КАРТОЧКА ПРОЕКТА,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ


Номер 14-15-00068

НазваниеИсследование внутриклеточных сигнальных процессов, контролирующих нейродегенерацию и нейропротекцию в пенумбре после локального фототромботического инфаркта в коре мозга крысы

РуководительУзденский Анатолий Борисович, Доктор биологических наук

Организация финансирования, регионфедеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Южный федеральный университет", Ростовская обл

Года выполнения при поддержке РНФ 2014 - 2016 

КонкурсКонкурс 2014 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами»

Область знания, основной код классификатора 05 - Фундаментальные исследования для медицины, 05-106 - Нейробиология

Ключевые словаинсульт, пенумбра, нейропротекция, нейродегенерация, внутриклеточная сигнализация, протеомика, морфология, фототромботический инфаркт, кора мозга

Код ГРНТИ34.15.43


СтатусУспешно завершен


 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ


Аннотация
В работе будет впервые проведено протеомное исследование изменений экспрессии более 200 сигнальных белков, регулирующих процессы пролиферации, дифференцировки, транскрипции, репарации ДНК, выживаемости и смерти клеток в пенумбре, окружающей ядро фототромботического инфаркта в коре головного мозга крысы, по сравнению с нормальной тканью коры мозга. Для решения этой задачи будут впервые использованы протеомные микрочипы, позволяющие одновременно изучить экспрессию нескольких сотен важнейших регуляторных белков в ткани пенумбры после локального инфаркта коры мозга. Валидация результатов протеомного исследования будет проведена методами иммуногистохимии и/или вестерн-блот. На основании полученных данных об изменении экспрессии ряда сигнальных белков будет выдвинута гипотеза об их возможной роли в процессах нейродегенерации или нейропротекции в ткани пенумбры и о потенциальной возможности защиты нервной ткани в пенумбре и ограничения распространения инфаркта с помощью модуляторов активности и/или экспрессии данных белков. Данные о потенциальных нейропротекторах, полученные на мозге крысы, будут проверены на механорецепторе рака, состоящем из одиночного идентифицированного нейрона, окруженного глиальной оболочкой, и подвергнутого фотодинамическому воздействию. Эти эксперименты на простом модельном объекте позволят определить направленность протекторных эффектов: на нервные, на глиальные клетки, или на те и другие. Достоинством запланированной работы является ее комплексные характер, включающий протеомное, иммуногистохимическое, биохимическое гистологическое и электронно-микроскопическое исследования.

Ожидаемые результаты
Ишемический инсульт (инфаркт мозга) – одна из ведущих причин смертности и инвалидности населения. Ограничение распространения зоны инфаркта – цель послеинсультной терапии. На сегодняшний день практически отсутствуют эффективные нейропротекторные лекарства, позволяющие защитить нервную ткань от вызванных инсультом повреждений. Для их разработки необходимо всестороннее и углубленное исследование механизмов нейродегенерации и нейропротекции. В настоящем проекте на модели локального фототромботического инфаркта коры головного мозга крысы планируется изучить структурно-биохимические изменения, развивающиеся в переходной зоне (пенумбре), окружающей ишемическое ядро. В работе планируется с помощью протеомных микрочипов получить новые данные об изменениях экспрессии более 200 сигнальных и нейроспецифических белков, регулирующих процессы пролиферации, дифференцировки, транскрипции, репарации ДНК, выживаемости и смерти клеток в пенумбре, окружающей ядро фототромботического инфаркта в коре головного мозга крысы, по сравнению с нормальной тканью коры мозга. Эти данные будут проверяться с помощью методов иммуногистохимии и/или вестерн-блот. Параллельно будут изучены морфологические изменения на светооптическом и ультраструктурных уровнях. На основании полученных данных будет выдвинута гипотеза о возможном участии выявленных сигнальных белков в процессах нейродегенерации или нейропротекции в ткани пенумбры и о потенциальной возможности защиты нервной ткани с помощью модуляторов активности и/или экспрессии данных белков. Данные о потенциальных нейропротекторах, полученные на мозге крысы, будут проверены в опытах на изолированном механорецепторе рака, состоящем из одиночного нейрона, окруженного глиальной оболочкой, окислительное повреждение которого развивается при фотодинамическом воздействии. Эти эксперименты на модельном объекте позволят определить направленность протекторных эффектов: на нервные, на глиальные клетки, или на те и другие. Результаты исследований, соответствующие мировому уровню, планируется опубликовать в 4 статьях, в том числе в 3 журналах, цитируемых в базах WEB of Science или Scopus и в 1 монографии.


