КАРТОЧКА ПРОЕКТА,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ


Номер 14-14-00557

НазваниеИзменение скорости диффузии морфогенов как механизм регуляции морфогенетического поля.

РуководительЗарайский Андрей Георгиевич, Доктор биологических наук

Организация финансирования, регионФедеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук, г Москва

Года выполнения при поддержке РНФ 2014 - 2016  , продлен на 2017 - 2018. Карточка проекта продления (ссылка)

КонкурсКонкурс 2014 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами»

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни, 04-106 - Биология развития

Ключевые словаэмбриональное развитие, эмбриональные регуляции, дифференцировка клеток, морфогены, морфогенетическое поле, диффузия секретируемых белков, визуализация белков in vivo, экспрессия генов.

Код ГРНТИ34.15.49


СтатусУспешно завершен


 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ


Аннотация
Предлагаемый проект направлен на решение одной из важнейших проблем биологии развития - выяснение молекулярных механизмов формирования т.н. морфогенетических полей - крупномасштабных динамических структур, обеспечивающих правильную пространственную разметку эмбриональных зачатков. Главная цель проекта - изучение обнаруженного в предварительных экспериментах на эмбрионах шпорцевой лягушки эффекта зависимости скорости диффузии морфогенетически активных и, как правило, секретируемых белков (морфогенов) от общего размера эмбриона. Данный эффект указывает на не известный ранее механизм регуляции градиентов морфогенов и, таким образом, его изучение может стать, с одной стороны, эффективным подходом к выяснению новых принципов формирования морфогенетических полей, а с другой, послужить основой для нового направления исследований в этой важной области синтетической биологии. Также в ходе работы над проектом впервые будут получены данные о коэффициентах диффузии и константах связывания со своими партнерами ряда известных морфогенов непосредственно в условиях живого эмбриона. Эти данные важны для численного моделирования реальных механизмов, обеспечивающих целостность эмбрионального развития. Кроме того, планируется с помощью метода высокопроизводительного секвенирования транскриптомов провести широкоформатный поиск генов, вовлеченных в механизмы эмбрионального скейлинга - согласованного изменения размеров эмбриональных зачатков в зависимости от общего размера эмбриона.

Ожидаемые результаты
В результате выполнения проекта на модели эмбрионов шпорцевой лягушки будет изучен не известный ранее эффект зависимости скорости диффузии морфогенетически активных секретируемых белков (морфогенов) от размеров эмбриона. Данный эффект указывает на новый механизм регуляции градиентов морфогенов и, таким образом, его изучение может стать, с одной стороны, эффективным подходом к выяснению принципов формирования морфогенетических полей, а с другой, послужить основой для нового направления исследований в этой важной области синтетической биологии. С помощью разработанного в ходе проекта комплекса методов впервые будут измерены в живом эмбрионе шпорцевой лягушки коэффициенты диффузии ряда важнейших морфогенов, обеспечивающих раннюю дифференцировку зачатка центральной нервной системы: Noggin1, Noggin2, Noggin4, Wnt5a, Wnt8, Wnt11, а также некоторых других. Эти данные важны для численного моделирования реальных механизмов, обеспечивающих целостность эмбрионального развития. Будет разработана методика на основе технологий in vivo визуализации (in vivo imaging) флуоресцентно-меченных секретируемых белков позволяющая измерять константу связывания двух взаимодействующих секретируемых белков непосредственно в эивом эмбрионе шпорцевой лягушки. С помощью этой методики будут измерены константы связывания белков Noggin1, Noggin2 и Noggin4 c белками ActivinB, BMP4, Wnt8 и некоторыми другими. Разработанная методика будет востребована поскольку до сих пор отсутствуют методы для измерения констант взаимодействия белков непосредственно в живых тканях и целых организмах. Между тем, такие данные крайне важны как для фундаментальных исследований, так и для биомедицинских приложений. С помощью метода высокопроизводительного секвенирования транскриптомов будет проведен широкоформатный поиск генов, вовлеченных в механизмы эмбрионального скейлинга - согласованного изменения размеров эмбриональных зачатков в зависимости от общего размера эмбриона. Данные, полученные в ходе этой работы заложат хорошую основу для будущих исследований механизмов скейлинга. Полученные результаты будут опубликованы в виде статей в ведущих мировых научных журналах соответствующего профиля и доложены на конференциях.


