Аннотация результатов, полученных в 2014 году
Настоящий проект направлен на исследование влияния белка человека Ku, представляющего собой гетеродимер Ku70/Ku80, на процесс репликации ВИЧ-1 с целью выявления новых мишеней для создания противовирусных препаратов. Роль клеточного белка Ku в репликации вируса еще не до конца изучена, однако предполагается, что он может участвовать, по крайней мере, в двух стадиях жизненного цикла ВИЧ-1: защите вирусной интегразы (ИН) от протеасомной деградации и активации транскрипции с интегрированного провируса. Еще одной стадией, в которой может участвовать белок Ku, является репарация одноцепочечных разрывов, возникающих в геноме человека после интеграции в него вирусной ДНК. Таким образом, Ku может оказаться очень перспективной мишенью для ингибирования репликации ВИЧ-1. В рамках изучения роли белка Ku в процессе протеасомной деградации ИН, нами была проведена оценка способности ИН взаимодействовать с компонентами 20S субъединицы ядерной протеасомы. Иммунопреципитация ИН из клеток, трансфецированных вектором, содержащим геном ИН, показала, что в осажденной фракции присутствует как компоненты 20S протеосомы, так и одна из субъединиц белка Ku - Ku70. В ходе изучения локализации ИН в клетке мы установили, что в условиях суперэкспрессии ИН присутствует как в ядре, так и в цитоплазме клеток. Этот эффект мы наблюдали как при детекции ИН методом вестерн-блота при предварительном разделении лизатов на ядерную и цитоплазматическую фракции, так и при непосредственном окрашивании трансфецированных клеток. Следует отметить, что добавление к культуре клеток ингибитора протеосом MG132 приводило к увеличению количества ИН, что подтверждает опубликованные раннее данные об убиквитин-зависимой деградации ИН. Таким образом, было показано, что ИН взаимодействует с компонентами 20S субъединицы протеасомы. Исследование роли белка Ku в транскрипции провируса или в репарации одноцепочечных разрывов было решено начать в экспериментах in vitro. Для этого необходимо было получить препараты белков Ku70 и Ku80, способные формировать гетеродимер Ku, и создать модель, которая позволила бы изучать связывание Ku с определенной «внутренней» структурой ДНК, имитирующей интегрированный провирус, и избежать при этом характерного для Ku неспецифического связывания с концами двуцепочечной ДНК. В качестве такой модели были использованы ДНК-дуплексы, концы которых закрыты комплексом биотина со стрептавидином. Поскольку известно, что Ku способен эффективно связываться с дуплексами, в которых один или оба конца закрыты петлями, мы предположили, что в случае интегрированного длинного концевого повтора (long terminal repeat - LTR) Ku в первую очередь связывается в участках с необычной вторичной структурой, например, в области формирования крестообразных структур. Поскольку картина взаимодействия Ku с LTR ВИЧ-1 ранее не была изучена, для начала было решено исследовать взаимодействие с полноразмерным LTR (1-633) и LTR, разбитым на две части 1-372 и 355-633. Получение выбранных участков LTR было проведено с помощью ПЦР с использованием LTR-содержащей плазмиды в качестве матрицы и праймеров, которые содержали на 5’-конце (dT)3-линкер, в котором внутренний тимидин содержал остаток биотина, присоединенный к С5 положению тимина посредством линкера. Для изучения взаимодействия Ku с ДНК-дуплексами, имитирующими структуру ДНК после интеграции в нее вирусной ДНК, получены дуплексы, состоящие из 3-х олигонуклеотидов, два из которых содержали остаток биотина на 3’-конце. Показано, что биотин-содержащие дуплексы образуют с белком стрептавидином комплексы, в которых при молярном соотношении ДНК:стрептавидин = 1:2 оба конца ДНК в основном закрыты белком, и эти комплексы могут быть использованы для изучения связывания ДНК с гетеродимером Ku. Далее была получена бицистронная плазмидной конструкция для одновременной экспрессии в E.coli компонентов гетеродимера Ku (Ku70 и Ku80), были разработаны условия экспрессии этих белков в E.coli, и гетеродимерный белок Ku70/Ku80 был наработан и очищен афинной хроматографии на Ni-NTA агарозе. К сожалению, из-за изначально высокой молекулярной массы комплексов ДНК со стрептавидином, нам не удалось однозначно идентифицировать продукты присоединения Ku к исследуемым ДНК-моделям. В дальнейшем мы планируем иммобилизовать один из компонентов системы на аффинных сорбентах, что позволит однозначно ответить на вопрос о формировании комплекса Ku с ДНК. Кроме этого, для более детального исследования взаимодействия Ku с ДНК в проекте планируется применить метод кросс-линкинга (ковалентной сшивки макромолекул). Он позволяет протестировать сближенность определенных участков макромолекул в изучаемом комплексе. Ранее в нашей научной группе были