 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ


Аннотация результатов, полученных в 2014 году
Ишемический инсульт - один из основных факторов инвалидности и смерти людей. Острая фокальная ишемия вследствие закупорки кровеносных сосудов вызывает гибель клеток не только в ядре инфаркта, но и в окружающей переходной зоне (пенумбре). Нехватка кислорода и глюкозы за несколько минут приводит к отеку тканей и некрозу в ядре инфаркта. Повреждение пенумбры развивается медленнее, за несколько часов и дней, и это "терапевтическое окно" дает время для защиты клеток в этой зоне и уменьшения неврологических последствий. Мы провели гистологическое и электронно-микроскопическое исследование морфологических изменений в сенсомоторной коре мозга крысы через 1 и 4 часа после фототромботического инфаркта (ФТИ), вызванного локальным фотодинамическим воздействием. В этой модели инсульта после внутривенного введения гидрофильный фотосенсибилизатор бенгальский розовый не проникает в клетки, а накапливается в мелких сосудах мозга. Последующее локальное лазерное облучение вызывает интенсивную фотогенерацию высокотоксичного синглетного кислорода, окислительное повреждение эндотелия и базальной мембраны капилляров, агрегацию тромбоцитов и окклюзию микрососудов, которая приводит к ишемическому повреждению и инфаркту близлежащих нейронов и глиальных клеток. Морофологическое исследование показало, что диаметр ядра ФТИ составлял 2,9 и 3.5 мм, а его объем - 21 и 23 мм3 через 1 и 4 часа, соответственно. Ширина пенумбры была 1,7 и 1,4 мм. Эти величины статистически не различались. На оптическом и электронно-микроскопическом уровнях нами обнаружен ряд морфологических нарушений в ядре инфаркта и в пенумбре через 1 и 4 часа после ФТИ. Они включали вакуолизацию и отек тканей, появление гипохромных, гиперхромных и пикнотических нейронов, сужение просветов микрососудов и их окклюзию форменными элементами крови, нарушение структуры базальной мембраны капилляров, повреждения внутриклеточных органелл и конденсацию хроматина в ядрах нейронов. Эти изменения были особенно выражены в ядре ФТИ. В в пенумбре наблюдался градиент повреждений от сильных на границе с ядром ФТИ до слабых на границе с неповрежденной тканью. Эти изменения развивались во времени. По сравнению со структурой, наблюдавшейся через 1 час после ФТИ, через 4 часа повреждение нервной ткани существенно усиливалось в ядре инфаркта, но в пенумбре эта разница была сглажена, и структурные изменения отличались меньше. В результате протеомного исследования с помощью микрочипов Panorama Antibody Microarray – Cell Signaling выявили что в ткани пенумбры через 1 час после ФТИ уровень 20 белков превышает контрольный (кора контралатерального полушария) более, чем на 40%. В то же время уровень 19 белков был ниже контрольного в 1,4-3,1 раза. Согласно этим данным, в пенумбре одновременно протекали и нейродегенеративные, и нейропротекторные процессы, выражающиеся в повышении или понижении экспрессии различных сигнальных и нейроспецифических белков. К белкам первой группы, механизм повреждающего действия которых пока малоизвестен и которые следует изучить подробней, можно отнести PAR4. p35, p53, SMAC/DIABLO, ERK1 и кофилин.

 

Публикации

1. A.B. Uzdensky, E.V. Berezhnaya, V.D. Kovaleva, M.A. Komandirov, M.A. Neginskaya, A.M. Khaitin, A.V. Rudkovskii, S.A. Sharifulina Protection of the crayfish mechanoreceptor neuron and surrounding glial cells from photooxidative injury by modulators of diverse signal transduction pathways Twelfth International Conference on Neuroprotective Agents. The Boar's Head Inn, Charlottesville, Virginia, USA, September 28 - October 3, 2014., p.40 (год публикации - 2014).

2. Andrej M. Khaitin, Mikhail V. Rudkovskii, Anatoly B. Uzdensky The method of isolation of the crayfish abdominal stretch receptor maintaining a connection of the sensory neuron to the ventral nerve cord ganglion Invertebrate Neuroscience, 2015 Mar;15(1):176? p.1-10 (год публикации - 2014).

3. Демьяненко С., Федоренко Г., Федоренко А., Узденский А. Фототромботический инсульт: ультраструктурный и протеомный анализ VII съезд Российского фотобиологического общества. Пос. Шепси, 14-20 сентября 2014 г. Материалы съезда.Пущино, 2014,, с.72 (год публикации - 2014).

4. Демьяненко С.В., Федоренко Г.М., Узденский А.Б. Профиль нейрональных и сигнальных белков в пенумбре после локального инфаркта в коре мозга крыс. IV Междунар. Науч.-Практ. Конф. Постгеномные методы анализа в биологии, лабораторной и клинической медицине. Казань, Россия, 29 Октября – 1 Ноября, 2014,, S03-06. с.67 (год публикации - 2014).


