Аннотация результатов, полученных в 2014 году
Шигеллы Флекснера (Shigella flexneri) ответственны за большинство случаев бациллярной дизентерии (шигеллеза) в развивающихся странах. Эти и другие шигеллы генетически являются клонами эшерихий (Escherichia coli), среди которых встречаются как патогенные, так и комменсальные штаммы. О-антиген (О-полисахарид) является полисахаридной цепью липополисахарида, расположенного на наружной поверхности внешней мембраны грамотрицательных бактерий. Он является наиболее вариабельным компонентом клетки, определяет иммуноспецифичность микроорганизмов и играет важную роль в патогенезе бактериальных инфекций. За диверсификацию О-антигенов ответственны как вариации генов, входящих в генный кластер их биосинтеза, так и приобретение бактериями других генов, модифицирующих базовую структуру О-полисахаридов. Структурное разнообразие О-антигенов и антигенное родство различных групп бактерий, в том числе эшерихий и шигелл, усложняют эпидемиологический мониторинг, серодиагностику и вакцинопрофилактику инфекционных заболеваний. Основной целью проекта является разработка принципиально новой объединенной схемы типирования штаммов эшерихий и шигелл на основе структурно и генетически охарактеризованных О-антигенов. Полученные данные позволят улучшить серологические и молекулярные методы идентификации штаммов этих бактерий и уточнить формулу поливалентной дизентерийной вакцины. К началу исследования классификационная схема шигелл Флекснера включала 20 серотипов, основанных на структурных вариантах О-антигенов, возникших в результате химических модификаций (глюкозилирования, О-ацетилирования и фосфорилирования) двух базовых структур О-полисахаридов (группы А и Б). В рамках проекта путем полногеномного секвенирования штамма серотипа 6 (группа Б) был найден новый ген ацетилтрансферазы oacC, ответственный за 3/4-О-ацетилирование одного из остатков рамнозы (RhaIII) в О-антигене. Он строго специфичен для группы Б, но его гомолог oacВ, имеющий такую же функцию, встречается во многих штаммах группы А. Кроме того, в группе А обнаружен еще один новый ген ацетилтрансферазы oacD, отвечающий за О-ацетилирование остатка GlcNAc в положение 6. Функции генов oacC и oacD были подтверждены мутационными тестами и структурным анализом О-полисахаридов мутантных штаммов, утративших О-ацетильные группы в соответствующих положениях. Гены oacC и oacD находятся в профагах и очевидно были приобретены бактериями в результате лизогении. При этом впервые обнаружен профаг, включающий два фактора модификации О-антигенов шигелл Флекснера - ген oacD для О-ацетилирования и генный локус gtr для глюкозилирования. Таким образом, получено более полное представление о генетических факторах, участвующих в диверсификации О-антигенов шигелл Флекснера. Используя мутантов, дефектных по генам oacB и oacD, для абсорбции поликлональных сывороток против диких штаммов были получены моноспецифические антисыворотки к эпитопам, названным нами О-факторами 9 и 10, которые связаны с 3/4-О-ацетилированным остатком RhaIII и 6-О-ацетилированным остатком GlcNAc, соответственно. Скрининг 730 клинических изолятов шигелл Флекснера показал, что один либо оба О-фактора 9 и 10 широко распространены среди штаммов 8 из 20 серотипов и полученные моноспецифические антисыворотки являются удобным инструментом для детектирования таких штаммов. Предложено добавить антисыворотки к О-факторам 9 и 10 к набору для серотипирования шигелл Флекснера и расширить до 29 серотипов схему типирования этих бактерий за счет включения в нее новых серовариантов с О-ацетилированными О-антигенами. В соответствие с планом исследования эшерихий были изучены О-антигены 5 ранее неисследованных диких штаммов этих бактерий, включая 2 типовых штамма (серогруппы О37 и О163) и 3 новых нетипированных штамма (L-19, G5287 и G5413). Уникальные структуры их О-полисахаридов были установлены с помощью химических методов и ЯМР-спектроскопии высокого разрешения, при этом О-антигены штаммов L-19 и G5287 оказались идентичными друг другу. Для этих пяти, а также еще для 19 типовых штаммов эшерихий с ранее установленными структурами О-полисахаридов было проведено секвенирование и функциональный анализ генных кластеров О-антигенов с полной аннотацией всех генов их биосинтеза. В результате выяснены молекулярные основы разнообразия клонов, образующих 21 O-серогруппу существующей классификационной схемы эшерихий, и предложено расширить эту схему за счет включения изученных нетипированных штаммов L-19 и G5413 в качестве двух новых отдельных серогрупп. Кроме того, была изучена специфичность гликозилтрансфераз путей биосинтеза О-антигенов cерогрупп О107, О112с и О117, кодируемых генами с высокой степенью гомологии. Для этой цели с помощью сайт-направленного мутагенеза были получены пять мутантных клонов с модифицированными последовательностями аминокислот в активном центре ферментов и установлены структуры их О-антигенов. Было показано, что замена аминокислот С/R и D/N в положениях 194 и 217, соответственно, изменяет специфичность гликозилтрансфераз по отношению к субстрату-донору (UDP-D-Glc или UDP-D-GlcNAc), тогда как природа аминокислоты в положении 119 не влияет на выбор переносимого моносахарида.. Таким образом, все запланированные на первый год проекта работы выполнены. По результатам исследования опубликовано 5 статей в рецензируемых журналах и сделано 2 сообщения на научных конференциях.