разработаны различные реакционноспособные группировки, вводимые в состав фрагментов ДНК. В ходе реализации проекта, нами получено два типа реакционно способных ДНК-дуплексов: содержащие в углеводофосфатном остове дисульфидную группу для реакции с остатками цистеина в белке и содержащие альдегидную группировку в 2’-положении модифицированного остатка уридина для взаимодействия с остатками лизина в белке. Эти группы были выбраны для работы, поскольку гетеродимер Ku содержит более 20 остатков лизина и кроме того белок Ku 70 содержит 2 остатка цистеина в ДНК-связывающем центре. В связи с тем, что нам не удалось получить однозначные результаты по определению участка LTR, взаимодействующего с Ku, характеристика реакционной способности полученных ДНК проводилась на модельных системах. Так тестирование ДНК, содержащих дитиопроизводные, проводилось на белке MutS из E. coli, который как и Ku связывается с ДНК не сиквенс-специфично и формирует скользящий зажим (структуру, где ДНК находится внутри кольца, образованного двумя субъединицами MutS), который может затем двигаться вдоль ДНК. Исследование взаимодействия MutS с ДНК, содержащими дисульфидную группу показало, что эффективное ковалентное связывание с белком MutS только в случае непосредственного сближения остатка цистеина с реакционноспособной группировкой либо в процессе сканирования ДНК, либо при образовании специфического ДНК-белкового комплекса. Реакционная способность 2’-альдегид-содержащих ДНК исследовалась на примере эндонуклеазы рестрикции MboI. Подобраны оптимальные условия получения ковалентно связанного белково-нуклеинового комплекса. Таким образом, все сконструированные нами ДНК-дуплексы, содержащие реакционно-способные группировки, проявили себя как перспективные реагенты для получения конъюгатов с белком Ku.

Аннотация результатов, полученных в 2015 году
Настоящий проект направлен на исследование влияния белка человека Ku, представляющего собой гетеродимер Ku70/Ku80, на процесс репликации ВИЧ-1 с целью выявления новых мишеней для создания противовирусных препаратов. Роль клеточного белка Ku в репликации вируса еще не до конца изучена, однако предполагается, что он может участвовать, по крайней мере, в двух стадиях жизненного цикла ВИЧ-1: защите вирусной интегразы (ИН) от протеасомной деградации и активации транскрипции с интегрированного провируса. Еще одной стадией, в которой может участвовать белок Ku, является репарация одноцепочечных разрывов, возникающих в геноме человека после интеграции в него вирусной ДНК. Таким образом, Ku может оказаться очень перспективной мишенью для ингибирования репликации ВИЧ-1. В рамках изучения способности ИН взаимодействовать с компонентами 20S субъединицы ядерной протеасомы мы впервые показали, что ИН в условиях суперэкспрессии в клетках взаимодействует с 20S протеосомой, при этом, предположительно, это взаимодействие локализуется в районе α2 субъединицы. Связывания ИН с α6 субъединицей протеасомы нами не детектировалось. В дальнейшем мы планируем выявить домен ИН, непосредственно взаимодействующий с протеасомой. Увеличение экспрессии Ku70 в наших условиях никак не сказалось на соосаждении α2 субъединицы с ИН. Возможно, это обусловлено очень высоким уровнем содержания эндогенногоKu70, поскольку мы обнаружили, что суперэкспрессия Ku70 с кодирующего его вектора приводит лишь к 1.2-кратному увеличению количестваэтого белка в клетке. Вместе с тем, уменьшение количества эндогенного Ku70 в клетке путем его нок-дауна приводит к соответствующему уменьшению количества соосажденной α2 субъединицы. В рамках исследований по оценке способности интегразы взаимодействовать с 20S протеасомой в условиях инфекции клеток человека репликативно-некомпетентным вектором на основе ВИЧ-1, нам также удалось детектировать связывание ИН и α2 субъединицы протеосомы. Интересно отметить, что инфекция вирусом приводила к снижению количества Ku70 в клетках на 40-50%. Это достаточно неожиданный эффект, который требует дальнейшего изучения. Есть данные о том, что для некоторых вирусов, например для вируса осповакцины, DNA-PK и Ku70 участвуют в процессе ДНК-сенсинга и активации внутриклеточного противовирусного иммунитета (PetersN.E. etal., PLOSPathogen, 2013), однако для ВИЧ-1 таких данных до сих пор получено не было. В рамках анализа влияния белка Ku70 на стабильность ИН, мы показали, что суперэкспрессия полноразмерного белка Ku70 защищает интегразу от протеасомной деградации при ко-экспрессии обоих белков в клетках. Уменьшение количества Ku70 путем его нок-дауна приводило к соответствующему уменьшению содержания интегразы в клетках. Эффект не превышал 25%, что хорошо коррелирует с данными о 20%-ом повышении суммарного уровня экспрессии Ku70 при его суперэкспрессии . Также в экспериментах in vitro с рекомбинантными белками мы показали (Anisenko A. et al., FEBS J., 2014), что домена Ku70(1-250) достаточно для формирования стабильного комплекса с интегразой. В этой связи мы решили исследовать, может ли этот домен защищать ИН от протеолитической деградации. Мы получили конструкцию, кодирующую делеционный мутант Ku70(а.