Аннотация результатов, полученных в 2015 году
В настоящей работе продолжено исследование модели инсульта – фокального фототромботического инфаркта (ФТИ), индуцированного в коре мозга крысы локальным фотодинамическим воздействием. В ядре инфаркта очень быстро, за минуты развивается некроз, что исключает лечение. Но распространение повреждения на соседние области происходит в течение нескольких часов, что предполагает возможность защиты нервной ткани. Основная проблема – поиск нейропротекторов, способных ограничить распространение очага поражения. Для этого нужно больше знать о белках, участвующих в реакциях нервной ткани на повреждение. Мы провели протеомное, иммуногистохимическое и вестерн-блот исследования изменений профиля сигнальных и нейрональных белков в переходной зоне (пенумбре), окружающей некротическое ядро в коре мозга крысы, через 1 и 4 часа после ФТИ. С помощью протеомных микрочипов Panorama Antibody Microarray – Cell Signaling и Panorama Antibody Array – Neurobiology (Sigma-Aldrich) были изучены изменения экспрессии более 400 сигнальных и нейроспецифических белков в ткани пенумбры в коре мозга крысы по сравнению с необлученной контралатеральной корой в разные сроки после ФТИ. Через 1 час были выявлены, соответственно, 15 и 11 белков чей уровень в пенумбре повышался относительно контрольного, а также 22 и 14 белков, чей уровень понижался более, чем на 30%. Через 4 часа после ФТИ сверхэкспрессирующихся белков было больше: 50 и 26. Кроме того, показано, что уровень 24 и 26 белков понижался. По этим данным, в пенумбре одновременно протекали и нейродегенеративные, и нейропротекторные процессы, выражающиеся в повышении или понижении экспрессии различных сигнальных и нейроспецифических белков. Снижение уровня белков могло быть результатом их деструкции и протеолиза, а повышение – дополнительного синтеза в выживших клетках. Ранние изменения белкового профиля обнаруживались уже через 1 час после ФТИ, а через 4 часа изменения существенно усиливались и захватывали большую группу белков. На развитие апоптоза указывала повышенная экспрессия таких проапоптотических белков, как p53, p63, PAR4, JNK, p38, GADD153, NGFR p75, E2F1, PSR, SMAC/DIABLO, Bcl-10, Bcl-x, каспаз 3 и 6. Но одновременно повышался уровень противоапоптотических белков: рецепторов факторов роста EGFR и эстрогенов, протеинкиназы ERK5, фосфатазы MKP-1, белков p21Waf-1 и MDM2. Из сигнальных белков повышались уровни протеинкиназ PKBα и PKCα, PKCβ2, ERK1/2, p38 и JNK, MAPKAP2, RAF1, SGK, FAK и DYRK1A, протеинфосфатаз 1α и MKP-1; факторов транскрипции c-Myc, E2F1 и p53; кальмодулина и кальмодулин-зависимых киназ II и IV, кальретикулина, предшественника амилоида APP и никастрина, расщепляющего APP. Вместе с тем, снижался уровень Ca2+-связывающих белков VILIP-1, синаптотагмина, S-100, протеинкиназы С; понижалась экспрессия NF-κB-активирующей киназы NAK, компонентов сигнальных путей β-катенин/Wnt и Notch: FRAT1, NUMB, GSK-3 и аксина1. Деструкция и перестройки ткани были связаны со снижением уровня разных элементов цитоскелета – промежуточных волокон (цитокератины 7 и 19), микротрубочек (β-тубулин и его полиглутаминовая форма, связывающийся с микротрубочками белок дублекортин), а также актиновых нитей (нейрофиламент 68, O-гликированный нейрофиламент-M, эзрин, связывающий актиновый цитоскелет с биомембраной, и тропомиозин связывающий фибриллярный актин в сложную сеть). Однако также наблюдалось повышение экспрессии белков, функционально связанных с актиновым цитоскелетом: кофилина, вызывающего деполимеризацию актиновых нитей, миозина Vα, участвующего в транспорте органелл вдоль актиновых волокон в нейронах и глиальных клетках, актопаксина, образующего комплекс с фибриллярным актином, паксилином и внутренним доменом интегрина в точках адгезионных контактов. Также повышалась экспрессия ассоциированных с микротрубочками белков MAP1 и тау. Возможно, это было отражением восстановительных и репарационных процессов. На процессы, связанные с выживаемостью клеток и восстановлением ткани пенумбры, также указывает повышение уровня N-кадгерина, осуществляющего межклеточную адгезию, и катенина p120ctn, связывающего E- и N-кадгерины с актиновым цитоскелетом и сигнальными белками. Также увеличивалась экспрессия белка PMP22, участвующего в образовании миелиновой оболочки нервов. Повышение уровня навигационного белка NAV3, который направляет рост аксонов, белка CRMP2, компонента пути коллапсин/семафорин, который локализуется в конусах роста аксонов и направляет их при нейрогенезе также могло быть связано с восстановлением нервных связей. В пенумбре наблюдались разнонаправленные изменения транспортных процессов. Снижение уровня фактора ядерного транспорта NTF2 свидетельствовало о нарушении импорта цитоплазматических белков в ядро. Также нарушался везикулярный транспорт. Снижался уровень белков клатриновых пузырьков AP2β и AP2γ и адаптинов β1/2, участвующих в формировании везикул. Однако, при этом повышалась экспрессия белков везикул bCOP и белков TMP21 и MUNC18-3, регулирующих везикулярный транспорт между эндоплазматическим ретикулумом, аппаратом Гольджи и клеточной мембраной. Везикулярный транспорт играет центральную роль в синаптической передаче. Мы наблюдали снижение экспрессии синаптофизина, синаптотагмина и синтаксина, участвующих в докинге синаптических везикул, слиянии их с