Аннотация результатов, полученных в 2015 году
Кишечная палочка (Escherichia coli) является серологически гетерогенным клональным видом бактерий, включающим как комменсальные, так и патогенные штаммы. В настоящее время в классификационной схеме эшерихий, основанной на иммуноспецифичности О-антигенов, выделяют 180 О-серогрупп. О-антиген (О-полисахарид) представляет собой полисахаридную цепь липополисахарида, расположенного на наружном слое внешней мембраны бактериальных клеток. Структурное разнообразие О-антигенов, являющихся наиболее вариабельным компонентом клетки, обусловлено в основном полиморфизмом генного кластера их биосинтеза. С целью создания надежной основы для их классификации кишечных бактерий продолжено структурно-генетическое изучение О-антигенов эшерихий. Установлено химическое строение О-антигенов ранее неизученных 11 типовых штаммов эшерихий, представляющих серогруппы О32, O43, O53, O87, О96, O101, O140, O169, O162, О165 и О170. Среди них имеются патогенные клоны - возбудители энтерогеморрагического (О165) и энтеротоксигенного (О169) эшерихиозов. В составе О-антигенов, наряду с общими моносахаридами (D-Glc, D-Gal, D-GlcNAc), идентифицированы такие специфические компоненты О-антигенов, как D-Man, D-Galf, L-Rha, L-Fuc, D-GlcA, D-GalNAc и производное псевдаминовой кислоты (Pse5Hb7Ac). У двух штаммов – O101 и O162 – выявлена нехарактерная для эшерихий особенность – каждый из них продуцирует два полисахарида, имеющие близкие, но не идентичные структуры. В обоих штаммах полисахариды имеют одинаковые линейные основные цепи, построенные только из аминосахаров (GlcNAc и GalNAc), но в штамме O162 имеются также боковые цепи, представленные единичными остатками редковстречающегося моносахарида 4-дезокси-D-арабино-гексозы. Близкородственными оказались также О-антигены штаммов O96 и O170, имеющие одинаковый моносахаридный состав и одинаковую боковую цепь, а также общий дисахаридный фрагмент в основной цепи. В О-антигенах штамма O165 и изученного ранее штамма O82 обнаружен общий трисахаридный фрагмент. В структурном анализе эффективно использовался разработанный коллективом ранее метод сольволитического избирательного расщепления полисахаридов и были выявлены новые закономерности в устойчивости гликозидных связей различных моносахаридов. В генных кластеры О-антигенов (ГКО) 11 изученных штаммов присутствовали гены синтеза нуклеотидных предшественников специфических моносахаридных компонентов О-антигенов, гены гликозилтрансфераз и гены процессинга О-антигена. Их функции были определены сравнением с последовательностями в доступных генетических базах данных и на основании установленных структур О-антигенов. Показано соответствие этих структур предсказанным функциям генов в ГКО. В частности, в ГКО всех изученных штаммов (кроме штамма О162) число генов гликозилтрансфераз соответствовало размерам олигосахаридных повторяющихся звеньев О-антигенов. Многие гликозилтрансферазы отнесены к определенным гликозидным связям в О-антигенах. Аннотация генов пути биосинтеза Pse5Hb7Ac показала, что у E. coli O165 псевдаминовая кислота синтезируется по тому же пути, что и у кампилобактера, но вместо шести в биосинтезе участвуют пять ферментов, один из которых является бифункциональным. В большинстве изученных штаммов процессинг О-антигенов контролируется генами wzx и wzy, кодирующими флиппазу Wzx и О-антиген-полимеразу Wzy, что указывало на синтез О-антигенов по Wzx/Wzy-зависимому пути. В двух штаммах (O101 и O162) гены wzx и wzy отсутствовали и вместо них присутствовали гены wzm и wzt, кодирующие домены ABC-транспортера, необходимого для синтеза О-антигенов по альтернативному пути. Штаммы O101 и O162 имеют идентичные ГКО, включающие гены четырех гликозилтрансфераз. Как показали мутационный тесты, две из них отвечают за синтез одного из полисахаридов, а две другие – за синтез второго полисахарида. В ГКО штамма O162 отсутствуют гены