КАРТОЧКА ПРОЕКТА,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ


Номер 14-14-00598

НазваниеРазработка методов ЯМР для решения задач молекулярной фармакологии

РуководительПольшаков Владимир Иванович, Доктор химических наук

Организация финансирования, регионФедеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Московский государственный университет имени M.В.Ломоносова», г Москва

Годы выполнения при поддержке РНФ 2014 - 2016  , продлен на 2017 - 2018. Карточка проекта продления (ссылка)

КонкурсКонкурс 2014 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами»

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни, 04-202 - Протеомика; структура и функции белков

Ключевые словаСпектроскопия ЯМР; молекулярная фармакология; ЯМР-скрининг; специфическое взаимодействие белок-лиганд; структура и динамика биомолекул

Код ГРНТИ34.15.15


СтатусУспешно завершен


 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ


Аннотация
Одним из важнейших направлений развития наук, изучающих живую природу, является разработка рациональных подходов к поиску новых эффективных лекарственных средств, основанных на знании биологических мишеней. Мишень ориентированные методы дизайна новых лекарственных средств стали развиваться сравнительно недавно, но уже привели к созданию ряда важных препаратов. Одним из ключевых экспериментальных методов, лежащих в основе этих исследований, является спектроскопия ядерного магнитного резонанса. В последние годы появилось новое направление в молекулярной фармакологии: ЯМР-скрининг. Целью настоящего проекта является создание новых эффективных методов и оригинального программного обеспечения для решения ряда актуальных задач молекулярной фармакологии. В их числе: (i) определение структуры биологически важных макромолекул в растворе; (ii) изучение динамических свойств белков и их комплексов с низкомолекулярными лигандами; (iii) поиск лигандов, связывающихся с высокой специфичностью с биомишенями; (iv) рациональный дизайн новых высоко аффинных соединений из сравнительно небольших молекулярных фрагментов. Все эти задачи требуют тесного сочетания инструментальных методов ЯМР с эффективными вычислительными подходами. В результате выполнения проекта планируется создание оригинального программного обеспечения, которое будет доступным для всех заинтересованных в нем пользователей. При использовании известных и разработанных в ходе выполнения проекта новых методик ЯМР скрининга планируется провести поиск ингибиторов C. freundii метионин гамма-лиазы. Наиболее эффективные из найденных соединений могут быть далее отобраны для углубленных доклинических исследований в качестве потенциальных антибактериальных соединений. Проведение запланированных исследований призвано сократить отставание российской науки в области развития рациональных методов дизайна новых лекарственных препаратов.

Ожидаемые результаты
В результате выполнения проекта будут созданы несколько оригинальных методик и пакетов программного обеспечения для определения структуры биомолекул и их комплексов с низкомолекулярными лигандами, установления их динамических свойств и рационального дизайна соединений, связывающихся с высокой афинностью с исследуемыми биомишенями. Некоторые из разрабатываемых программ и методик не имеют аналогов в мире по своим функциональным возможностям. Созданные методы и программное обеспечение призвано повысить эффективность работ по рациональному дизайну новых лекарственных препаратов. В ходе выполнения проекта будут найдены новые ингибиторы метионин гамма-лиазы – перспективной мишени действия антибиотиков. Наиболее эффективные из найденных соединений могут быть в дальнейшем переданы на углубленные доклинические исследования в качестве потенциальных антибактериальных средств. Запланированные исследования по своей актуальности, новизне применяемых и разрабатываемых подходов и методическому уровню соответствуют высоким международным стандартам. В ходе выполнения проекта планируется подготовить к печати и опубликовать не менее десяти статей в рецензируемых научных журналах. Не менее половины научных статей из этого числа планируется опубликовать в высоко-рейтинговых международных журналах.


