Аннотация результатов, полученных в 2014 году
Ишемический инсульт - один из основных факторов инвалидности и смерти людей. Острая фокальная ишемия вследствие закупорки кровеносных сосудов вызывает гибель клеток не только в ядре инфаркта, но и в окружающей переходной зоне (пенумбре). Нехватка кислорода и глюкозы за несколько минут приводит к отеку тканей и некрозу в ядре инфаркта. Повреждение пенумбры развивается медленнее, за несколько часов и дней, и это "терапевтическое окно" дает время для защиты клеток в этой зоне и уменьшения неврологических последствий. Мы провели гистологическое и электронно-микроскопическое исследование морфологических изменений в сенсомоторной коре мозга крысы через 1 и 4 часа после фототромботического инфаркта (ФТИ), вызванного локальным фотодинамическим воздействием. В этой модели инсульта после внутривенного введения гидрофильный фотосенсибилизатор бенгальский розовый не проникает в клетки, а накапливается в мелких сосудах мозга. Последующее локальное лазерное облучение вызывает интенсивную фотогенерацию высокотоксичного синглетного кислорода, окислительное повреждение эндотелия и базальной мембраны капилляров, агрегацию тромбоцитов и окклюзию микрососудов, которая приводит к ишемическому повреждению и инфаркту близлежащих нейронов и глиальных клеток. Морофологическое исследование показало, что диаметр ядра ФТИ составлял 2,9 и 3.5 мм, а его объем - 21 и 23 мм3 через 1 и 4 часа, соответственно. Ширина пенумбры была 1,7 и 1,4 мм. Эти величины статистически не различались. На оптическом и электронно-микроскопическом уровнях нами обнаружен ряд морфологических нарушений в ядре инфаркта и в пенумбре через 1 и 4 часа после ФТИ. Они включали вакуолизацию и отек тканей, появление гипохромных, гиперхромных и пикнотических нейронов, сужение просветов микрососудов и их окклюзию форменными элементами крови, нарушение структуры базальной мембраны капилляров, повреждения внутриклеточных органелл и конденсацию хроматина в ядрах нейронов. Эти изменения были особенно выражены в ядре ФТИ. В в пенумбре наблюдался градиент повреждений от сильных на границе с ядром ФТИ до слабых на границе с неповрежденной тканью. Эти изменения развивались во времени. По сравнению со структурой, наблюдавшейся через 1 час после ФТИ, через 4 часа повреждение нервной ткани существенно усиливалось в ядре инфаркта, но в пенумбре эта разница была сглажена, и структурные изменения отличались меньше. В результате протеомного исследования с помощью микрочипов Panorama Antibody Microarray – Cell Signaling выявили что в ткани пенумбры через 1 час после ФТИ уровень 20 белков превышает контрольный (кора контралатерального полушария) более, чем на 40%. В то же время уровень 19 белков был ниже контрольного в 1,4-3,1 раза. Согласно этим данным, в пенумбре одновременно протекали и нейродегенеративные, и нейропротекторные процессы, выражающиеся в повышении или понижении экспрессии различных сигнальных и нейроспецифических белков. К белкам первой группы, механизм повреждающего действия которых пока малоизвестен и которые следует изучить подробней, можно отнести PAR4. p35, p53, SMAC/DIABLO, ERK1 и кофилин.