 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ


Аннотация результатов, полученных в 2014 году
В отчетный период на модели эмбрионов шпорцевой лягушки Xenopus laevis разработан оригинальный комплекс методов для прижизненного выявления и изучения диффузии флуоресцентно-меченных секретируемых морфогенов в межклетниках эктодермы эмбрионов. С помощью разработанных методов впервые были измерены коэффициенты диффузии таких флуоресцентно-меченных морфогенов, как EGFP-Noggin1, EGFP-Noggin2, EGFP-Noggin4, EGFP-Wnt8 и некоторых других в межклетниках эктодермы эмбрионов на стадиях ранней-средней гаструлы. Сравнение измеренных коэффициентов диффузии впервые позволило подтвердить гипотезу о том, что белок Noggin4 является морфогеном, свободно диффундирующим в межклетниках, без интенсивного взаимодействия с компонентами межклеточного матрикса. В отличие от Noggin4, белки Noggin1, Noggin2 и Wnt8 диффундируют на порядок медленнее из-за взаимодействий с матриксом. Разработана математическая модель диффузии белков, способных взаимодействовать с компонентами межклеточного матрикса. На основе этой модели создан метод, позволяющий изучать взаимодействие секретируемых белков непосредственно в межклетниках живых эмбрионов. С помощью этого метода впервые подтверждено взаимодействие белков Noggin4 и Wnt8 в условиях in vivo (непосредственно в живом эмбрионе). С помощью метода ПЦР в реальном времени проведено исследование экспрессии специфичных для раннего развития генов гепаран-сульфат-протеогликанов в нормальных эмбрионах шпорцевой лягушки и в эксплантатах анимальной эктодермы (модель маленьких эмбрионов). В результате на стадии ранней гаструлы выявлен эффект усиления экспрессии нескольких протеогликанов в анимальных эксплантатах. Данный результат важен с точки зрения экспериментального обоснования гипотезы о возможном механизме регуляции пространственной разметки в эмбриогенезе путем изменения свойств пространства, в котором происходит диффузия морфогенов.

 

Публикации

1. Ivanova A.S., Shandarin I.N., Ermakova G.V., Minin A.A., Zaraisky A.G. The secreted factor Ag1 missing in higher vertebrates regulates fins regeneration in Danio rerio Scientific Reports, - (год публикации - 2015).

2. Matlashov M.E., Bogdanova Y.A., Ermakova G.V., Mishina N.M., Ermakova Y.G., Nikitin E.S., Balaban P.M., Okabe S., Lukyanov S.A., Enikolopov G., Zaraisky A.G. (co-corresponding author), Belousov V.V. Fluorescent ratiometric pH indicator SypHer2: applications in neuroscience and regenerative biology BBA General Subjects, - (год публикации - 2015).

3. Pereverzev A.P., Gurskaya N.G., Ermakova G.V., Kudryavtseva E.I., Markina N.M., Kotlobay A.A., Lukyanov S.A., Zaraisky A.G, Lukyanov K.A. Method for quantitative analysis of nonsense-mediated mRNA decay at single cell level Scientific Reports, - (год публикации - 2015).