для синтеза и переноса 4-дезокси-D-арабино-гексозы (D-4daraHex), являющейся компонентом О-антигена этого штамма. В штаммах О101 и О162 вблизи ГКО обнаружен дополнительной генный кластер, включающий два гена гликозилтрансфераз, предположительно катализирующих перенос D-4daraHex на один и другой полисахарид, и еще четыре гена, которые могут отвечать за синтез нуклеотидного предшественника D-4daraHex (его путь остается неизвестным). В кластере штамма O101 один из генов синтеза инактивирован инсерцией гена транспозазы, что очевидно является причиной отсутствия D-4daraHex в О-антигене этого штамма и соответственно одним из путей диверсификации О-антигенных структур. О-антигены трех исследованных штаммов (O32, O53 и O169) оказались близкородственными О-антигенам шигелл Бойда (Shigella boydii). Из них O-антиген E. coli O53 полностью идентичен О-антигену S. boydii 4, O-антигены штаммов E. coli O32 и S. boydii 14 имеет одинаковую структуру углеводного скелета и отличаются только О-ацетилированием О32-антигена, а отличие между O-антигенами E. coli O169 и S. boydii 6 заключается в присутствии глюкозных боковых цепей в штамме эшерихии. В первых двух случаях ГКО эшерихий и шигелл Бойда попарно организованы одинаково и входящие в них соответствующие гены имеют высокую степень гомологии. Из этого следует, что ген ацетилтрансферазы, который модифицирует О-антиген E. coli O32, находится вне ГКО. Напротив, ген глюкозилтрансферазы, модифицирующий О-антиген штамма O169, находится на 3'-конце ГКО. При этом все остальные функциональные гены в ГКО E. coli O169 и S. boydii 6 (кроме гена флиппазы wzx, расположенного рядом с геном глюкозилтрансферазы) организованы одинаково и имеют высокую степень гомологии . Это указывает на происхождение обоих клонов бактерий от общего предка, после дивергенции которого штамм эшерихии приобрел дополнительный ген глюкозилтрансферазы, вероятно путем горизонтального переноса. Данные, полученные в отчетный период и ранее, показывают, что структурные, генетические и серологические взаимосвязи О-антигенов различных О-серогрупп эшерихий между собой и между штаммами эшерихий и шигелл (S. boydii, S. flexneri, S. dysenteriae) характерны для многих представителей этих двух групп кишечных бактерий. Шигеллы генетически являются клонами эшерихий и выделяются в отдельную группу («род») только по клиническим и историческим соображениям. В настоящее время на основании О-антигенов выделяют 180 O-серогрупп эшерихий и 46 О-серогрупп (46 типов) шигелл. Основываясь на совокупности имеющихся данных мы предлагаем объединить наиболее близкие типовые штаммы эшерихий и шигелл в простые О-серогруппы (в случае идентичности О-антигенов) или в сложные О-серогруппы, включющие две или более подгрупп (в случае незначительного отличия О-антигенов). В соответствии с этим О-серогруппы, попадающие в сложные серогруппы в качестве подгрупп, из классификации исключаются. Такая объединенная классификационная схема кишечных бактерий будет дополнена в третий год проекта в соответствии с полученными новыми данными и будет предложена окончательная схема, учитывающая все взаимосвязи О-антигенов эшерихий между собой и с О-антигенами шигелл. Существующая классификационная схема эшерихий периодически расширяется за счет обнаружения новых природных изолятов с уникальными антигенными характеристиками. Нами исследован один такой штамм - E. coli 4s, выделенный из лошадиного навоза. Он имел такой же ГКО, что и типовой штамм О22, но отличался от него по структуре О-антигена – в нем присутствовала боковая глюкозная цепь. Полногеномное секвенирование этого штамма выявило gtr-кластер, находящийся вне ГКО и отсутствующий в геноме штамма O22. Он включает три гена, обеспечивающие а) перенос остатка глюкозы из нуклеотидного предшественника на фосфолипидный носитель, б) перенос продукта через цитоплазматическую мембрану и в) перенос остатка глюкозы с липидного носителя