синаптической мембраной и выбросе нейромедиатора. Также уменьшался уровень транспортера дофамина, осуществляющего его обратный захват из синаптической щели. Но при этом повышалась экспрессия белков, участвующих в слиянии синаптических пузырьков с синаптической мембраной и высвобождении нейромедиатора: SNAP25, прионового белка и MUNC18-1. Аналогично, в пенумбре наблюдались разнонаправленные изменения экспрессии белков, участвующих в метаболизме нейромедиаторов. Снижался уровень, ферментов, участвующих в биосинтезе дофамина, норэпинефрина и эпинефрина: тирозингидроксилазы и L-DOPA декарбоксилазы. С другой стороны, повышался уровень моноаминоксидазы В, ответственной за дезаминирование серотонина и дофамина в дофаминэргических и серотонинэргических нейронах и астроцитах, триптофангидроксилазы и глутаматдекарбоксилазы, осуществляющих синтез серотонина и ГАМК. Результаты протеомных экспериментов показали торможение убиквитинового протеолиза. Повышение экспрессии N-концевого участка убиквитина-1, возможно, было результатом действия убиквитингидролазы L1 (UCHL1), разбирающей убиквитиновые цепочки на мономеры убиквитина. Уровень UCHL1 в ткани пенумбры повышался через 4 часа после ФТИ. Также отмечена сверхэкспрессия белка Nedd8, который, как и убиквитин, присоединяется в виде длинных цепочек к подлежащим протеолизу белкам. Система PINK1/Паркин осуществляет контроль качества митохондрий, убиквитинируя пришедшие в негодность белки и направляя их для протеасомной деградации. Это вызывает митофагию. Наблюдаемое повышение уровня этих белков свидетельствовало об активации митофагии. На снижение защитных механизмов указывало уменьшение экспрессии митохондриального антиоксидантного белка AOP-1, шаперонов HSP-70 и HSP-90. О снижении пролиферативной активности клеток мозга свидетельствовало уменьшение уровня Cdc-7 киназы, циклин-зависимой киназы Cdk6, топоизомеразы 1 и белка TDP-43, регулирующего транскрипцию, сплайсинг, транспорт и стабильность мРНК. Белки апоптоза обычно конститутивно присутствуют в клетках. При стимуляции апоптоза они активируются. Было известно, что для апоптоза необходим белковый синтез. Полученные данные показывают, какие белки при этом синтезируются. Для валидации результатов протеомных экспериментов мы провели иммуногистохимическое (ИГХ) и вестерн-блот исследование экспрессии МАО-В, UCHL11, PAR-4, кофилина, DYRK1A и Munc-18-3 в пенумбре через 1 и 4 часа после ФТИ. ИГХ и вестерн-блот исследования выявило увеличение экспрессии МАО-В в пенумбре через 4 часа после ФТИ, что согласуется с данными протеомного исследования. Повышение экспрессии UCHL1 в пенумбре после ФТИ также подтвердилось с помощью ИГХ и вестерн-блот анализа. Методом вестерн-блот нам не удалось выявить значимого повышения экспрессии белка Par-4 в пенумбре, но ИГХ анализ показал достоверное увеличение экспрессии этого белка через 1 и 4 часа после ФТИ. Вестерн-блот показал увеличение экспрессии кофилина в пенумбре через 1, но не 4 часа после ФТИ. ИГХ исследование выявило увеличение экспрессии кофилина через 1 и 4 часа после ФТИ, но только на границе ядра инфаркта и переходной зоны. И вестерн-блот, и ИГХ выявили сверхэкспрессию DYRK1A в пенумбре только через 4 часа после ФТИ, а изменения экспрессии Munc 18-3 - только через 1 час. Таким образом, результаты ИГХ и вестерн-блот экспериментов в целом подтвердили наблюдавшееся в протеомных исследованиях повышение уровня белков моноаминоксидазы B, UCHL1, PAR4, кофилина, DYRK1A и Munc-18-3 в ткани пенумбры через 1 и/или 4 часа после ФТИ. В модельных опытах in vitro на изолированном рецепторе растяжения рака было изучено влияние ингибиторов каспаз, белков c-Myc, ERK1/2, UCHL1 и MAO на выживаемость и смерть нейронов и глиальных клеток, вызванную фотодинамическим (ФД) воздействием. В этих опытах не было выявлено участия фактора белков с-Myc и ERK1/2 в ФД-индуцированной инактивации и смерти нейронов и глиальных клеток. Ингибирование каспаз с помощью пептида CPCI не влияло на ФД индуцированный некроз нейронов и глии, но в 3,5 раза снижало апоптоз. Это указывало на участие каспаз в апоптозе глиальных клеток. Аналогично, с помощью ингибиторов LDN-91946 и разалгина было показано участие UCHL1 в ФД-индуцированном некрозе и апоптозе глиальных клеток, но не нейронов. Это указывало на участие данных белков в ФД-индуцированном некрозе и апоптозе глии, но не нейронов рака. Таким образом, на основании протеомного анализа получены данные об экспрессии более 400 сигнальных и нейроспецифических белков в пенумбре по сравнению с тканью коры в контралатеральном полушарии мозга крысы через 4 часа после ФТИ. На основании иммуногистохимического и вестерн-блот исследований подтверждена повышенная экспрессия шести сигнальных белков (моноаминоксидазы B, убиквитингидролазы L1, PAR-4, кофилина, DYRK1A и Munc-18-3) в пенумбре через 1 и 4 часа после ФТИ. Также получены данные о влиянии ингибиторов каспаз, c-Myc, ERK1/2, UCHL1 и MAO на инактивацию и смерть нейронов и глиальных клеток рецептора растяжения рака, подвергнутого фотодинамическому воздействию. Эти данные позволят построить схему регуляторных процессов в нервной ткани, участвующих в нейродегенерации и нейропротекции в зоне пенумбры, выявить потенциальные маркеры этих процессов и молекулярные мишени, фармакологическое воздействие на которые может ограничить распространение инфаркта в пенумбре.

