Аннотация результатов, полученных в 2014 году
Целью настоящего проекта является применение новых методов спектроскопии ЯМР и создание оригинального программного обеспечения для решения ряда актуальных задач молекулярной фармакологии. В рамках исследований, выполненных в отчетный период, были разработаны методы расчета коротких подвижных пептидов в явно выраженном водном окружении, протестированы методы расчета крупных белков с использованием ограниченного списка параметров ЯМР, создана программа для верификации экспериментальных ограничений ЯМР в итерационном процессе расчета трехмерной структуры белка, усовершенствована программа докинга низкомолекулярных соединений в структуру биомолекул-мишеней, создан новый алгоритм, позволяющий проводить отбор наиболее вероятной конформации и ориентации лигандов в сайте связывания с биомишенью по данным ЯМР. В рамках экспериментальных исследований выполнен поиск новых ингибиторов C. freundii метионин гамма-лиазы (МГЛ) – фермента, участвующего в катаболизме метионина и цистеина у ряда бактерий и простейших эукариот, включая патогенные микроорганизмы и отсутствующего у млекопитающих, что позволяет рассматривать его в качестве перспективной мишени для дизайна потенциальных антибактериальных препаратов. Поиск новых ингибиторов МГЛ включал этап виртуального скрининга библиотеки коммерчески доступных соединений in silico и последующий экспериментальный отбор соединений-лидеров, способных взаимодействовать с ферментом. Идентификация связывания проводилась с помощью методов разностной спектроскопии на переносе насыщения (STD) и WaterLOGSY. На заключительном этапе проведена экспериментальная оценка ингибирующей способности отобранных соединений по отношению к метионин гамма-лиазе в реакции гамма- элиминирования L-метионина. Для двух соединений-лидеров с помощью метода WaterLOGSY определены константы связывания с ферментом. Проведенное исследование расширяет структурную группу потенциальных ингибиторов метионин гамма-лиазы и позволяет перейти к дизайну соединений, обладающих более высокой ингибирующей активностью. Разработанные в рамках выполнения проекта программы и экспериментальные методики были использованы также в структурных исследованиях фактора терминации трансляции eRF1 человека, а также взаимодействия лигандов с несколькими изоформами металлсвязывающего фрагмента бета-амилоида человека и инсулином.

Аннотация результатов, полученных в 2015 году
Проект посвящен применению новых методов спектроскопии ЯМР и созданию оригинального программного обеспечения для решения задач молекулярной фармакологии. В ходе исследований, выполненных в течение 2015 года, были разработаны программы для определения динамических характеристик биомолекул по данным релаксационных экспериментов, измерений скоростей обмена амидных протонов на дейтерий и анализа полной формы линий в спектрах ЯМР. Разработан новый алгоритм расчета структуры белков, содержащих неупорядоченные участки, основанный на расчете параметров ЯМР всех возможных конформаций белковой цепи и определения веса каждой конформации с использованием метода максимальной энтропии. Проведены расчеты структуры и длинной (1 мкс) траектории молекулярной динамики фактора терминации трансляции eRF1 человека в явно выраженном водном окружении. Установлено, что eRF1 в растворе является высоко подвижным белком, способным претерпевать высокоамплитудные конформационные перегруппировки. Для разработанного на первом этапе выполнения проекта алгоритма расчета эффектов переноса насыщения (STD) при взаимодействии белок-лиганд выполнена кросс-валидация с результатами расчета полной матрицы релаксации. Разработанный алгоритм позволяет существенно уточнять положение лиганда в центре связывания с белком, детектируя параметры, ассоциированные только с сигналами лиганда. Проведена модификация разработанной ранее программы докинга низкомолекулярных подвижных лигандов Algocomb для учета внутрилигандных нековалентных взаимодействий. Усовершенствованный алгоритм показал высокую эффективность на тестовом наборе из 1300 белок-лигандных комплексов с известными пространственными структурами, и