на О22-антиген. Приобретение gtr-кластера вне ГКО, вероятно имеющего фаговое происхождение, является молекулярным механизмом модификации О-антигена, альтернативным включению в ГКО E. coli O169 единичного гена глюкозилтрансферазы, вероятно в результате горизонтального переноса. Проведен структурно-генетический анализ О-антигена спонтанных мутантов E. coli 4s с измененной способностью взаимодействовать с бактериальными вирусами - бактериофагами, Найдено, что мутации происходят в результате инсерции IS-элементов в ген гликозилтрансферазы, блокирующей синтез О-антигена, или в ген ацетилтрансферазы, вследствие чего синтезируется О-антиген, лишенный О-ацетильных групп. Полученные данные показали, что наличие О-ацетилированного О-антигена с одной стороны обеспечивает специфическое узнавание бактерий с последующей инфекцией одними бактериофагами, а с другой стороны защищает клетки хозяина от атаки другими бактериофагами. Такая двойственная роль одной функциональной группы обнаружена у полисахаридного рецептора бактериофага впервые. Вирулентный бактериофаг CBA120 специфически инфицирует E. coli O157, что делает его перспективным кандидатом для контроля опасных инфекций, таких как гемаррогические колиты и гемолитико-уремический синдром, вызываемых энтерогемаррогическими штаммами этой О-серогруппы. Для выяснения биохимической основы первого этапа взаимодействия бактериофага с бактериями белок 163d хвостовых фибрилл бактериофага CBA120 был клонирован и были идентифицированы продукты расщепления этим белком выделенного О-антигена штамма О157. Было найдено, что белок 163d является гликозидазой, избирательно расщепляющей по гидролитическому механизму гликозидную связь остатков L-фукозы, входящих в основную цепь О-антигена. Таким образом, все запланированные на второй год проекта работы выполнены. По результатам исследования опубликовано 9 статей в рецензируемых журналах и сделано 4 сообщения на международной научной конференции.

Аннотация результатов, полученных в 2016 году
Кишечная палочка (Escherichia coli) является серологически гетерогенным клональным видом бактерий, включающим как комменсальные, так и патогенные штаммы. В настоящее время в классификационной схеме эшерихий, основанной на иммуноспецифичности О-антигенов, выделяют 180 О-серогрупп. О-антиген (О-полисахарид) представляет собой полисахаридную цепь липополисахарида, расположенного на наружном слое внешней мембраны бактериальных клеток. Структурное разнообразие О-полисахаридов, являющихся наиболее вариабельным компонентом клетки, обусловлено в основном полиморфизмом генного кластера О-антигена (ГКО), в котором кодируются ферменты пути их биосинтеза. Оно позволяет патогенным бактериям избегать защитного действия приобретенного иммунитета. С целью создания надежной основы для классификации кишечных бактерий в рамках проекта проведено структурно-генетическое изучение О-антигенов эшерихий. За отчетный период установлено химическое строение О-полисахаридов 23 типовых штаммов эшерихий, представляющих ранее неизученные серогруппы O12, O27, O28ab, О37, O38, O54, O60, O62, O69, O79, O80, O81, O95, O100, O105, O146, O156, O182-O187. В составе О-полисахаридов, наряду с моносахаридами, типичными для бактериальных полисахаридов (D-глюкоза, D-галактоза, D-манноза, N-аетил-D-глюкозамин, N-аетил-D-галактозамин, D-глюкуроновая кислота, L-рамноза, L-фукоза), идентифицированы такие специфические компоненты, как 2-амино-2,6-дидезокси-L-глюкоза (L-хиновозамин), 4-амино-4,6-дидезокси-D-глюкоза, 2-амино-2-дезокси-L-фукоза (L-фукозамин), 3-амино-3-дезокси-D-фукоза и 2,3-диамино-2,3-дидезокси-L-рамноза. Многие О-полисахариды содержат также неуглеводные компоненты: глицерофосфат, ацеталь пировиноградной кислоты, простые эфиры (R)- и (S)-молочной кислоты, O-ацетильные группы, N-связанные остатки (R)- и (S)-3-гидроксибутановой кислоты и L-аланина. Все изученные О-полисахариды - регулярные