Аннотация результатов, полученных в 2015 году
В отчетный период на модели эмбрионов шпорцевой лягушки был разработан метод оценки константы диссоциации комплекса двух секретируемых белков непосредственно в межклеточном пространстве живой ткани эмбриона. Данный метод основан на обработке с помощью созданной ранее математической модели данных FRAP (fluorescence recovery after photobleaching) для секретируемых белков, меченных EGFP и TagRFP. С помощью разработанного метода была проведена оценка константы диссоциации двух секретируемых белков-морфогенов, Noggin4 и Wnt8, экспрессированных в эмбрионе в составе гибридов с EGFP и TagRFP: 10 nM<Kd<100 nM. Полученная оценка была подтверждена in vitro, в результате анализа взаимодействия очищенных белков Noggin4 и Wnt8 методом плазмонного резонанса и количественной ко-иммунопреципитации. Разработанный метод оценки аффинности секретируемых белков в межклеточном пространстве живого эмбриона важен, поскольку он позволяет проводить такую оценку на функционально активных белках в их естественном микроокружении. Кроме того, в отличие от обычно используемых для подобных исследований in vitro-методов, он позволяет избежать часто чрезвычайно трудоемкой процедуры получения и очистки изучаемых белков. Кроме того в отчетный период был разработан оригинальный метод окрашивания гистологических срезов эмбрионов гибридом зеленого флуоресцентного белка и гепаран-сульфат связывающего мотива нейрализующего морфогена Noggin1 (EGFP-hepNog1). С помощью данного метода исследовали влияние гепаран-сульфат протеогликанов (ГСПГ) на формирование морфогенетических градиентов на модели эмбрионов шпорцевой лягушки. В результате впервые был выявлен двух-вершинный градиент сайтов связывания ГСПГ в эмбрионе в период гаструляции-нейруляции, с наибольшим максимумом в области шпемановского организатора и с меньшим максимумом в области будущего головного мозга. Также впервые было показано, что в процессе эмбриональной переразметки, которой подвергается искусственно уменьшенный эмбрион, происходит закономерное изменение распределения сайтов связывания ГСПГ вдоль передне-задней оси эмбриона. Очевидно, что такое перераспределение сайтов связывания ГСПГ должно приводить к изменению свойств внеклеточного пространства, в которое секретируются морфогены и, следовательно, к изменению морфогенетических градиентов, влияющих на эмбриональную разметку. Полученные результаты важны, поскольку они впервые позволяют моделировать влияние ГСПГ на формирование градиентов белков-морфогенов в эмбрионе на основе реальных экспериментальных данных.

 

Публикации

1. Ivanova AS, Shandarin IN, Ermakova GV, Minin AA, Tereshina MB, Zaraisky AG. The secreted factor Ag1 missing in higher vertebrates regulates fins regeneration in Danio rerio. Scientific Reports, 5:8123, 1-9 (год публикации - 2015).

2. Matlashov ME, Bogdanova YA, Ermakova GV, Mishina NM, Ermakova YG, Nikitin ES, Balaban PM, Okabe S, Lukyanov S, Enikolopov G, Zaraisky AG, Belousov VV. Fluorescent ratiometric pH indicator SypHer2: Applications in neuroscience and regenerative biology. BBA General Subjects, 1850(11):2318-2328. (год публикации - 2015).

3. Nesterenko A.M., Orlov E.E., Ermakova G.V., Ivanov I.A, Semenyuk P. I., Orlov V. N., Martynova N. Y., Zaraisky A. G. Affinity of the heparin binding motif of Noggin1 to heparan sulfate and its visualization in the embryonic tissues. Biochemical and Biophysical Research Communications, 2015, 468(1-2):331-6. (год публикации - 2015).

4. Pereverzes A.P., Gurskaya N.G., Ermakova G.V., Kudryavtseva E.I., Markina N.M., Kotlobay A.A., Lukyanov S.A., Zaraisky A.G., Lukyanov K.A. Method for quantitative analysis of nonsense-mediated mRNA decay at the single cell level. Scientific Reports, 5:7729, 1-8 (год публикации - 2015).

5. А. В. Байрамов, Ф. М. Ерошкин, А. В. Бородулин, Н. Ю. Мартынова, Г. В. Ермакова, А. Г. Зарайский Белок Noggin4 участвует в формировании переднеголовных структур шпорцевой лягушки, ингибируя Wnt/beta catenin сигнальный каскад Онтогенез, - (год публикации - 2016).

6. Мартынова Н.Ю., Ермолина Л.В., Ерошкин Ф.М., Зарайский А.Г. The Cytoskeletal Protein Zyxin Interacts with the Hedgehog Receptor Patched Russian Journal of Bioorganic Chemistry, том 41, № 6, с. 744–748 (год публикации - 2015).