измеренными константами связывания лигандов. Создан набор алгоритмов и скриптов на языке Python для автоматизации процедуры докинга лигандов и анализа полученных результатов. Выполнен докинг 1 миллиона 175 тысяч соединений из коммерчески доступных библиотек в сайт связывания фермента C. freundii метионин гамма-лиазы (МГЛ, код PDB 2RFV) с целью поиска наиболее перспективных ингибиторов фермента. На основе результатов докинга отобраны, закуплены и экспериментально исследованы 32 соединения, показавшие наилучшие результаты и свойства. Методами ЯМР-скрининга с применением разностной спектроскопии на переносе насыщения (STD) и экспериментов WaterLOGSY отобраны четыре соединения – лидера, для двух из которых показано наличие ингибирующих свойств. Методами INPHARMA и SAR-by-ILOE показано связывания отобранных соединений в одном и том же белковом кармане, соседним к карману, для которого на первом этапе выполнения проекта было найдено два других ингибитора МГЛ. Начаты экспериментальные исследования нового фармакологически перспективного белка – TEN домена теломеразы Ogataea polymorpha. Для этого белка выполнено отнесение сигналов в спектрах ЯМР и определена вторичная структура, что закладывает основу для дальнейшего определения структуры белка в растворе и изучения его динамических и функциональных свойств. За два года выполнения проекта в соответствии с запланированными показателями опубликовано 5 статей в журналах, реферируемых WoS, Scopus и РИНЦ.

Аннотация результатов, полученных в 2016 году
В ходе исследований, проведенных в 2016 году, основные усилия были сосредоточены на решении актуальных задач молекулярной фармакологии методами и программными средствами, разработанными на предыдущих этапах. Определена структура высокого разрешения в растворе N-терминального домена (TEN) основной каталитической субъединицы TERT теломеразы из термофильных дрожжей Ogataea polymorpha. Координаты атомов депонированны в банк белковых структур (http://www.rcsb.org) с кодом доступа 5LGF. Исследованы динамические свойства белковой цепи TEN в шкале времени от пс до мс. Методами гетероядерной спектроскопии ЯМР изучено взаимодействие TEN домена с потенциальными партнерами по связыванию. Установлено, что TEN домен специфически связывается с короткими фрагментами одноцепочечной РНК и гетеродуплексами РНК-ДНК, содержащими теломерные повторы. Это может определять роль этого фрагмента TERT в механизме реакции удлинения цепи ДНК, катализируемой теломеразой. Получено отнесение сигналов ЯМР основной белковой цепи еще одной субъединицы теломеразы термофильных дрожжей Ogataea polymorpha - белка Est3. Определены элементы вторичной структуры этого белка. Начато исследование методами ЯМР нового фармакологически важного объекта -метилтрансферазы WBSCR27, продукта одного из генов, ассоциированных с генетическим заболеванием (синдромом Вильямса). Получена информация об отнесении сигналов аминокислотных остатков WBSCR27 и вторичной структуре белка. Методами ЯМР определено строение серии антибиотиков - аналогов амфотерицина B и исследовано взаимодействие рифабутина с циклодекстринами с целью повышения биодоступности препарата. Проведен поиск потенциальных ингибиторов C. freundii метионин гамма-лиазы (МГЛ) на основе структур фрагментов, связывающихся с ферментом в соседних участках. Методами ЯМР-скрининга в отобранной группе соединений найдены два соединения, связывающиеся с МГЛ. Проведена модификация программы докинга Algocomb с целью усовершенствования оценочной функции для осуществления более точной оценки свободной энергии образования белок-лигандного комплекса. Разработан интерфейс для интеграции программы SpINPHARMA в ранее оптимизированный программный пакет для моделирования белок-лигандных взаимодействий. За 2016 год в соответствии с запланированными показателями опубликовано 4 статьи в журналах, реферируемых WoS, Scopus и РИНЦ. Получены 3 авторских свидетельства на программное обеспечение. Результаты выполнения проекта представлены в 2016 году на 9-ти международных и российских конференциях и научных школах в виде 2 пленарных, 7 устных и 6 стендовых докладов.