 

Публикации

1. A. Uzdensky, S. Demyanenko Protein profiling in penumbra after local photothrombotic infarction in the rat cerebral cortex. Glia, 2015, v.63, S1, E263-E264. (год публикации - 2015).

2. Demyanenko S.V., Fedorenko G.M. Uzdensky A.B. Expression of neuronal and signaling proteins and morphological changes in penumbra after local photothrombotic infarct in the rat cerebral cortex 16th Congress of the European Society for Photobiology/ August 31-September 4, 2015, Aveiro, Portugal. Programme and book of abstracts, p.83 (год публикации - 2015).

3. S. V. Demyanenko, S. N. Panchenko, and A. B. Uzdensky Expression of Neuronal and Signaling Proteins in Penumbra around a Photothrombotic Infarction Core in Rat Cerebral Cortex. Biochemistry (Moscow), 2015, Vol. 80, No. 6, pp. 790-799 (год публикации - 2015).

4. Uzdensky A., Demyanenko S., Fedorenko G. Protein profiling in penumbra after local phototrombotic infarction in the rat cerebral cortex. EMBO/EMBL Symposium. Mechanisms of Neurodegeneration. Heidelberg, Germany, 14-17 June 2015, p.283 (год публикации - 2015).

5. Uzdensky AB, Berezhnaya E, Kovaleva V, Neginskaya M, Rudkovskii M, Sharifulina S. Photodynamic therapy: a review of applications in neurooncology and neuropathology. Journal of Biomedical Optics, 2015 Jun;20(6):61108.page 061108-1 - 061108-7 (год публикации - 2015).

6. Демьяненко С.В., Узденский А.Б. Экспрессия сигнальных и нейрональных белков в пенумбре после локального фототромботического инфаркта коры головного мозга крысы. Мат. Междунар. Науч.-практ. Конф. Актуальные проблемы биологии, нанотехнологий и медицины. Ростов-на-Дону, 01-03 октября 2015, Ростов-на-Дону, 247-248 (год публикации - 2015).

7. Демьяненко С.В., Узденский А.Б. Экспрессия нейрональных белков в пенумбре после локального фототромботического инфаркта в коре головного мозга крыс V съезд биофизиков России. 4-10 октября 2015г. Ростов-на-Дону. Материалы докладов. Изд. Южного федерального университета, Т.1, с.353 (год публикации - 2015).


