Аннотация результатов, полученных в 2014 году
Из нефтезагрязненных биотопов выделены 153 культуры углеводородокисляющих актинобактерий, идентифицированных с помощью фенотипического, хемотаксономического и генетического анализа как представители родов Rhodococcus (R. erythropolis, R. jostii, R. fascians, R. opacus, R. rhodochrous, R. ruber), Dietzia (D. maris) и Gordonia (G. rubripertincta, G. terrae). Подобраны видоспецифические ПЦР-праймеры к R. jostii и R. fascians для экспрессной идентификации и детекции родококков в нефтезагрязненных образцах. Свежевыделенные идентифицированные штаммы и разработанная база данных о них составили основу референтной коллекции штаммов углеводородокисляющих актинобактерий на базе Rhodococcus-центра ПГНИУ. Выделенные штаммы характеризуются деструктивной активностью в отношении предельных углеводородов (С10-С22, пристан), ароматических (бензол, фенол, толуол, ксилол), полиароматических (антрацен, фенантрен, бензантрацен, бензо(а)пирен), кислород- (кумарин), серу- (дибензотиофен) и азотсодержащих (пиридин, изохинолин) гетероциклических соединений, они устойчивы к тяжелым металлам, активны в условиях экстремальной кислотности (рН 2-6) и засоленности (5-15% NaCl), синтезируют биосурфактанты. Анализ секвенированного генома штамма-нефтедеструктора R. ruber ИЭГМ 231 выявил три гена мультимедных оксидаз (лакказ) третьего типа. Методом комбинированной атомно-силовой и конфокальной микроскопии изучены наноморфологические особенности родококков при взаимодействии с органическими растворителями, отобраны устойчивые к 20-80% растворителей штаммы, перспективные для биокатализа и биоремедиации загрязненных сред. В ходе биоконверсии дротаверина и бетулина родококками обнаружены продукты с потенциальной биологической активностью. Разработана ассоциация коиммобилизованных родококков, адаптированная для биодеструкции (86–90%) нефтяных углеводородов в колоночном биореакторе с псевдоожиженым слоем. Показана возможность использования Rhodococcus-биосурфактантов для 19−75 %-го извлечения тяжелых металлов из техногенно загрязненных луговых почв.

Аннотация результатов, полученных в 2015 году
В результате проведения теоретических исследований обобщены данные по современным методам предотвращения и ликвидации нефтяных разливов, а также роли коллекций культур микроорганизмов в разработках экологически безопасных технологий биоремедиации техногенно поврежденных экосистем. Пополнена референтная коллекция актинобактерий – биодеструкторов нефтяных углеводородов и продуцентов биотехнологически ценных метаболитов Rhodococcus-центра ПГНИУ, а информация о свежевыделенных культурах включена в информационно-поисковую базу данных коллекции (http://helios.psu.ru:7778/pls/iegm/data_view$.startup). Проведенный in silico анализ аминокислотных последовательностей лакказных ферментов секвенированного нами штамма-нефтедеструктора R. ruber ИЭГМ 231 показал низкую (26-30%) степень гомологии внутри мультигенного семейства за исключением высокого (99%) сходства последовательностей RHRU231v1_620027 и RHRU231v1_660030. При этом гетерогенность внутри лакказного семейства штамма R. ruber ИЭГМ 231 была даже выше, чем гетерогенность между ними и лакказными семействами представителей других видов данного рода. Выявленное разнообразие лакказных генов у Rhodococcus spp. свидетельствует о возможности отбора штаммов с наиболее оптимальной генетической структурой для дальнейших инжиниринговых исследований. Получены новые данные по биотрансформации актинобактериями труднодеградируемых поли- и гетероциклических углеводородов – замещенного изохинолина, холестана, фенилметилсульфида, а также физико-химических свойствах и токсичности образуемых продуктов. Разработан способ получения (R)-фенилметилсульфоксида с помощью иммобилизованных в гелевом носителе клеток гордоний, который представлен в виде заявки на патент РФ на изобретение. Экспериментально обоснована эффективность использования неочищенных Rhodococcus-биосурфактантов для десорбции и мобилизации полиароматических (ПАУ) и гетероциклических углеводородов в нефтезагрязненной почве. По нашим данным, эффективность биосурфактантов в почве, загрязненной ПАУ и дибензотиофенами, была сопоставима с таковой синтетического аналога Твина 60, однако они в 2,5 раза эффективнее удаляли ПАУ из почвы, загрязненной ПАУ и алканами. Наиболее высокая (74-100 %) десорбирующая активность Rhodococcus–биосурфактантов была выявлена в отношении нафталина, бензпирена, дибензотиофена, 