полимеры, построенные из повторяющихся олигосахаридных единиц (О-звеньев). Они имеют уникальные структуры, но два из них оказались близкородственными О-полисахаридам ранее изученных штаммов, образуя пары O123/O186 и O169/O183. Напротив, О-полисахариды подгрупп О28ab и O28ac не имеют заметного структурного и генетического родства, и объединение соответствующих штаммов в одну серогруппу О28 является необоснованным. Кроме того, установлена структура О-полисахарида E. coli HS3-104 - штамма, выделенного из лошадиного навоза. Она оказалась сходной со структурой типового штамма серогруппы O81 и отличалась только присутствием дополнительной боковой цепи, представленной единичным остатком глюкозы. В ГКО изученных штаммов E. coli присутствовали гены синтеза нуклеотидных предшественников специфических моносахаридных компонентов О-антигенов, гены гликозилтрансфераз и гены процессинга О-антигена. Их функции определены сравнением с последовательностями в доступных генетических базах данных с учетом установленных структур О-полисахаридов, и при этом показано соответствие этих структур предсказанным функциям генов в ГКО. В частности, число генов гликозилтрансфераз в ГКО соответствовало размерам О-звеньев, и гликозилтрансферазы были отнесены к определенным гликозидным связям. В ГКО большинства изученных штаммов присутствовали гены процессинга О-звена, предварительно собранного с помощью гликозилтрансфераз на липидном носителе. Это гены флиппазы Wzx для переноса O-звена через цитоплазматическую мембрану и О-антиген-полимеразы Wzy для полимеризации О-звена. Их присутствие указывает на синтез О-полисахаридов по наиболее распространенному у грамотрицательных бактерий Wzx/Wzy-зависимому пути. В ГКО E. coli O60 гены wzx и wzy отсутствовали и вместо них присутствовали гены wzm и wzt, кодирующие домены ABC-транспортера, который необходимы для синтеза О-антигена по альтернативному пути, включающему перенос моносахаридов одного за другим на растущую полисахаридную цепь. Было найдено, что ГКО E. coli O62 в типичном месте между генами galF и gnd инактивирован инсерцией в одном из генов пути биосинтеза нуклеотидного предшественника L-рамнозы. Функциональный ГКО, обеспечивающий синтез экспрессируемого этим штаммом О-полисахарида, очевидно, расположен в другом месте генома. В ГКО E. coli O69 и O146 присутствуют гены lat и lar для синтеза гликолактиловых кислот - простых эфиров молочной кислоты с N-ацетилглюкозамином и глюкозой. lat ответственен за перенос енолпирувата из фосфоенолпирувата на моносахарид, а lar - за последующее восстановление енолпирувата в лактат. Сравнительный анализ этих генов у всех эшерихий и шигелл, содержащих различные гликолактиловые кислоты, показал, что предсказанные енолпируваттрансферазы Lat сходны у всех штаммов, тогда как предсказанные енолпируватредуктазы Lar по нуклеотидным последовательностям и размерам могут быть разделены на две группы. В одну группу попадают белки E. coli O69, O124, S. boydii типа 17 и S. dysenteriae типа 3, О-антигены которых содержат эфиры (R)-молочной кислоты, а в другую - E. coli O146, O150 и S. dysenteriae типа 13 с О-антигенами, включающими эфиры (S)-молочной кислоты. В соответствии с этим нами предложено дать редуктазам этих двух групп названия LarR и LarS, указывающие на конфигурацию остатка молочной кислоты в их продуктах. Бактерии Shigella spp. - возбудители бациллярной дизентерии (шигеллеза) - по генетическим данным являются недавно обособившимися клонами эшерихий со специфическим типом патогенности. Их выделяют в отдельную группу (неправильно называемую родом) только по клиническим и историческим соображениям. В классификационной схеме шигелл выделяют 34 базовые О-серогруппы, называемые типами. Взаимосвязи между О-антигенами характерны для многих представителей эшерихий и шигелл (S. boydii, S. flexneri, S. dysenteriae). Так, О-антигены четырех исследованных в третий год проекта штаммов