Аннотация результатов, полученных в 2016 году
В 2016 г. продолжено исследование экспериментальной модели ишемического инсульта – фокального фототромботического инсульта (ФТИ), вызванного в коре мозга крысы локальным фотодинамическим воздействием. Для получения информации о белках, участвующих в реакциях коры мозга на ишемическое повреждение, мы провели протеомное исследование экспрессии сигнальных и нейрональных белков в пенумбре в коре мозга крысы через 24 часа после ФТИ, а также иммуногистохимическое (ИГХ) и вестерн-блот (ВБ) исследования экспрессии некоторых белков через 1 и 4 часа после ФТИ. Влияние ингибиторов ряда белков на объем фототромботического инфаркта и морфологию ядра и пенумбры изучались через 3, 7 и 14 дней после ФТИ, когда эти эффекты более наглядно проявлялись. С помощью протеомных микрочипов Panorama Antibody Microarray – Cell Signaling и Panorama Antibody Array – Neurobiology (Sigma-Aldrich) изучены изменения экспрессии более 400 сигнальных и нейроспецифических белков в ткани пенумбры по сравнению с необлученной контралатеральной корой. Оказалось, что уровни 37 сигнальных и 10 нейрональных превышали контрольные, а уровни 22 сигнальных и 8 нейрональных белков были ниже. Эти белки выполняют разнообразные функции. Данные об изменениях их экспрессии представляют собой интегральную биохимическую характеристику, описывающую согласованные реакции различных клеточных подсистем ведущих либо к выживанию и восстановлению структуры и функций нервной ткани, либо к гибели клеток пенумбры. Одним из наиболее интересных эффектов было «концертное» повышение уровня различных белков, которые могут инициировать, опосредовать или регулировать апоптоз. Это белки, выполняющие программу апоптоза: SMAC/DIABLO, AIF, исполнительные каспазы 3, 6 и 7; проапоптотические сигнальные белки: Bcl-10, p75, факторы транскрипции, регулирующие экспрессию белков апоптоза: E2F1, р53, с-Муc и GADD153, а также многофункциональные белки, которые кроме других функций в определенных ситуациях вызывают апоптоз: Par4, глутаматный рецептор NMDAR2a, провоспалительная каспаза 11 и рецептор фосфатидилсерина PSR, участвующий в распознавании и удалении апоптотических клеток. Одним из ключевых игроков, которые определяют судьбу клеток, является фактор транскрипции E2F1. Кроме регуляции клеточного цикла, он индуцирует экспрессию ряда апоптотических белков, таких как SMAC/DIABLO, Apaf-1, BH3-only белки семейства Bcl-2, каспазы 3, 7, 8 и 9, белки p53 и p73. Его экспрессия контролируется белками р38 с-Мус, экспрессия которых тоже повышалась. Белок p53, известный инициатор апоптоза, стимулирует экспрессию p21WAF-1, MDM2 и каспазы 6. GADD153 индуцируется при повреждении ДНК и нарушениях клеточного деления. Он регулирует экспрессию ряда генов и может индуцировать апоптоз. Рецептор нейротрофических факторов p75 опосредует апоптоз нейронов. Глутаматный рецептор NMDAR2a индуцирует эксайтотоксические процессы, приводящие к апоптозу. Белки Par4 и DYRK1A гиперэкспрессируются при инсульте и нейродегенеративных заболеваниях и тоже индуцирует апоптоз. С другой стороны, снижение уровня нейропротекторного белка FRAT1также могло иметь нейротоксическое значение. Через 24 часа после ФТИ в пенумбре происходили не только проапоптотические, но и антиапоптотические процессы. Повышалась экспрессия ряда антиапоптотических белков: p63, p21WAF-1, MDM2, Bcl-x, антагониста р53, протеинкиназы ERK5, фосфатазы MAP киназы-1 (MKP-1) и рецептора эстрогенов. Белок р63 - антагонист р53. р21Waf-1 ингибирует р53-опосредованный апоптоз и останавливает деление клеток. Повышение его уровня при повреждении ДНК позволяет репарировать ДНК. Протеинкиназы ERK1/2 регулируют играют большую роль в устойчивости нервной ткани к ишемическому повреждению. Эстрогены активируют транскрипцию антиапоптотических белков Bcl-2 и Bcl-xL. MKP-1 дефосфорилирует проапоптотические белки JNK и p38 и регулирует активность. Протеинкиназа ERK5 участвует в нейропротекции, индуцированной нейротрофинами. Уровни белка S-100 и его β-цепи (S-100β) снижались в пенумбре через 24 часа после ФТИ. В наномолярном диапазоне он нейропротектор, хотя при микромолярных концентрациях может вызвать апоптоз. Протеинкиназа ATF2 регулирует дифференцировку, рост, реакции на стресс и иммунный ответ клеток. Повышение ее уровня направлено на выживаемость клеток. Убиквитин и Nedd8 участвуют в протеасомной деградации поврежденных белков. Убиквитингидролаза UCHL1 удаляет с белков убиквитиновую метку и поддерживает рециклизацию убиквитина, что стимулирует деградацию поврежденных белков. Повышение ее уровня и уровня белка Nedd8 направлено на расчистку нервной ткани от продуктов нейродегенерации. Убиквитинкиназа PINK1 контролирует качество митохондрий и защищает клетки от митохондриальной дисфункции. Ее сверхэкспрессия способствует нейропротекции. Гиперэкспрессия MAKAPK2 также защищала мозг после ишемии/реперфузии. Но уменьшение уровня шаперонов HSP-70 и HSP-90, которые восстанавливают фолдинг белков, свидетельствовало о снижении защитного потенциала клеток пенумбры. Снижение уровня белка TDP-43, который регулирует