4-метилдибензотиофена и разветвленного алкана пристана. Определена оптимальная концентрация биосурфактантов для эффективного удаления ПАУ и гетероциклических углеводородов из нефтезагрязненной почвы. Обобщены результаты теоретического и экспериментального исследования иммуномодулирующей активности очищенных препаратов трегалолипидного биосурфактанта (ТЛБ) из R. ruber ИЭГМ 231. Полученные нами в экспериментах in vitro и in vivo данные о влиянии ТЛБ на жизнеспособность, морфологию и секреторную активность иммунокомпетентных клеток периферической крови сопоставлены с данными литературы для аналогичного препарата – трегалозодимиколата из патогенной актинобактерии Mycobacterium tuberculosis и других трегалолипидов родококков и родственных актинобактерий. Результаты исследования свидетельствуют о высоком биотехнологическом потенциале биосурфактантов из родококков и перспективности их применения в качестве агентов биомедицины с низкой цитотоксичностью и выраженной иммунологической активностью. Получены новые сведения о механизмах устойчивости родококков к воздействию высокотоксичных нефтяных углеводородов. С помощью комбинированного атомно-силового и конфокального лазерного сканирования установлено, что родококки используют разнообразные приемы морфофизиологической адаптации (изменение шероховатости и относительной площади поверхности клеток, диссоциация и коагрегация клеток, повышение количества суммарных липидов и дыхательной активности) к воздействию углеводородов. АСМ-профилометрия показала увеличение шероховатости поверхности живых клеток родококков на 19–38% после воздействия н-гексана. Инкубирование с н-деканом, циклогексаном и толуолом также приводило к 12–21%-ному увеличению шероховатости микрорельефа и, напротив, разглаживанию нанорельефа поверхности родококков на 33-54%. Данные АСМ-индентирования клеток родококков демонстрируют уменьшение модуля упругости в 2–4,5 раза под действием углеводородов нефти, что свидетельствует о снижении жесткости связей между компонентами клеточной стенки. В режиме силовой АСМ-спектроскопии получены карты адгезии зонда кантилевера к поверхности родококков. Выявлено увеличение (на 0,2 нН) сил взаимодействия между зондом кантилевера и поверхностью клеток, инкубированных в циклогексане по сравнению с контрольными клетками. Воздействие толуола, напротив, приводило к снижению на 1,1 нН силы адгезии зонда, которое могло быть вызвано денатурацией белков и растворением липидных компонентов клеточной оболочки. Таким образом, воздействие нефтяных углеводородов приводило к снижению жесткости и изменению характера распределения адгезивных участков на поверхности клеток родококков. Разработана программа для ЭВМ «Расчет экологических взаимодействий актинобактерий в нефтеокисляющих ассоциациях», предназначенная для: (1) анализа экспериментальных данных по устойчивости бактериальных ассоциаций к модельной нефти; (2) вычисления коэффициентов попарного влияния штаммов в данных ассоциациях; (3) классификации типов взаимодействий по шкале нейтральность – кооперация – аменсализм – комменсализм – конкуренция – хищничество. Область применения: экологическая микробиология, биоинформатика, использование в учебном процессе ВУЗов при подготовке студентов специальностей «Микробиология» и «Компьютерная биомеханика». Положительно оценена эффективность использования разработанной бактериальной ассоциации для очистки реальных промышленных стоков – отработанной воды после промывки бурового оборудования в условиях лабораторного биореактора с псевдоожиженным слоем. Показано, что иммобилизация на носителе-сорбенте клеток R. ruber и R. opacus способствует 3-х-кратному увеличению степени удаления углеводородов и повышению (на 3-10%) степени извлечения солей Mn, Zn и Mo из буровой сточной воды по сравнению с неинокулированным носителем. Изучение динамики процесса очистки воды показало, что наиболее интенсивное удаление углеводородов происходит в течение второй недели эксперимента, что, по-видимому, обусловлено формированием в биореакторе адаптированной бактериальной популяции. С целью внедрения разработанных методов биоремедиации нефтезагрязненных экосистем в июле 2015 г. начаты полевые промышленные испытания биопрепарата на основе иммобилизованной ассоциации родококков и Rhodococcus-биосурфактанта на производственном участке обработки твердых нефтесодержащих отходов (ТНСО) компании ООО «Природа-Пермь» в рамках договора о намерениях и научно-техническом сотрудничестве.

