуляций, продуктивной специализацией животных. Впервые, определены референтные и центильные величины концентраций 25 химических элементов (Ca, Cu, Fe, Li, Mg, Mn, Ni, As, Cr, K, Na, P, Zn, I, V, Co, Se, Al, B, Cd, Pb, Hg, Sn, Si, Sr) в шерсти Bos Taurus. По итогам исследований предложены «Способ диагностики элементозов молодняка крупного рогатого скота по элементному составу шерсти» и «Способ исследования элементного статуса крупного рогатого скота в различные возрастные периоды». При проведении исследований по разработке новых подходов к использованию наноматериалов для коррекции элементного статуса животных, разработана и проверена гипотеза формирования ответа организма животного на поступление (per os, внутримышечно) ультрадисперсных металлов-микроэлементов, запускаемого взаимодействием частиц препарата с макрофагами, и последующей активизацией синтеза аргинина. Экспериментальная проверка гипотезы позволила разработать принципиально новые решения по созданию препаратов микроэлементов. Установлен факт повышения живой массы и конверсии корма в продукцию цыплят-бройлеров при использовании наночастиц железа совместно с комплексом аминокислот. В ходе выполнения гранта впервые дана сравнительная оценка физиологического и продуктивного действия внутримышечного и энтерального путей ввода наночастиц железа в организм птицы. В рамках работ по практической апробации наночастиц металлов и их соединений в качестве препаратов-микроэлементов проведен сравнительный анализ чувствительности четырех коммерчески доступных и лабораторных люминесцирующих бактерий к воздействию 10 наночастиц (Cu диаметр 50–110 нм; MgO 25–75 нм; Cr2O3 60–170 нм; Fe2O3 80–150 нм; CuO 30–110 нм и др.). При выполнении исследований на крысах Wistar изучена динамика минерального состава тканей экспериментальных животных при многократных инъекциях (еженедельно в течение 49 суток) наночастиц железа (80±5 нм). Выявлен факт увеличения обменных пулов токсических элементов (Pb, Cd, Al) и уменьшения их величины для ряда эссенциальных. По материалам исследований предложен «Способ повышения продуктивности и величины депо эссенциальных элементов в теле цыплят-бройлеров». Проведены две серии исследований по формированию базы данных мультиэлементного состава отдельных биосубстратов Oryctolagus cuniculus и крыс Wistar в связи с пулом этих веществ в организме. Рассмотрение связи состава шерсти с размерами отдельных пулов химических элементов во внутренних органах, желудочно-кишечном тракте, мышцах, скелете, крови, кожи подтвердило факт нарастания числа достоверных корреляционных связей на фоне несбалансированного кормления. Причем наибольшее число корреляций отмечалось при сравнении состава шерсти и кожи п (Al, As, Ca, Cd, Co, Cr, Cu, K, Mn, Ni, Pb, Sr, V, Zn). В эксперименте на крысах была подтверждена зависимость числа корреляционных связей состава шерсти с пулом элементов в организме животных от сбалансированности минерального питания. В ходе исследований по оценке соразмерности содержания в шерсти животных (крысы Wistar) химических элементов и их пула в организме формировали пищевой стресс при добавлении в основной рацион продуктов быстрого приготовления (ПБП). Длительное потребление ПБП, способствовало достоверному увеличению содержания: кальция, магния, фосфора, калия, натрия, меди, железа и снижению содержания в тканях эссенциальных элементов цинка, марганца, селена. Установлено, что в условиях эксперимента элементный состав шерсти животных согласовано изменялся с размером пула большинства этих веществ в мышечной ткани. В эксперименте на крысах Wistar при оценке хронической интоксикации организма этанолом и кадмием, выявлен факт развитие дисэлементозов, что проявилось снижением содержания в крови Mg, P, As, Fe, Cu, Si, Zn и увеличением концентрации Cd. Элементный состав шерсти лабораторных животных оказался информативен при оценке обмена K, As, Co, Cr, Fe, Ni, Zn, Cd, Pb. По итогам исследований подготовлено и опубликовано 21 статья, из них 13 в изданиях, индексируемых в базе данных Scopus и Web of Science. Подано три заявки на получение патентов РФ на изобретения.