Аннотация результатов, полученных в 2015 году
В настоящей работе продолжено исследование модели инсульта – фокального фототромботического инфаркта (ФТИ), индуцированного в коре мозга крысы локальным фотодинамическим воздействием. В ядре инфаркта очень быстро, за минуты развивается некроз, что исключает лечение. Но распространение повреждения на соседние области происходит в течение нескольких часов, что предполагает возможность защиты нервной ткани. Основная проблема – поиск нейропротекторов, способных ограничить распространение очага поражения. Для этого нужно больше знать о белках, участвующих в реакциях нервной ткани на повреждение. Мы провели протеомное, иммуногистохимическое и вестерн-блот исследования изменений профиля сигнальных и нейрональных белков в переходной зоне (пенумбре), окружающей некротическое ядро в коре мозга крысы, через 1 и 4 часа после ФТИ. С помощью протеомных микрочипов Panorama Antibody Microarray – Cell Signaling и Panorama Antibody Array – Neurobiology (Sigma-Aldrich) были изучены изменения экспрессии более 400 сигнальных и нейроспецифических белков в ткани пенумбры в коре мозга крысы по сравнению с необлученной контралатеральной корой в разные сроки после ФТИ. Через 1 час были выявлены, соответственно, 15 и 11 белков чей уровень в пенумбре повышался относительно контрольного, а также 22 и 14 белков, чей уровень понижался более, чем на 30%. Через 4 часа после ФТИ сверхэкспрессирующихся белков было больше: 50 и 26. Кроме того, показано, что уровень 24 и 26 белков понижался. По этим данным, в пенумбре одновременно протекали и нейродегенеративные, и нейропротекторные процессы, выражающиеся в повышении или понижении экспрессии различных сигнальных и нейроспецифических белков. Снижение уровня белков могло быть результатом их деструкции и протеолиза, а повышение – дополнительного синтеза в выживших клетках. Ранние изменения белкового профиля обнаруживались уже через 1 час после ФТИ, а через 4 часа изменения существенно усиливались и захватывали большую группу белков. На развитие апоптоза указывала повышенная экспрессия таких проапоптотических белков, как p53, p63, PAR4, JNK, p38, GADD153, NGFR p75, E2F1, PSR, SMAC/DIABLO, Bcl-10, Bcl-x, каспаз 3 и 6. Но одновременно повышался уровень противоапоптотических белков: рецепторов факторов роста EGFR и эстрогенов, протеинкиназы ERK5, фосфатазы MKP-1, белков p21Waf-1 и MDM2. Из сигнальных белков повышались уровни протеинкиназ PKBα и PKCα, PKCβ2, ERK1/2, p38 и JNK, MAPKAP2, RAF1, SGK, FAK и DYRK1A, протеинфосфатаз 1α и MKP-1; факторов транскрипции c-Myc, E2F1 и p53; кальмодулина и кальмодулин-зависимых киназ II и IV, кальретикулина, предшественника амилоида APP и никастрина, расщепляющего APP. Вместе с тем, снижался уровень Ca2+-связывающих белков VILIP-1, синаптотагмина, S-100, протеинкиназы С; понижалась экспрессия NF-κB-активирующей киназы NAK, компонентов сигнальных путей β-катенин/Wnt и Notch: FRAT1, NUMB, GSK-3 и аксина1. Деструкция и перестройки ткани были связаны со снижением уровня разных элементов цитоскелета – промежуточных волокон (цитокератины 7 и 19), микротрубочек (β-тубулин и его полиглутаминовая форма, связывающийся с микротрубочками белок дублекортин), а также актиновых нитей (нейрофиламент 68, O-гликированный нейрофиламент-M, эзрин, связывающий актиновый цитоскелет с биомембраной, и тропомиозин связывающий фибриллярный актин в сложную сеть). Однако также наблюдалось повышение экспрессии белков, функционально связанных с актиновым цитоскелетом: кофилина, вызывающего деполимеризацию актиновых нитей, миозина Vα, участвующего в транспорте органелл вдоль актиновых волокон в нейронах и глиальных клетках, актопаксина, образующего комплекс с фибриллярным актином, паксилином и внутренним доменом интегрина в точках адгезионных контактов. Также повышалась экспрессия ассоциированных с микротрубочками белков MAP1 и тау. Возможно, это было отражением восстановительных и репарационных процессов. На процессы, связанные с выживаемостью клеток и восстановлением ткани пенумбры, также указывает повышение уровня N-кадгерина, осуществляющего межклеточную адгезию, и катенина p120ctn, связывающего E- и N-кадгерины