Аннотация результатов, полученных в 2016 году
В результате теоретических исследований обобщены данные по биологическим особенностям и экобиотехнологическому потенциалу углеводородокисляющих актинобактерий, в частности представителей рода Rhodococcus. Детально рассмотрены аспекты адаптации углеводородокисляющих актинобактерий к ассимиляции гидрофобных субстратов, а также современные проблемы их использования для биоиндикации углеводородных загрязнений и примеры успешной биоремедиации нефтезагрязненных экосистем. На основе секвенированного нами полного генома штамма-нефтедеструктора R. ruber ИЭГМ 231 из Региональной профилированной коллекции алканотрофных микроорганизмов (акроним ИЭГМ, WDCM 768; www.iegm.ru/iegmcol/strains) изучена генетическая организация лакказных ферментов RHRU231v1_660030 и RHRU231v1_620027 с характерными доменами (CuRO_1_Tth-MCO_like и CuRO_3_Tth-MCO_like), сходными с таковыми лакказ из Thermus thermophilus. Лакказная активность коллекционных штаммов экспериментально подтверждена в качественном тесте на окисление специфического модельного субстрата 3-этилбензотиазолин-6-сульфокислоты (ABTS), что позволило отобрать перспективные для метолического инжиниринга штаммы. Построено филогенетическое дерево лакказных ферментов родококков, на котором последовательности RHRU231v1_660030 и RHRU231v1_620027 из R. ruber формируют самостоятельную ветвь, свидетельствуя об их возможной функциональной уникальности и более ранней эволюционной дивергенции. Выполнено моделирование структурной конформации фермента, определена доступность для растворителя и тепловая подвижность аминокислотных остатков. В структуре лакказы выявлены 5 сайтов связывания лигандов, в том числе кислород- и медь-связывающие участки, и 5 активных сайтов. Наряду с общим сходством трехмерной структуры лакказы из R. ruber и T. thermophilus имеются существенные различия в конформации их молекул, в том числе лиганд-связывающих участках и активных сайтах, определяющих функциональные особенности. Результаты компьютерного анализа топологии исследуемой лакказы RHRU231v1_660030 будут использованы при экспериментальном исследовании фермент-субстратных взаимодействий. Получены результаты исследования биотрансформирующей активности актинобактерий в отношении токсичных и труднодеградируемых углеводородных субстратов, которые присутствуют в нефтесодержащих отходах. Изучена устойчивость родококков к моноароматическим соединениям на примере бензола и фенола. Отобраны наиболее устойчивые штаммы родококков, способные расти в присутствии 12,5–25 об. % углеводородов и перспективные для использования в биотехнологиях очистки нефтезагрязненной воды и почвы. В условиях колоночного биореактора получены новые данные о способности коиммобилизованных на хвойных опилках адаптированных клеток штаммов R. ruber ИЭГМ 615 и R. opacus ИЭГМ 249 к деградации наиболее труднодеградируемых нефтяных компонентов – полиароматических углеводородов (ПАУ). По нашим данным, в результате биообработки общая концентрация ПАУ в модельной загрязненной воде снизилась от 0,015 до 0,005 г/л, что соответствует 70%-ной эффективности их удаления. При этом индивидуальные ПАУ деградировались в различной степени в зависимости от сложности их молекул. В частности, нафталин полностью удалялся из воды, эффективность биодеградации фенантрена (88%) была выше по сравнению с антраценом (33%), по-видимому, вследствие его более высокой биодоступности. Степень биодеградации флуорена, пирена и хризена составляла 13-68%, их удаление из воды происходило в основном за счет биосорбции. С использованием высокоточной респирометрии установлено, что при контакте с загрязненной ПАУ водой средняя