 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ


Аннотация результатов, полученных в 2014 году
Целью настоящего проекта является применение новых методов спектроскопии ЯМР и создание оригинального программного обеспечения для решения ряда актуальных задач молекулярной фармакологии. В рамках исследований, выполненных в отчетный период, были разработаны методы расчета коротких подвижных пептидов в явно выраженном водном окружении, протестированы методы расчета крупных белков с использованием ограниченного списка параметров ЯМР, создана программа для верификации экспериментальных ограничений ЯМР в итерационном процессе расчета трехмерной структуры белка, усовершенствована программа докинга низкомолекулярных соединений в структуру биомолекул-мишеней, создан новый алгоритм, позволяющий проводить отбор наиболее вероятной конформации и ориентации лигандов в сайте связывания с биомишенью по данным ЯМР. В рамках экспериментальных исследований выполнен поиск новых ингибиторов C. freundii метионин гамма-лиазы (МГЛ) – фермента, участвующего в катаболизме метионина и цистеина у ряда бактерий и простейших эукариот, включая патогенные микроорганизмы и отсутствующего у млекопитающих, что позволяет рассматривать его в качестве перспективной мишени для дизайна потенциальных антибактериальных препаратов. Поиск новых ингибиторов МГЛ включал этап виртуального скрининга библиотеки коммерчески доступных соединений in silico и последующий экспериментальный отбор соединений-лидеров, способных взаимодействовать с ферментом. Идентификация связывания проводилась с помощью методов разностной спектроскопии на переносе насыщения (STD) и WaterLOGSY. На заключительном этапе проведена экспериментальная оценка ингибирующей способности отобранных соединений по отношению к метионин гамма-лиазе в реакции гамма- элиминирования L-метионина. Для двух соединений-лидеров с помощью метода WaterLOGSY определены константы связывания с ферментом. Проведенное исследование расширяет структурную группу потенциальных ингибиторов метионин гамма-лиазы и позволяет перейти к дизайну соединений, обладающих более высокой ингибирующей активностью. Разработанные в рамках выполнения проекта программы и экспериментальные методики были использованы также в структурных исследованиях фактора терминации трансляции eRF1 человека, а также взаимодействия лигандов с несколькими изоформами металлсвязывающего фрагмента бета-амилоида человека и инсулином.

 

Публикации

1. E. Smirnova, I. Safenkova, V. Stein-Margolina, V. Shubin, V. Polshakov, B. Gurvits pH-responsive modulation of insulin aggregation and structural transformation of the aggregates Biochimie, - (год публикации - 2015).

2. S.A. Kozin, A.A. Kulikova, A.N. Istrate, P.O. Tsvetkov, S.S. Zhokhov, Y.V. Mezentsev, A.S. Ivanov, V. I. Polshakov, A.A. Makarov The English (H6R) familial Alzheimer’s disease mutation facilitates zinc-induced dimerization of the amyloid-β metal-binding domain Metallomics, - (год публикации - 2015).

3. Е.А. Батуев, А.Ю. Лизунов, Е.А. Морозова, В.В. Клочков, Н.В. Ануфриева, Т.В. Демидкина, В.И. Польшаков ЯМР скрининг потенциальных ингибиторов Citrobacter freundii метионин γ-лиазы Молекулярная Биология, т. 48. № 6, сс. 1019-1029 (год публикации - 2014).