с актиновым цитоскелетом и сигнальными белками. Также увеличивалась экспрессия белка PMP22, участвующего в образовании миелиновой оболочки нервов. Повышение уровня навигационного белка NAV3, который направляет рост аксонов, белка CRMP2, компонента пути коллапсин/семафорин, который локализуется в конусах роста аксонов и направляет их при нейрогенезе также могло быть связано с восстановлением нервных связей. В пенумбре наблюдались разнонаправленные изменения транспортных процессов. Снижение уровня фактора ядерного транспорта NTF2 свидетельствовало о нарушении импорта цитоплазматических белков в ядро. Также нарушался везикулярный транспорт. Снижался уровень белков клатриновых пузырьков AP2β и AP2γ и адаптинов β1/2, участвующих в формировании везикул. Однако, при этом повышалась экспрессия белков везикул bCOP и белков TMP21 и MUNC18-3, регулирующих везикулярный транспорт между эндоплазматическим ретикулумом, аппаратом Гольджи и клеточной мембраной. Везикулярный транспорт играет центральную роль в синаптической передаче. Мы наблюдали снижение экспрессии синаптофизина, синаптотагмина и синтаксина, участвующих в докинге синаптических везикул, слиянии их с синаптической мембраной и выбросе нейромедиатора. Также уменьшался уровень транспортера дофамина, осуществляющего его обратный захват из синаптической щели. Но при этом повышалась экспрессия белков, участвующих в слиянии синаптических пузырьков с синаптической мембраной и высвобождении нейромедиатора: SNAP25, прионового белка и MUNC18-1. Аналогично, в пенумбре наблюдались разнонаправленные изменения экспрессии белков, участвующих в метаболизме нейромедиаторов. Снижался уровень, ферментов, участвующих в биосинтезе дофамина, норэпинефрина и эпинефрина: тирозингидроксилазы и L-DOPA декарбоксилазы. С другой стороны, повышался уровень моноаминоксидазы В, ответственной за дезаминирование серотонина и дофамина в дофаминэргических и серотонинэргических нейронах и астроцитах, триптофангидроксилазы и глутаматдекарбоксилазы, осуществляющих синтез серотонина и ГАМК. Результаты протеомных экспериментов показали торможение убиквитинового протеолиза. Повышение экспрессии N-концевого участка убиквитина-1, возможно, было результатом действия убиквитингидролазы L1 (UCHL1), разбирающей убиквитиновые цепочки на мономеры убиквитина. Уровень UCHL1 в ткани пенумбры повышался через 4 часа после ФТИ. Также отмечена сверхэкспрессия белка Nedd8, который, как и убиквитин, присоединяется в виде длинных цепочек к подлежащим протеолизу белкам. Система PINK1/Паркин осуществляет контроль качества митохондрий, убиквитинируя пришедшие в негодность белки и направляя их для протеасомной деградации. Это вызывает митофагию. Наблюдаемое повышение уровня этих белков свидетельствовало об активации митофагии. На снижение защитных механизмов указывало уменьшение экспрессии митохондриального антиоксидантного белка AOP-1, шаперонов HSP-70 и HSP-90. О снижении пролиферативной активности клеток мозга свидетельствовало уменьшение уровня Cdc-7 киназы, циклин-зависимой киназы Cdk6, топоизомеразы 1 и белка TDP-43, регулирующего транскрипцию, сплайсинг, транспорт и стабильность мРНК. Белки апоптоза обычно конститутивно присутствуют в клетках. При стимуляции апоптоза они активируются. Было известно, что для апоптоза необходим белковый синтез. Полученные данные показывают, какие белки при этом синтезируются. Для валидации результатов протеомных экспериментов мы провели иммуногистохимическое (ИГХ) и вестерн-блот исследование экспрессии МАО-В, UCHL11, PAR-4, кофилина, DYRK1A и Munc-18-3 в пенумбре через 1 и 4 часа после ФТИ. ИГХ и вестерн-блот исследования выявило увеличение экспрессии МАО-В в пенумбре через 4 часа после ФТИ, что согласуется с данными протеомного исследования. Повышение экспрессии UCHL1 в пенумбре после ФТИ также подтвердилось с помощью ИГХ и вестерн-блот анализа. Методом вестерн-блот нам не удалось выявить значимого повышения экспрессии белка Par-4 в пенумбре, но ИГХ анализ показал достоверное увеличение экспрессии этого белка через 1 и 4 часа после ФТИ. Вестерн-блот показал увеличение экспрессии кофилина в пенумбре через 1, но не 4 часа после ФТИ. ИГХ исследование