скорость потребления О2 и выделения СО2 ассоциацией родококков была в 1,2 и 1,7 раза выше таковой для индивидуальных штаммов R. ruber и R. opacus соответственно. Кроме того, респираторная активность микробной ассоциации после двухнедельного контакта с ПАУ в биореакторе повышалась на 27 % по сравнению с исходными значениями, свидетельствуя об использовании ПАУ родококками в качестве источника углерода и энергии. С помощью комбинированной системы конфокального лазерного и атомно-силового сканирования (КЛСМ/АСМ) получены первые результаты исследования влияния наночастиц оксида никеля (II) на жизнеспособность и морфофизиологические свойства родококков. Установлено, что при увеличении концентрации наночастиц оксида никеля в среде инкубирования от 0,05 до 0,2 и 0,8 мг/мл жизнеспособность клеток R. ruber снижалась на 60 и 80% по сравнению с биотическим контролем. При этом линейные размеры клеток, обработанных 0,05-0,2 мг/мл наночастиц, уменьшались на 0,9-1,4 х 0,3-0,5 мкм. Однако дальнейшее повышение концентрации наночастиц NiO вплоть до 6,4 мг/мл не приводило к снижению показателя жизнеспособности и морфометрических параметров, свидетельствуя о возможном пороге насыщения сорбционной емкости клеток в отношении наночастиц. Установлено, что отрицательный дзета-потенциал клеток родококков в присутствии наночастиц оксида никеля колебался от -23,6 до -30,6 mV, тогда как соответствующий показатель для нативных клеток был равен -33,5 mV, а для наночастиц NiO составлял -19,3 mV. Выявленный сдвиг значений дзета-потенциала в менее отрицательную область свидетельствует о сорбции наночастиц металла на поверхности бактериальных клеток. Перспективными продуктами биотрансформации углеводородов родококками являются гликолипидные (трегалолипидные) биосурфактанты, обладающие выраженной межфазной, эмульгирующей, десорбирующей и биологической активностью. Получены результаты исследования антиадгезивной активности Rhodococcus-биосурфактантов в отношении грамположительных (Arthrobacter simplex ИЭГМ 667, Bacillus subtilis АТСС 6613, Brevibacterium linens ИЭГМ 1830, Corynebacterium glutamicum ИЭГМ 1861, Micrococcus luteus ИЭГМ 401) и грамотрицательных (Escherichia coli K-12 и Pseudomonas fluorescence NCIMB 9046) бактерий. Установлено, что Rhodococcus-биосурфактант наиболее эффективен в отношении растущих бактерий, демонстрируя высокий потенциал для предотвращения нежелательного пленкообразования. Измерения контактных углов и расчеты свободной энергии поверхности показали снижение Ван-дер-Ваальсового компонента и увеличение кислотно-основного компонента, вызванного обработкой полистирола биосурфактантом, что препятствовало адгезии гидрофобных бактерий. Проведенное АСМ-сканирование выявило три типа структурной организации биосурфактанта (мицеллы, кордоподобные структуры и крупные везикулы), обуславливающих его разнообразные антиадгезионные эффекты. С целью внедрения разработанных методов биоремедиации нефтезагрязненных экосистем в 2015-2016 гг. проведены полевые испытания биопрепарата на основе иммобилизованной ассоциации родококков и Rhodococcus-биосурфактанта на производственном участке обработки твердых нефтесодержащих отходов (ТНСО) компании ООО «Природа-Пермь». Полученные результаты лабораторных исследований и полевых испытаний свидетельствуют об эффективности комплексного внесения иммобилизованного биопрепарата и дополнительного источника органического азота в виде компоста на основе птичьего помета. По результатам исследования планируется заключение договора о проведении промышленной обработки ТНСО на нескольких производственных участках компании для оценки возможности тиражирования разработанных методов биоремедиации.