Аннотация результатов, полученных в 2015 году
Проект посвящен применению новых методов спектроскопии ЯМР и созданию оригинального программного обеспечения для решения задач молекулярной фармакологии. В ходе исследований, выполненных в течение 2015 года, были разработаны программы для определения динамических характеристик биомолекул по данным релаксационных экспериментов, измерений скоростей обмена амидных протонов на дейтерий и анализа полной формы линий в спектрах ЯМР. Разработан новый алгоритм расчета структуры белков, содержащих неупорядоченные участки, основанный на расчете параметров ЯМР всех возможных конформаций белковой цепи и определения веса каждой конформации с использованием метода максимальной энтропии. Проведены расчеты структуры и длинной (1 мкс) траектории молекулярной динамики фактора терминации трансляции eRF1 человека в явно выраженном водном окружении. Установлено, что eRF1 в растворе является высоко подвижным белком, способным претерпевать высокоамплитудные конформационные перегруппировки. Для разработанного на первом этапе выполнения проекта алгоритма расчета эффектов переноса насыщения (STD) при взаимодействии белок-лиганд выполнена кросс-валидация с результатами расчета полной матрицы релаксации. Разработанный алгоритм позволяет существенно уточнять положение лиганда в центре связывания с белком, детектируя параметры, ассоциированные только с сигналами лиганда. Проведена модификация разработанной ранее программы докинга низкомолекулярных подвижных лигандов Algocomb для учета внутрилигандных нековалентных взаимодействий. Усовершенствованный алгоритм показал высокую эффективность на тестовом наборе из 1300 белок-лигандных комплексов с известными пространственными структурами, и измеренными константами связывания лигандов. Создан набор алгоритмов и скриптов на языке Python для автоматизации процедуры докинга лигандов и анализа полученных результатов. Выполнен докинг 1 миллиона 175 тысяч соединений из коммерчески доступных библиотек в сайт связывания фермента C. freundii метионин гамма-лиазы (МГЛ, код PDB 2RFV) с целью поиска наиболее перспективных ингибиторов фермента. На основе результатов докинга отобраны, закуплены и экспериментально исследованы 32 соединения, показавшие наилучшие результаты и свойства. Методами ЯМР-скрининга с применением разностной спектроскопии на переносе насыщения (STD) и экспериментов WaterLOGSY отобраны четыре соединения – лидера, для двух из которых показано наличие ингибирующих свойств. Методами INPHARMA и SAR-by-ILOE показано связывания отобранных соединений в одном и том же белковом кармане, соседним к карману, для которого на первом этапе выполнения проекта было найдено два других ингибитора МГЛ. Начаты экспериментальные исследования нового фармакологически перспективного белка – TEN домена теломеразы Ogataea polymorpha. Для этого белка выполнено отнесение сигналов в спектрах ЯМР и определена вторичная структура, что закладывает основу для дальнейшего определения структуры белка в растворе и изучения его динамических и функциональных свойств. За два года выполнения проекта в соответствии с запланированными показателями опубликовано 5 статей в журналах, реферируемых WoS, Scopus и РИНЦ.

 

Публикации

1. Kozin, S.A., Kulikova, A.A., Istrate, A.N., Tsvetkov, P.O., Zhokhov, S.S., Mezentsev, Y.V., Kechko, O.I., Ivanov, A.S., Polshakov, V.I., Makarov, A.A. The English (H6R) familial Alzheimer's disease mutation facilitates zinc-induced dimerization of the amyloid-beta metal-binding Metallomics, 7(3): 422-425 (год публикации - 2015).

2. Lizunov, A.Y., Gonchar, A.L., Zaitseva, N.I., Zosimov, V.V. Accounting for Intraligand Interactions in Flexible Ligand Docking with a PMF-Based Scoring Function Journal of Chemical Information and Modeling, 55(10): 2121-2137 (год публикации - 2015).

3. Mantsyzov, A.B., Shen, Y., Ho Lee, J., Hummer, G., Bax, A. MERA: a webserver for evaluating backbone torsion angle distributions in dynamic and disordered proteins from NMR data Journal of Biomolecular NMR, 63(1): 85-95 (год публикации - 2015).

4. Smirnova, E., Safenkova, I., Stein-Margolina, V., Shubin, V., Polshakov, V., Gurvits, B. pH-responsive modulation of insulin aggregation and structural transformation of the aggregates Biochimie, 109(2): 49-59 (год публикации - 2015).