выявило увеличение экспрессии кофилина через 1 и 4 часа после ФТИ, но только на границе ядра инфаркта и переходной зоны. И вестерн-блот, и ИГХ выявили сверхэкспрессию DYRK1A в пенумбре только через 4 часа после ФТИ, а изменения экспрессии Munc 18-3 - только через 1 час. Таким образом, результаты ИГХ и вестерн-блот экспериментов в целом подтвердили наблюдавшееся в протеомных исследованиях повышение уровня белков моноаминоксидазы B, UCHL1, PAR4, кофилина, DYRK1A и Munc-18-3 в ткани пенумбры через 1 и/или 4 часа после ФТИ. В модельных опытах in vitro на изолированном рецепторе растяжения рака было изучено влияние ингибиторов каспаз, белков c-Myc, ERK1/2, UCHL1 и MAO на выживаемость и смерть нейронов и глиальных клеток, вызванную фотодинамическим (ФД) воздействием. В этих опытах не было выявлено участия фактора белков с-Myc и ERK1/2 в ФД-индуцированной инактивации и смерти нейронов и глиальных клеток. Ингибирование каспаз с помощью пептида CPCI не влияло на ФД индуцированный некроз нейронов и глии, но в 3,5 раза снижало апоптоз. Это указывало на участие каспаз в апоптозе глиальных клеток. Аналогично, с помощью ингибиторов LDN-91946 и разалгина было показано участие UCHL1 в ФД-индуцированном некрозе и апоптозе глиальных клеток, но не нейронов. Это указывало на участие данных белков в ФД-индуцированном некрозе и апоптозе глии, но не нейронов рака. Таким образом, на основании протеомного анализа получены данные об экспрессии более 400 сигнальных и нейроспецифических белков в пенумбре по сравнению с тканью коры в контралатеральном полушарии мозга крысы через 4 часа после ФТИ. На основании иммуногистохимического и вестерн-блот исследований подтверждена повышенная экспрессия шести сигнальных белков (моноаминоксидазы B, убиквитингидролазы L1, PAR-4, кофилина, DYRK1A и Munc-18-3) в пенумбре через 1 и 4 часа после ФТИ. Также получены данные о влиянии ингибиторов каспаз, c-Myc, ERK1/2, UCHL1 и MAO на инактивацию и смерть нейронов и глиальных клеток рецептора растяжения рака, подвергнутого фотодинамическому воздействию. Эти данные позволят построить схему регуляторных процессов в нервной ткани, участвующих в нейродегенерации и нейропротекции в зоне пенумбры, выявить потенциальные маркеры этих процессов и молекулярные мишени, фармакологическое воздействие на которые может ограничить распространение инфаркта в пенумбре.

Аннотация результатов, полученных в 2016 году
В 2016 г. продолжено исследование экспериментальной модели ишемического инсульта – фокального фототромботического инсульта (ФТИ), вызванного в коре мозга крысы локальным фотодинамическим воздействием. Для получения информации о белках, участвующих в реакциях коры мозга на ишемическое повреждение, мы провели протеомное исследование экспрессии сигнальных и нейрональных белков в пенумбре в коре мозга крысы через 24 часа после ФТИ, а также иммуногистохимическое (ИГХ) и вестерн-блот (ВБ) исследования экспрессии некоторых белков через 1 и 4 часа после ФТИ. Влияние ингибиторов ряда белков на объем фототромботического инфаркта и морфологию ядра и пенумбры изучались через 3, 7 и 14 дней после ФТИ, когда эти эффекты более наглядно проявлялись. С помощью протеомных микрочипов Panorama Antibody Microarray – Cell Signaling и Panorama Antibody Array – Neurobiology (Sigma-Aldrich) изучены изменения экспрессии более 400 сигнальных и нейроспецифических белков в ткани пенумбры по сравнению с необлученной контралатеральной корой. Оказалось, что уровни 37 сигнальных и 10 нейрональных превышали контрольные, а уровни 22 сигнальных и 8 нейрональных белков были ниже. Эти белки выполняют разнообразные функции. Данные об изменениях их экспрессии представляют собой интегральную биохимическую характеристику, описывающую согласованные реакции различных клеточных подсистем ведущих либо к выживанию и восстановлению структуры и функций нервной ткани, либо к гибели клеток пенумбры. Одним из наиболее интересных эффектов было «концертное» повышение уровня различных белков, которые могут инициировать, опосредовать или регулировать апоптоз. Это белки, выполняющие программу апоптоза: SMAC/DIABLO, AIF, исполнительные каспазы 3, 6 и 7; проапоптотические