транскрипцию, сплайсинг, транспорт и стабильность мРНК, также не повышало выживание клеток. Интересно, что после ФТИ в пенумбре повышался уровень белка APP и никастрина, который расщепляет АРР и высвобождает β-амилоид, который участвует в развитии болезни Альцгеймера. Тут можно видеть сходные черты в патогенезе инсульта и болезни Альцгеймера. ФТИ вызывал изменения экспрессии ряда белков, регулирующих структуру и функции актинового цитоскелета и его взаимодействия с интегринами и кадгеринами, участвующими в адгезии клеток и взаимодействиях с другими клетками. Через 24 часа в пенумбре повышалась экспрессия α-катенина и катенина p120CTN, которые связывают кадгерины с актином регулируют архитектуру и динамику актинового цитоскелета.. Белок p35 в комплексе с Cdk5 участвует в связывании комплекса β-катенин/N-кадгерин с актиновым цитоскелетом. Повышение уровня актопаксина, который связывает интегрин с актиновыми нитями в точках фокальной адгезии связано с перестройками цитоскелета при адгезии, подвижности и делении клеток. Кофилин деполимеризует фибриллярный актин, что обеспечивает перестройки цитоскелета и подвижность клеток. Фокальные адгезионные киназы FAK и Pyk2 модулируют архитектуру цитоскелета, регулируют форму и подвижность клеток, их деление и гибель клеток. Миозин Vα участвует в транспорте везикул, органелл и мРНК вдоль актиновых волокон и в синаптической передаче. Снижение уровня спектрина (α+β), который выстилает плазматическую мембрану, поддерживает ее целостность и образует каркас для актинового цитоскелета, свидетельствовало о деструкции ткани пенумбры. Снижение уровня тропомиозина, который контролирует динамику актиновых нитей и форму клеток при миграции, формообразовании и цитокинезе также свидетельствовало о разрушении нервной ткани. Одновременно в пенумбре уменьшалась экспрессия других элементов клеточного скелета: микротрубочек и промежуточных волокон. Об этом говорит снижение уровней βIV-тубулина и полиглутаминовой формы β-тубулина, а также цитокератинов 7 и 19. О нарушениях везикулярного транспорта в пенумбре свидетельствовало снижение уровня белков клатриновых пузырьков AP2α, AP2β и AP2γ и адаптинов β1/2, участвующих в формировании везикул. Подавление клатрин-зависимого эндоцитоза и везикулярного транспорта повышает чувствительность клеток к эксайтотоксичности и нейродегенерации. Но в это же время повышался уровень белка β-COP, который формирует коатомерные пузырьки, транспортируемые между цистернами ЭР и комплекса Гольджи. Уровень синтаксина 8, участвующего в распознавании и слиянии везикул повышался в пенумбре после ФТИ. Это процессы активной деятельности клеток. Везикулярный транспорт играет ключевую роль в синаптической передаче. Мы обнаружили разнонаправленные изменения экспрессии синаптических белков в пенумбре. О подавлении синаптических процессов говорит снижение уровня синтаксина, синаптофизина и синаптотагмина, которые участвуют в слиянии синаптических везикул с синаптической мембраной и выбросе нейромедиатора. ФТИ вызывал разнонаправленные изменения экспрессии белков, участвующих в метаболизме различных нейромедиаторов. На подавление синтеза дофамина указывало снижение уровня тирозингидроксилазы и повышение экспресси моноаминоксидазы В. Одновременно повышался уровень триптофангидроксилазы, которая участвует в биосинтезе серотонина, и глутаматдекарбоксилазы, преобразующей L-глутамат в ГАМК. Таким образом, в пенумбре подавлялись дофаминергические, но активировались серотонинергические и ГАМКергические процессы. Также наблюдались разнонаправленные изменения регуляторов клеточного деления. С одной стороны, повышался уровень стимуляторов клеточного цикла с-Мус, E2F1, Cdk4 и циклина В1. С другой стороны, в пенумбре снижалась экспрессия Cdc7 киназы, которая участвует в инициации репликации ДНК, и топоизомеразы-1, участвующей в репликации ДНК. ИГХ и ВБ анализ показали, что экспрессия PINK1 в пенумбре повышалась через 1, но не 4 часа после ФТИ. Экспрессия паркина повышалась только через 4 часа. Повышение экспрессии PINK1 и паркина, вероятно, было направлено на защиту клеток пенумбры. Белок TMP21 участвует в везикулярном транспорте, а также тормозит расщепление APP и тем самым регулирует высвобождения β-амилоида. ИГХ и ВБ показали увеличение уровня TMP21 через 4 часа. но не через 1 час. Каспаза 3 интегрирует проапоптотические стимулы и активирует нижележащие белки апоптоза. ИГХ исследование показало повышение уровня каспазы 3 в пенумбре через 1-4 часа после ФТИ. ВБ анализ обнаружил повышение экспрессии каспазы 3 через 1, но не 4 часа после ФТИ. Белок Bcl-xL – элемент противоапоптозной защиты клеток. ИГХ и ВБ показали повышение его уровня в пенумбре через 4, но не 1 час, после ФТИ. Таким образом, в ткани пенумбры через 1 час происходил апоптоз, а противоапоптотические процессы развертывались через 4 часа. ИГХ и Вестерн-блот анализ выявили двукратное повышение уровня гистондеацетилазы HDAC-1 в пенумбре через 4 часа после ФТИ, которое приводит к эпигенетическому подавлению биосинтетических процессов. Окрашивание срезов мозга трифенилтетразолинхлоридом на 7 и 14 день после ФТИ четко