Аннотация результатов, полученных в 2016 году
В ходе исследований, проведенных в 2016 году, основные усилия были сосредоточены на решении актуальных задач молекулярной фармакологии методами и программными средствами, разработанными на предыдущих этапах. Определена структура высокого разрешения в растворе N-терминального домена (TEN) основной каталитической субъединицы TERT теломеразы из термофильных дрожжей Ogataea polymorpha. Координаты атомов депонированны в банк белковых структур (http://www.rcsb.org) с кодом доступа 5LGF. Исследованы динамические свойства белковой цепи TEN в шкале времени от пс до мс. Методами гетероядерной спектроскопии ЯМР изучено взаимодействие TEN домена с потенциальными партнерами по связыванию. Установлено, что TEN домен специфически связывается с короткими фрагментами одноцепочечной РНК и гетеродуплексами РНК-ДНК, содержащими теломерные повторы. Это может определять роль этого фрагмента TERT в механизме реакции удлинения цепи ДНК, катализируемой теломеразой. Получено отнесение сигналов ЯМР основной белковой цепи еще одной субъединицы теломеразы термофильных дрожжей Ogataea polymorpha - белка Est3. Определены элементы вторичной структуры этого белка. Начато исследование методами ЯМР нового фармакологически важного объекта -метилтрансферазы WBSCR27, продукта одного из генов, ассоциированных с генетическим заболеванием (синдромом Вильямса). Получена информация об отнесении сигналов аминокислотных остатков WBSCR27 и вторичной структуре белка. Методами ЯМР определено строение серии антибиотиков - аналогов амфотерицина B и исследовано взаимодействие рифабутина с циклодекстринами с целью повышения биодоступности препарата. Проведен поиск потенциальных ингибиторов C. freundii метионин гамма-лиазы (МГЛ) на основе структур фрагментов, связывающихся с ферментом в соседних участках. Методами ЯМР-скрининга в отобранной группе соединений найдены два соединения, связывающиеся с МГЛ. Проведена модификация программы докинга Algocomb с целью усовершенствования оценочной функции для осуществления более точной оценки свободной энергии образования белок-лигандного комплекса. Разработан интерфейс для интеграции программы SpINPHARMA в ранее оптимизированный программный пакет для моделирования белок-лигандных взаимодействий. За 2016 год в соответствии с запланированными показателями опубликовано 4 статьи в журналах, реферируемых WoS, Scopus и РИНЦ. Получены 3 авторских свидетельства на программное обеспечение. Результаты выполнения проекта представлены в 2016 году на 9-ти международных и российских конференциях и научных школах в виде 2 пленарных, 7 устных и 6 стендовых докладов.

 

Публикации

1. Аншакова А.В., Виноградов Е.В., Седуш Н.Г., Куртикян Т.С., Жохов С.С., Польшаков В.И., Ермоленко Ю.В., Конюхов В.Ю., Максименко О.О., Гельперина С.Э. Межмолекулярные взаимодействия в растворах рифабутин–2-гидроксипропил-β-циклодекстрин–вода по данным о растворимости Журнал физической химии, 90(5): 714-720 (год публикации - 2016).

2. Линге И.А., Кондратьева Е.В., Кондратьева Т.К., Макаров В.А., Польшаков В.И., Савельев О.Ю., Апт А.С. «Супрессорный фактор нейтрофилов»: краткая история долгого заблуждения Биохимия, 81(11): 1530 – 1539 (год публикации - 2016).

3. Польшаков В.И. Свидетельство о государственной регистрации программы для ЭВМ NMRest -, 2016612620 (год публикации - ).

4. Польшаков В.И. Свидетельство о государственной регистрации программы для ЭВМ Muses -, 2016618357 (год публикации - ).

5. Польшаков В.И. Свидетельство о государственной регистрации программы для ЭВМ RelaxFit -, 2016660378 (год публикации - ).

6. Польшаков В.И., Петрова О.А., Парфенова Ю.Ю., Ефимов С.В., Клочков В.В., Зверева М.Э., Донцова О.А. NMR assignments of the N-terminal domain of Ogataea polymorpha telomerase reverse transcriptase Biomolеcular NMR Assignments, 10(1): 183-187 (год публикации - 2016).

7. Тевашова А.Н., Королев А.М., Тренин А.С., Деженкова Л.Г., Штиль А.А., Польшаков В.И., Савельев О.Ю., Олсуфьева Е.Н. New conjugates of polyene macrolide amphotericin B with benzoxaboroles: synthesis and properties The Journal of Antibiotics, 69(7): 549-560 (год публикации - 2016).


Возможность практического использования результатов
не указано