сигнальные белки: Bcl-10, p75, факторы транскрипции, регулирующие экспрессию белков апоптоза: E2F1, р53, с-Муc и GADD153, а также многофункциональные белки, которые кроме других функций в определенных ситуациях вызывают апоптоз: Par4, глутаматный рецептор NMDAR2a, провоспалительная каспаза 11 и рецептор фосфатидилсерина PSR, участвующий в распознавании и удалении апоптотических клеток. Одним из ключевых игроков, которые определяют судьбу клеток, является фактор транскрипции E2F1. Кроме регуляции клеточного цикла, он индуцирует экспрессию ряда апоптотических белков, таких как SMAC/DIABLO, Apaf-1, BH3-only белки семейства Bcl-2, каспазы 3, 7, 8 и 9, белки p53 и p73. Его экспрессия контролируется белками р38 с-Мус, экспрессия которых тоже повышалась. Белок p53, известный инициатор апоптоза, стимулирует экспрессию p21WAF-1, MDM2 и каспазы 6. GADD153 индуцируется при повреждении ДНК и нарушениях клеточного деления. Он регулирует экспрессию ряда генов и может индуцировать апоптоз. Рецептор нейротрофических факторов p75 опосредует апоптоз нейронов. Глутаматный рецептор NMDAR2a индуцирует эксайтотоксические процессы, приводящие к апоптозу. Белки Par4 и DYRK1A гиперэкспрессируются при инсульте и нейродегенеративных заболеваниях и тоже индуцирует апоптоз. С другой стороны, снижение уровня нейропротекторного белка FRAT1также могло иметь нейротоксическое значение. Через 24 часа после ФТИ в пенумбре происходили не только проапоптотические, но и антиапоптотические процессы. Повышалась экспрессия ряда антиапоптотических белков: p63, p21WAF-1, MDM2, Bcl-x, антагониста р53, протеинкиназы ERK5, фосфатазы MAP киназы-1 (MKP-1) и рецептора эстрогенов. Белок р63 - антагонист р53. р21Waf-1 ингибирует р53-опосредованный апоптоз и останавливает деление клеток. Повышение его уровня при повреждении ДНК позволяет репарировать ДНК. Протеинкиназы ERK1/2 регулируют играют большую роль в устойчивости нервной ткани к ишемическому повреждению. Эстрогены активируют транскрипцию антиапоптотических белков Bcl-2 и Bcl-xL. MKP-1 дефосфорилирует проапоптотические белки JNK и p38 и регулирует активность. Протеинкиназа ERK5 участвует в нейропротекции, индуцированной нейротрофинами. Уровни белка S-100 и его β-цепи (S-100β) снижались в пенумбре через 24 часа после ФТИ. В наномолярном диапазоне он нейропротектор, хотя при микромолярных концентрациях может вызвать апоптоз. Протеинкиназа ATF2 регулирует дифференцировку, рост, реакции на стресс и иммунный ответ клеток. Повышение ее уровня направлено на выживаемость клеток. Убиквитин и Nedd8 участвуют в протеасомной деградации поврежденных белков. Убиквитингидролаза UCHL1 удаляет с белков убиквитиновую метку и поддерживает рециклизацию убиквитина, что стимулирует деградацию поврежденных белков. Повышение ее уровня и уровня белка Nedd8 направлено на расчистку нервной ткани от продуктов нейродегенерации. Убиквитинкиназа PINK1 контролирует качество митохондрий и защищает клетки от митохондриальной дисфункции. Ее сверхэкспрессия способствует нейропротекции. Гиперэкспрессия MAKAPK2 также защищала мозг после ишемии/реперфузии. Но уменьшение уровня шаперонов HSP-70 и HSP-90, которые восстанавливают фолдинг белков, свидетельствовало о снижении защитного потенциала клеток пенумбры. Снижение уровня белка TDP-43, который регулирует транскрипцию, сплайсинг, транспорт и стабильность мРНК, также не повышало выживание клеток. Интересно, что после ФТИ в пенумбре повышался уровень белка APP и никастрина, который расщепляет АРР и высвобождает β-амилоид, который участвует в развитии болезни Альцгеймера. Тут можно видеть сходные черты в патогенезе инсульта и болезни Альцгеймера. ФТИ вызывал изменения экспрессии ряда белков, регулирующих структуру и функции актинового цитоскелета и его взаимодействия с интегринами и кадгеринами, участвующими в адгезии клеток и взаимодействиях с другими клетками. Через 24 часа в пенумбре повышалась экспрессия α-катенина и катенина p120CTN, которые связывают кадгерины с актином регулируют архитектуру и динамику актинового цитоскелета.. Белок p35 в комплексе с Cdk5 участвует в связывании комплекса β-катенин/N-кадгерин с актиновым цитоскелетом. Повышение уровня