Аннотация результатов, полученных в 2014 году
В отчетный период на модели эмбрионов шпорцевой лягушки Xenopus laevis разработан оригинальный комплекс методов для прижизненного выявления и изучения диффузии флуоресцентно-меченных секретируемых морфогенов в межклетниках эктодермы эмбрионов. С помощью разработанных методов впервые были измерены коэффициенты диффузии таких флуоресцентно-меченных морфогенов, как EGFP-Noggin1, EGFP-Noggin2, EGFP-Noggin4, EGFP-Wnt8 и некоторых других в межклетниках эктодермы эмбрионов на стадиях ранней-средней гаструлы. Сравнение измеренных коэффициентов диффузии впервые позволило подтвердить гипотезу о том, что белок Noggin4 является морфогеном, свободно диффундирующим в межклетниках, без интенсивного взаимодействия с компонентами межклеточного матрикса. В отличие от Noggin4, белки Noggin1, Noggin2 и Wnt8 диффундируют на порядок медленнее из-за взаимодействий с матриксом. Разработана математическая модель диффузии белков, способных взаимодействовать с компонентами межклеточного матрикса. На основе этой модели создан метод, позволяющий изучать взаимодействие секретируемых белков непосредственно в межклетниках живых эмбрионов. С помощью этого метода впервые подтверждено взаимодействие белков Noggin4 и Wnt8 в условиях in vivo (непосредственно в живом эмбрионе). С помощью метода ПЦР в реальном времени проведено исследование экспрессии специфичных для раннего развития генов гепаран-сульфат-протеогликанов в нормальных эмбрионах шпорцевой лягушки и в эксплантатах анимальной эктодермы (модель маленьких эмбрионов). В результате на стадии ранней гаструлы выявлен эффект усиления экспрессии нескольких протеогликанов в анимальных эксплантатах. Данный результат важен с точки зрения экспериментального обоснования гипотезы о возможном механизме регуляции пространственной разметки в эмбриогенезе путем изменения свойств пространства, в котором происходит диффузия морфогенов.

Аннотация результатов, полученных в 2015 году
В отчетный период на модели эмбрионов шпорцевой лягушки был разработан метод оценки константы диссоциации комплекса двух секретируемых белков непосредственно в межклеточном пространстве живой ткани эмбриона. Данный метод основан на обработке с помощью созданной ранее математической модели данных FRAP (fluorescence recovery after photobleaching) для секретируемых белков, меченных EGFP и TagRFP. С помощью разработанного метода была проведена оценка константы диссоциации двух секретируемых белков-морфогенов, Noggin4 и Wnt8, экспрессированных в эмбрионе в составе гибридов с EGFP и TagRFP: 10 nM<Kd<100 nM. Полученная оценка была подтверждена in vitro, в результате анализа взаимодействия очищенных белков Noggin4 и Wnt8 методом плазмонного резонанса и количественной ко-иммунопреципитации. Разработанный метод оценки аффинности секретируемых белков в межклеточном пространстве живого эмбриона важен, поскольку он позволяет проводить такую оценку на функционально активных белках в их естественном микроокружении. Кроме того, в отличие от обычно используемых для подобных исследований in vitro-методов, он позволяет избежать часто чрезвычайно трудоемкой процедуры получения и очистки изучаемых белков. Кроме того в отчетный период был разработан оригинальный метод окрашивания гистологических срезов эмбрионов гибридом зеленого флуоресцентного белка и гепаран-сульфат связывающего мотива нейрализующего морфогена Noggin1 (EGFP-hepNog1). С помощью данного метода исследовали влияние гепаран-сульфат протеогликанов (ГСПГ) на формирование морфогенетических градиентов на модели эмбрионов шпорцевой лягушки. В результате впервые был выявлен двух-вершинный градиент сайтов связывания ГСПГ в эмбрионе в период гаструляции-нейруляции, с наибольшим максимумом в области шпемановского организатора и с меньшим максимумом в области будущего головного мозга. Также впервые было показано, что в процессе эмбриональной переразметки, которой подвергается искусственно уменьшенный эмбрион, происходит закономерное изменение распределения сайтов связывания ГСПГ вдоль передне-задней оси эмбриона. Очевидно, что такое перераспределение сайтов связывания ГСПГ должно приводить к изменению свойств внеклеточного пространства, в которое секретируются морфогены и, следовательно, к изменению морфогенетических градиентов, влияющих на эмбриональную разметку. Полученные результаты важны, поскольку они впервые позволяют моделировать влияние ГСПГ на формирование градиентов белков-морфогенов в эмбрионе на основе реальных экспериментальных данных.

Аннотация результатов, полученных в 2016 году
В отчетный период на примере белков Noggin1 и BMP4 впервые была установлена универсальность пространственного градиента адсорбции в межклеточном пространстве зародыша шпорцевой лягушки на стадиях гаструляции и нейруляции для вентрально- и дорсально-экспрессирующихся морфогенных белков. Выявленная универсальность адсорбционного градиента - важный факт, который должен учитываться при математическом моделировании разметки дорсо-вентрального паттерна в эмбрионе на основе градиентов морфогенных белков. В ходе отчетного периода была также разработана модификация известной реакционно-диффузионной модели Гирера-Мейнхардта, учитывающая установленный нами факт адсорбции морфогенов на гепаран-сульфат протеогликанах в межклеточном пространстве. Важной особенностью разработанной модели является то, что вместо разных коэффициентов диффузии морфогенов (одно из необходимых условий возникновения неустойчивости Тьюринга) используются одинаковые коэффициенты, зато учитывается адсорбция активатора на неподвижных центрах связывания, для этого вводятся адсорбционные параметры: плотность центров и скорость адсорбции/десорбции. Такие условия являются более реалистичными, поскольку реальные морфогенные белки в следствии близких молекулярных размеров имеют сходные гидродинамические характеристики, но могут различаться по способности к адсорбции. Разработанная модель впервые показывает, как за счет разной адсорбционной способности в реальной системе может обеспечиваться важное условие для возникновения пространственно неоднородных динамических структур - разная подвижность морфогенов. Также в отчетный период было проведено сравнение экспрессии методом количественной ПЦР тех генов, которые были ранее обнаружены при вычитающем секвенировании транскриптомов интактных и уменьшенных разделением на стадии 2-х бластомеров зародышей. В результате были определены гены, уровень экспрессии которых действительно резко меняется при уменьшении размеров эмбриона. Среди этих генов были выявлены гены, белки кодируемые которыми участвуют в ре-моделировании внеклеточного матрикса и могут напрямую влиять на его свойства, в частности на способность адсорбции морфогенов. Дальнейшее изучение этих генов позволит продвинуться в понимании молекулярного механизма эмбрионального скейлинга на основе регуляции адсорбции морфогенов в межклеточном пространстве.