выявляло локальный инфаркт нервной ткани в мозге мышей. Ингибиторы триптофангидроксилазы хлорофенилаланин, или DYRK1A гармин не изменяли объем инфаркта в эти сроки. Но ингибитор кофилина T56-LIMKi снижал объем инфаркта в 2,1 и 3,4 раза через 7 и 14 суток после ФТИ. Гистологическое исследование ткани мозга мышей проводили на 3, 7 и 14 сутки после ФТИ. Уже через 3 суток в контрольных (только ФТИ) и экспериментальных (ФТИ + ингибитор) группах в ядре инфаркта выявлялись многочисленные участки некроза. В пенумбре наблюдались перицеллюлярный отек нейроцитов, гипохромные нейроны с признаками прогрессирующего карио-плазмоцитолиза. Но количество нормохромных, гипохромных, гиперхромных и пикнотических клеток в экспериментальных группах с инъекциями T56-LIMKi, хлорофенилаланина или гармина не отличалось от контроля на 3 и 7 сутки после ФТИ. Через 14 суток во всех группах в ядре инфаркта и на его границах отмечались значительные скопления клеток глии, которые составляли основу глиомезодермального рубца. Но у мышей, получавших Т56-LIMKi, рубец был менее плотным. В области рубца и на его периферии наблюдалось значительное количество новообразованных капилляров. В областях пенумбры, прилегающих к ядру инфаркта, у животных контрольных групп или получавших хлорофенилаланин или гармин выявлены участки замещения нервной ткани соединительной тканью. Такие участки отсутствуют в пенумбре мышей, получавших Т56-LIMKi. Этот препарат способствовал увеличению числа нормохромных нейроцитов по сравнению с контрольными животными. Это подтверждает защитное, нейропротекторное действие ингибитора кофилина Т56-LIMKi на клетки пенумбры после ФТИ. Влияние ингибиторов кофилина, триптофангидроксилазы и DYRK1A на фотоинактивацию и смерть нейронов и глиальных клеток изучалось в опытах in vitro на примере изолированного рецептора растяжения рака. Ингибитор кофилина Т56-LIMKi не влиял на фотоиндуцированное прекращение нейронной активности и некроз нейронов, а также на апоптоз глии, но повышал процент некротических глиальных клеток. Напротив, ингибитор DYRK1A гармин снижал апоптоз глиальных клеток почти в 3,5 раза, хотя и не влиял на ФД-индуцированное нейронную активность и некроз нейронов и глии. При ингибитор триптофангидроксилазы хлорофенилаланин не влиял на фотоиндуцированный некроз нейронов и глии, а также на апоптоз глии. Но ускорял прекращение импульсации нейронов. Таким образом, использование протеомных микрочипов выявило несколько десятков белков, экспрессия которых была выше или ниже контрольной. Они принадлежали к разным клеточным подсистемам: про- и противоапоптотические белки, сигнальные белки, регуляторы клеточного цикла, метаболизма и клеточной защиты, белки цитоскелета, везикулярного транспорта, биосинтеза нейромедиаторов и синаптической передачи, протеолиза и т.д. В пенумбре одновременно протекали процессы нейродегенерации и нейропротекции. Возможно, разнонаправленные изменения были связаны с экспрессией белков в разных областях – вблизи ядра инфаркта, где доминируют процессы нейродегенерации или на периферии, где преобладают восстановительные процессы. Вероятно, судьба клеток пенумбры определяется балансом разнонаправленных реакций, ведущих либо к повреждению и смерти клеток, либо к репарации и восстановлению ткани. Задача нейропротекторной терапии инсульта - ограничить распространение повреждения и не допустить смещение границы смерть/жизнь от ядра инфаркта на периферию. Полученные дают интегральное представление о реакциях пенумбры на фототромботический инсульт. Многие из этих белков являются новыми или мало изученными в контексте развития инсульта и их роль необходимо более тщательно изучить. Это может открыть новые пути к нейропротекции. Возможно, некоторые из этих белков, чей уровень повышается или понижается в ткани пенумбры, могут служить потенциальными маркерами изменений при ишемическом инсульте и/или мишенями для терапевтического вмешательства. Так, опыты с ингибиторами показали перспективность ингибитора кофилина Т56-LIMKi для снижения объема инфаркта, вызванного в коре мозга фототромботическим воздействием.

 

Публикации

1. Демьяненко С.Н., Узденский А.Б. Profiling of signaling proteins in penumbra after focal photothrombotic infarct in the rat brain cortex Molecular Neurobiology, on-line, 1-18 (год публикации - 2016).

2. Ковалева В.Д., Узденский А.Б. Photodynamic therapy-induced nitric oxide production in neuronal and glial cells Journal of Biomedical Optics, 10, 21, 105005 (год публикации - 2016).

3. Узденский А.Б. The Biophysical Aspects of Photodynamic Therapy Biophysics, 3, 61, 461–469 (год публикации - 2016).

4. Узденский А.Б., Демьяненко С.А., Федоренко Г.М., Лаптева Т.Н., Федоренко А.Г. Protein Profile and Morphological Alterations in Penumbra after Focal Photothrombotic Infarction in the Rat Cerebral Cortex Molecular Neurobiology, 5, 53, 1-17 (год публикации - 2016).

5. Узденский А.Б., Демьяненко С.В. Фототромботический инсульт: Биохимия пенумбры Фототромботический инсульт: Биохимия пенумбры / Издательство Южного федерального университета: Ростов-на-Дону, 127 с (год публикации - 2016).