актопаксина, который связывает интегрин с актиновыми нитями в точках фокальной адгезии связано с перестройками цитоскелета при адгезии, подвижности и делении клеток. Кофилин деполимеризует фибриллярный актин, что обеспечивает перестройки цитоскелета и подвижность клеток. Фокальные адгезионные киназы FAK и Pyk2 модулируют архитектуру цитоскелета, регулируют форму и подвижность клеток, их деление и гибель клеток. Миозин Vα участвует в транспорте везикул, органелл и мРНК вдоль актиновых волокон и в синаптической передаче. Снижение уровня спектрина (α+β), который выстилает плазматическую мембрану, поддерживает ее целостность и образует каркас для актинового цитоскелета, свидетельствовало о деструкции ткани пенумбры. Снижение уровня тропомиозина, который контролирует динамику актиновых нитей и форму клеток при миграции, формообразовании и цитокинезе также свидетельствовало о разрушении нервной ткани. Одновременно в пенумбре уменьшалась экспрессия других элементов клеточного скелета: микротрубочек и промежуточных волокон. Об этом говорит снижение уровней βIV-тубулина и полиглутаминовой формы β-тубулина, а также цитокератинов 7 и 19. О нарушениях везикулярного транспорта в пенумбре свидетельствовало снижение уровня белков клатриновых пузырьков AP2α, AP2β и AP2γ и адаптинов β1/2, участвующих в формировании везикул. Подавление клатрин-зависимого эндоцитоза и везикулярного транспорта повышает чувствительность клеток к эксайтотоксичности и нейродегенерации. Но в это же время повышался уровень белка β-COP, который формирует коатомерные пузырьки, транспортируемые между цистернами ЭР и комплекса Гольджи. Уровень синтаксина 8, участвующего в распознавании и слиянии везикул повышался в пенумбре после ФТИ. Это процессы активной деятельности клеток. Везикулярный транспорт играет ключевую роль в синаптической передаче. Мы обнаружили разнонаправленные изменения экспрессии синаптических белков в пенумбре. О подавлении синаптических процессов говорит снижение уровня синтаксина, синаптофизина и синаптотагмина, которые участвуют в слиянии синаптических везикул с синаптической мембраной и выбросе нейромедиатора. ФТИ вызывал разнонаправленные изменения экспрессии белков, участвующих в метаболизме различных нейромедиаторов. На подавление синтеза дофамина указывало снижение уровня тирозингидроксилазы и повышение экспресси моноаминоксидазы В. Одновременно повышался уровень триптофангидроксилазы, которая участвует в биосинтезе серотонина, и глутаматдекарбоксилазы, преобразующей L-глутамат в ГАМК. Таким образом, в пенумбре подавлялись дофаминергические, но активировались серотонинергические и ГАМКергические процессы. Также наблюдались разнонаправленные изменения регуляторов клеточного деления. С одной стороны, повышался уровень стимуляторов клеточного цикла с-Мус, E2F1, Cdk4 и циклина В1. С другой стороны, в пенумбре снижалась экспрессия Cdc7 киназы, которая участвует в инициации репликации ДНК, и топоизомеразы-1, участвующей в репликации ДНК. ИГХ и ВБ анализ показали, что экспрессия PINK1 в пенумбре повышалась через 1, но не 4 часа после ФТИ. Экспрессия паркина повышалась только через 4 часа. Повышение экспрессии PINK1 и паркина, вероятно, было направлено на защиту клеток пенумбры. Белок TMP21 участвует в везикулярном транспорте, а также тормозит расщепление APP и тем самым регулирует высвобождения β-амилоида. ИГХ и ВБ показали увеличение уровня TMP21 через 4 часа. но не через 1 час. Каспаза 3 интегрирует проапоптотические стимулы и активирует нижележащие белки апоптоза. ИГХ исследование показало повышение уровня каспазы 3 в пенумбре через 1-4 часа после ФТИ. ВБ анализ обнаружил повышение экспрессии каспазы 3 через 1, но не 4 часа после ФТИ. Белок Bcl-xL – элемент противоапоптозной защиты клеток. ИГХ и ВБ показали повышение его уровня в пенумбре через 4, но не 1 час, после ФТИ. Таким образом, в ткани пенумбры через 1 час происходил апоптоз, а противоапоптотические процессы развертывались через 4 часа. ИГХ и Вестерн-блот анализ выявили двукратное повышение уровня гистондеацетилазы HDAC-1 в пенумбре через 4 часа после ФТИ, которое приводит к эпигенетическому подавлению биосинтетических процессов. Окрашивание