Аннотация результатов, полученных в 2016 году
В отчетный период на примере белков Noggin1 и BMP4 впервые была установлена универсальность пространственного градиента адсорбции в межклеточном пространстве зародыша шпорцевой лягушки на стадиях гаструляции и нейруляции для вентрально- и дорсально-экспрессирующихся морфогенных белков. Выявленная универсальность адсорбционного градиента - важный факт, который должен учитываться при математическом моделировании разметки дорсо-вентрального паттерна в эмбрионе на основе градиентов морфогенных белков. В ходе отчетного периода была также разработана модификация известной реакционно-диффузионной модели Гирера-Мейнхардта, учитывающая установленный нами факт адсорбции морфогенов на гепаран-сульфат протеогликанах в межклеточном пространстве. Важной особенностью разработанной модели является то, что вместо разных коэффициентов диффузии морфогенов (одно из необходимых условий возникновения неустойчивости Тьюринга) используются одинаковые коэффициенты, зато учитывается адсорбция активатора на неподвижных центрах связывания, для этого вводятся адсорбционные параметры: плотность центров и скорость адсорбции/десорбции. Такие условия являются более реалистичными, поскольку реальные морфогенные белки в следствии близких молекулярных размеров имеют сходные гидродинамические характеристики, но могут различаться по способности к адсорбции. Разработанная модель впервые показывает, как за счет разной адсорбционной способности в реальной системе может обеспечиваться важное условие для возникновения пространственно неоднородных динамических структур - разная подвижность морфогенов. Также в отчетный период было проведено сравнение экспрессии методом количественной ПЦР тех генов, которые были ранее обнаружены при вычитающем секвенировании транскриптомов интактных и уменьшенных разделением на стадии 2-х бластомеров зародышей. В результате были определены гены, уровень экспрессии которых действительно резко меняется при уменьшении размеров эмбриона. Среди этих генов были выявлены гены, белки кодируемые которыми участвуют в ре-моделировании внеклеточного матрикса и могут напрямую влиять на его свойства, в частности на способность адсорбции морфогенов. Дальнейшее изучение этих генов позволит продвинуться в понимании молекулярного механизма эмбрионального скейлинга на основе регуляции адсорбции морфогенов в межклеточном пространстве.

 

Публикации

1. - Лаборатория молекулярных основ эмбриогенеза: от гена к признаку Биомолекула, 18 сентября, 2016 г. (год публикации - ).

2. - New study reveals how frog heads are formed United Press International, June 20, 2016 at 11:49 AM (год публикации - ).

3. - Биологи выяснили, как формируется голова лягушек ГАЗЕТА.ru, 08.06.2016 | 12:25 (год публикации - ).

4. - NOGGIN ДЛЯ ГОЛОВЫ S&TRF Наука и Технологии РФ, 10.06.16 | Наука и техника: Естественные науки (год публикации - ).

5. Байрамов А. В., Ермакова Г.В., Ерошкин Ф. М., Кучерявый А. В. Мартынова Н. Ю., Зарайский А. Г. Гомеобоксный ген семейства Anf, обнаруженный у тихоокеанской миноги Lethenteron Camtschaticum, подтверждает гипотезу о важности появления генов Anf для возникновения конечного мозга в эволюции позвоночных. Онтогенез, - (год публикации - 2017).

6. Байрамов А.В., Ермакова Г.В., Ерошкин Ф.М., Кучерявый А.В., Мартынова Н.Ю., Зарайский А.Г. The presence of the Anf/Hesx1 homeobox in lampreys indicates that it may play important role in telencephalon emergence Scientific Reports, - (год публикации - 2017).

7. Ерошкин Ф.М., Нестеренко А.М., Бородулин А.В., Мартынова Н.Ю., Ермакова Г.В, Гиоева Ф.К., Орлов Е.Е., Белогуров А.А., Лукьянов К.А., Байрамов А.В., Зарайский А.Г. Noggin4 is a long-range inhibitor of Wnt8 signalling that regulates head development in Xenopus laevis Scientific Reports, 6:23049 (год публикации - 2016).

8. Нестеренко А.М., Кузнецов М.Б., Короткова Д.Д., Зарайский А.Г. Morphogene Adsorption as a Possible Turing Instability Regulator: Theoretical Analysis and Possible Applications in Multicellular Embryonic Systems PLOS ONE, - (год публикации - 2017).

9. Орлов Е.Е., Нестеренко А.М., Мартынова Н.Ю., Зарайский А.Г. Визуализация градиента сайтов адсорбциии морфогенов в эмбрионе шпорцевой лягушки с помощью флуоресцентно меченного гепарин-связывающегомотива морфогена BMP4 Биоорганическая химия, - (год публикации - 2017).