Аннотация результатов, полученных в 2016 году
За 2016 год полностью выполнены все запланированные работы. Проведено 4 экспедиционных поездки по сбору биоматериала, выполнено 11 экспериментов на животных, в т.ч. 1 на модели крыс (Wistar), 6 на модели крупного рогатого скота (Bos Taurus), 4 на курах (Gallus gallus). На основании результатов исследований по оценке информативности элементного состава шерсти животных в качестве маркера обменного пула элементов, разработанной методике отбора проб шерсти, выявленных референтных и центильных концентраций химических элементов в шерсти Bos Taurus, разработана методика выявления, коррекции и профилактики элементозов продуктивных животных Bos Taurus, которая включает основные положения: Выявление элементозов. В качестве субстрата для оценки элементного статуса используется шерсть животных. Отбор проб шерсти животного производится с холки по предлагаемой методике, с датированием периода оценки элементного статуса по длине шерсти с учетом скорости её отрастания. Исследования элементного состава шерсти производятся методами, обеспечивающими точность измерения 10-9-10-12г, в том числе масс-спектрометрическим и атомно-эмиссионным методами по отдельным элементам с обязательным использованием стандартных образцов. Полученные данные сопоставляются со значениями 25 и 75 центиля концентраций в шерсти животных химических элементов для отдельных половозрастных групп разводимых на данной территории. Превышение значений 90 центиля свидетельствуе о состоянии гиперэлементоза для эссенциалных элементов (существуют исключения). Значения концентрации менее 10 центиля соответствует состоянию гипоэлементоза. (Примечание: методика не может быть эффективно использована для случаев выраженной патологии обмена веществ). Коррекция. На основании сопоставления концентраций в шерсти химических элементов и физиологических норм принимается решение о реализации комплекса мер по коррекции рационов животных. Для эссеницильных элементов при концентрациях меньших значения 10 центиля (состояние гипоэлементоза) принимается решение о дополнительном введении в рацион лимитированных элементов. Для эссенцильных элементов (Ca и др.) значения больше 90 центиля рассматриваются как состояние преддефицита и также корректируются дополнительным включением в рацион их источников. В случае превышения значений нормы по содержанию в шерсти животных токсических элементов (Al, As, Cd, Hg, Pb, Sn) на фоне гипоэлементоза по эссенциальным элементам первоначальные мероприятия по коррекции должны предусматривать выведения избытка токсических веществ из организма с последующей коррекцией рационов по эссенциальным элементам. Расчет дозировок сорбентов дополнительно вводимых при коррекции, химических элементов определяются нормами питания скорректированными с учетом размерности обменного пула в организме. Контроль эффективности мер по коррекции производится путем повторной оценки состава шерсти. Профилактика элементозов основывается на выше описанных принципах и формируется на основе ранее установленных индивидуальных и групповых характеристиках элементного статуса. База данных по апробации новой методики включает результаты шести экспериментов на крупном рогатом скоте. Использование методики позволило повысить воспроизводительную способность потомков импортированного скота; скорректировать бардасодержащие рационы и предложить для откорма минеральный премикс нового состава; оптимизировать элементный статус и снизить падеж телят; выявить интоксикацию тяжёлыми металлами и повысить воспроизводительную способность дойных коров. Выполнено построение математических моделей формирования элементного состава шерсти, учитывающих межэлементные взаимоотношения, что необходимо для осуществления предсказательного моделирования и объективной оценки пулов химических элементов в организме продуктивных животных. Математическая модель формировалась на основе построения обобщенной функции вектора состояния, оценивающей элементный состав шерсти животных с учетом межэлементных взаимодействий. При исследовании учитывалось отклонение среднего показателя содержания изучаемых элементов в пробах шерсти животного от усредненного показателя химического состава проб шерсти, которое наиболее соответствует общему элементному статусу организма животного. Разработанные алгоритмы предсказательного моделирования оценки пулов химических элементов в организме продуктивных животных перспективны для предиктивной аналитики биоэлементного статуса организма животных. В ходе исследований дана оценка биологических и продуктивных эффектов новых препаратов микроэлементов на основе наноматериалов. Создана база данных обобщающая результаты исследований на модели цыплят-бройлеров кросса «Смена 8». Показано, что НЧ Fe в сравнении с сульфатом железа в рационе молодняка птицы способствуют повышению переваримости питательных веществ корма после 2-3 недель применения. Сочетанное использование НЧ Fe с аргинином (креатином) обеспечивает повышение интенсивности роста цыплят-бройлеров на 7-8%, при повышении переваримости органического вещества корма и сырого протеина. В эксперименте описано влияние наночастиц –потенциальных препаратов микроэлементов на этологические показатели животных, дается оценка нейротропному действию. Предложен корм для птицы, включающий комплекс наночастиц Fe (d ≈80 нМ) и креатинин согласно разработанной дозировке для полнорационного комбикорма. Предложен способ повышения продуктивности крупного рогатого скота реализуемый через использование вновь разработанной методики выявления, коррекции и профилактики элементозов. Подана заявка на получение патента РФ на изобретение.