срезов мозга трифенилтетразолинхлоридом на 7 и 14 день после ФТИ четко выявляло локальный инфаркт нервной ткани в мозге мышей. Ингибиторы триптофангидроксилазы хлорофенилаланин, или DYRK1A гармин не изменяли объем инфаркта в эти сроки. Но ингибитор кофилина T56-LIMKi снижал объем инфаркта в 2,1 и 3,4 раза через 7 и 14 суток после ФТИ. Гистологическое исследование ткани мозга мышей проводили на 3, 7 и 14 сутки после ФТИ. Уже через 3 суток в контрольных (только ФТИ) и экспериментальных (ФТИ + ингибитор) группах в ядре инфаркта выявлялись многочисленные участки некроза. В пенумбре наблюдались перицеллюлярный отек нейроцитов, гипохромные нейроны с признаками прогрессирующего карио-плазмоцитолиза. Но количество нормохромных, гипохромных, гиперхромных и пикнотических клеток в экспериментальных группах с инъекциями T56-LIMKi, хлорофенилаланина или гармина не отличалось от контроля на 3 и 7 сутки после ФТИ. Через 14 суток во всех группах в ядре инфаркта и на его границах отмечались значительные скопления клеток глии, которые составляли основу глиомезодермального рубца. Но у мышей, получавших Т56-LIMKi, рубец был менее плотным. В области рубца и на его периферии наблюдалось значительное количество новообразованных капилляров. В областях пенумбры, прилегающих к ядру инфаркта, у животных контрольных групп или получавших хлорофенилаланин или гармин выявлены участки замещения нервной ткани соединительной тканью. Такие участки отсутствуют в пенумбре мышей, получавших Т56-LIMKi. Этот препарат способствовал увеличению числа нормохромных нейроцитов по сравнению с контрольными животными. Это подтверждает защитное, нейропротекторное действие ингибитора кофилина Т56-LIMKi на клетки пенумбры после ФТИ. Влияние ингибиторов кофилина, триптофангидроксилазы и DYRK1A на фотоинактивацию и смерть нейронов и глиальных клеток изучалось в опытах in vitro на примере изолированного рецептора растяжения рака. Ингибитор кофилина Т56-LIMKi не влиял на фотоиндуцированное прекращение нейронной активности и некроз нейронов, а также на апоптоз глии, но повышал процент некротических глиальных клеток. Напротив, ингибитор DYRK1A гармин снижал апоптоз глиальных клеток почти в 3,5 раза, хотя и не влиял на ФД-индуцированное нейронную активность и некроз нейронов и глии. При ингибитор триптофангидроксилазы хлорофенилаланин не влиял на фотоиндуцированный некроз нейронов и глии, а также на апоптоз глии. Но ускорял прекращение импульсации нейронов. Таким образом, использование протеомных микрочипов выявило несколько десятков белков, экспрессия которых была выше или ниже контрольной. Они принадлежали к разным клеточным подсистемам: про- и противоапоптотические белки, сигнальные белки, регуляторы клеточного цикла, метаболизма и клеточной защиты, белки цитоскелета, везикулярного транспорта, биосинтеза нейромедиаторов и синаптической передачи, протеолиза и т.д. В пенумбре одновременно протекали процессы нейродегенерации и нейропротекции. Возможно, разнонаправленные изменения были связаны с экспрессией белков в разных областях – вблизи ядра инфаркта, где доминируют процессы нейродегенерации или на периферии, где преобладают восстановительные процессы. Вероятно, судьба клеток пенумбры определяется балансом разнонаправленных реакций, ведущих либо к повреждению и смерти клеток, либо к репарации и восстановлению ткани. Задача нейропротекторной терапии инсульта - ограничить распространение повреждения и не допустить смещение границы смерть/жизнь от ядра инфаркта на периферию. Полученные дают интегральное представление о реакциях пенумбры на фототромботический инсульт. Многие из этих белков являются новыми или мало изученными в контексте развития инсульта и их роль необходимо более тщательно изучить. Это может открыть новые пути к нейропротекции. Возможно, некоторые из этих белков, чей уровень повышается или понижается в ткани пенумбры, могут служить потенциальными маркерами изменений при ишемическом инсульте и/или мишенями для терапевтического вмешательства. Так, опыты с ингибиторами показали перспективность ингибитора кофилина Т56-LIMKi для снижения объема инфаркта, вызванного в коре мозга фототромботическим воздействием.