E. coli (O38, O79, O105 и O183) оказались структурно и генетически близкородственными О-антигенам шигелл. В частности, E. coli O183 и Shigella boydii типа 10 имеют идентичные О-полисахариды, которые отличаются от О-полисахарида S. boydii типа 6 присутствием остатка рибофуранозы в боковой цепи. Найдено, что последний является дочерним клоном S. boydii типа 10, возникшим в результате инактивации инсерцией гена рибозилтрансферазы. О-полисахариды E. coli O38, O79 и O105 оказались структурно и генетически идентичными О-полисахаридам S. dysenteriae типа 8 и S. boydii типов 5 и 11, соответственно. Совокупность полученных данных позволила предложить уточненную классификационную схему эшерихий, включающая как клоны эшерихий per se, так и клоны шигелл и учитывающая структурные и генетические взаимосвязи О-антигенов этих бактерий между собой. В новой схеме штаммы E. coli с близкородственными О-антигенами включены в качестве подгрупп в сложные О-группы. В соответствии с этим О-группы, типовые штаммы которых попадают в сложные O-группы, из классификации исключаются. Напротив, штаммы, объединявшиеся ранее в одну О-серогруппу на основании случайных перекрестных серологических реакций, но не обладающие существенным структурным и генетическим родством, отнесены в разные О-группы. Типовые штаммы шигелл в случае полной идентичности О-антигенов объединены с эшерихями в простые О-группы или в случае близкородственных О-антигенов в сложные О-группы, включающие две или более подгрупп. Для 10 типовых штаммов шигелл, не имеющих родства с эшерихиями по О-антигенам, созданы новые О-группы. Объединенная классификационная схема включает в настоящее время 175 O-групп (31 сложную и 144 простые), из которых 141 О-группа содержит только штаммы эшерихий, 24 О-группы - штаммы эшерихий и шигелл и 10 О-групп - только штаммы шигелл. Изучен биохимический механизм взаимодействия специфического N4-подобного бактериофага G7C с бактерией-хозяином E. coli 4s (подгруппа O22b). Найдено, что О-антиген эшерихий является первичным лигандом рецепторного белка gp63.1 хвостовых шипов бактериофага G7C. Структура белка gp63.1, являющегося тримером, установлена с помощью рентгеноструктурного анализа, и предсказано присутствие в нем домена с эстеразной активностью. Найдено, что рекомбинантный белок gp63.1 изменяет строение O-антигена E. coli 4s по механизму О-дезацетилирования, что согласуются с его предсказанной эстеразной активностью. Такой тип биологически значимой модификации О-антигена обнаружен у специфических бактериофагов впервые. Показано, что сольволиз трифторуксусной кислотой, предложенный нами ранее как высокоселективный реагент для избирательного расщепления гликозидных связей при проведении структурного анализа полисахаридов, является также эффективным методом получения олигосахаридных фрагментов О-антигенов, пригодных для синтеза противодизентерийных конъюгатных иммунопрепаратов (вакцин). О-полисахариды S. flexneri типов Y, 2а и 3a избирательно расщеплялись этим реагентом по связям одного из остатков aльфа-рамнопиранозы, а О-полисахарид типа 6 - по связям N-ацетил-бета-галактозамина. В результате получены димеры и тримеры повторяющихся звеньев из О-полисахаридов S. flexneri типов Y, 2а и 6 или тример и более высокие гомологи из О-полисахарида S. flexneri типа 3а (большая устойчивость последнего к сольволизу может быть объяснена 2-О-ацетилированием остатка RhaI). Важным являлось то, что в выбранных условиях сольволиза не затрагивались О-ацетильные группы, с которыми связаны специфические иммунодетерминанты O-антигенов. При необходимости более протяженные фрагменты О-полисахаридов могут быть получены в более мягких условиях сольволиза. Таким образом, все запланированные на третий год проекта работы выполнены. По результатам исследования опубликовано 12 статей в рецензируемых журналах и сделано 8 сообщений на российских и международных научных конференциях.