к.1-250), а также конструкцию, кодирующую мутант Ku70(250-609). Однако достоверного влияния этих белков на стабильность ИН нам установить не удалось. Возможно, HA-метка, находящаяся С-конце всех наших эукариотических конструкций, кодирующих ИН, влияет на взаимодействие интегразы с делеционными мутантами Ku70 и мешает нам детектировать их эффект на стабильность интегразы в клетке. Мы преступили к созданию конструкций, кодирующих интегразу ВИЧ-1, в которых НА-метка находится на N-конце белка. Еще одной причиной, препятствующей получению достоверных результатов по влиянию делеционных мутантов Ku70 на стабильность интегразы, может быть низкий уровень экспрессии этих белков с плазмиды по сравнению с общим количеством Ku70 в клетках. Таким образом, для достоверного наблюдения за влиянием делеционных мутантов Ku70 на стабильность интегразы в клетках и на ее взаимодействие с протеосомой необходимо будет поставить эксперимент, в котором экспрессия эндогенного Ku70 будет подавлена, а клетки будут котрансфецированы интегразой и делеционным мутантом Ku70. К сожалению, подобранные нами на предыдущем этапе работы siРНК к Ku70 также будут подавлять и экспрессию его делеционного мутанта Ku70(1-250). Таким образом, необходимо подобрать siРНК, комплементарные С-концевой части Ku70, которые не подавляли бы экспрессию Ku70(1-250). Мы предполагаем, что в такой системе мы сможем достоверно детектировать эффект от Ku70 и его делеционных мутантов на стабильность ИН в клетках и на ее взаимодействие с протеосомой. Для увеличения чувствительности детекции мРНК Ku70 методом количественного ПЦР проведено сравнение красителей для выбора оптимального. Для исследования роли белка Ku в транскрипции провируса необходимо было создать модель, которая позволила бы изучать связывание Ku с определенной «внутренней» структурой ДНК, имитирующей интегрированный провирус, и избежать при этом характерного для Ku неспецифического связывания с концами двуцепочечной ДНК. В качестве такой модели на первом этапе выполнения проекта было решено использовать ДНК-дуплексы, концы которых закрыты комплексом биотина со стрептавидином. Методом ПЦР с полноразмерного LTR ВИЧ-1 в присутствии 32P-меченного α-dATP были получены радиоактивно меченные полноразмерный LTR (участок 1-633), а также LTR, разбитый на две части (участки 1-372 и 355-633). Все праймеры имели на 5’-конце (dT)3-спейсер, в котором внутренний тимидин содержал остаток биотина, присоединенный к С5 положению гетероциклического основания посредством линкера, что позволяет закрыть оба конца полученного ПЦР-продукта объемными молекулами стрептавидина. Полученные LTR/стрептавидин комплексы инкубировались с гетеродимером Ku, содержащим 6His-tag на N-конце субъединицы Ku70, а затем иммобилизовались на Ni-NTA-агарозе. В качестве контролей на Ni-NTA-агарозу также наносили участки LTR, обработанные стрептавидином, но без Ku, а также комплекс Ku c радиоактивно-меченым 21-звенным участком U5 LTR со свободными концами. Оказалось, что при инкубации Ku c тремя полученными комплексами LTR/стрептавидин во всех случаях на смоле остается связанной порядка 30% ДНК. Тогда как в отсутствие Ku на смоле детектируется не более чем 3%-ное неспецифическое осаждение ДНК. В случае 21-звенного участка U5 LTR со свободными концами эффективность соосаждения Ku и ДНК составила порядка 60%. Таким образом, нами впервые в экспериментах с рекомбинантным препаратом Ku была продемонстрирована его способность связываться с внутренними участками ДНК. В дальнейшем мы планируем разбить последовательность LTR на шесть частично перекрывающихся участков: 1-150, 125-272, 241-372, 355-507, 442-568, 492-633 для того, чтобы точно установить те, которые Ku будет связывать наиболее эффективно. Возможность сиквенс-специфичного связывания Ku с внутренними областями ДНК предполагается в ряде работ (Giffin W.etal., J.Biol. Chem. 1997,272,5647-5658;GiffinW.etal., Nature,1996,380, 265-268), однако четких эксперименальных подтверждений этого до сих пор получено не было. Мы решили экспериментально проверить возможность связывания рекомбинантного Ku c короткими (порядка 20 звеньев) ДНК с «закрытыми» концами. В качестве модели такой ДНК была выбрана составная конструкция, содержащая внутренний 21-звенный предполагаемый сайт связывания Ku в промоторе GR-штамма вируса MMTV (mouse mammary tumor virus) (Giffinetal., JBiolChem, 1997, 272(9), 5647-5658) и концевые последовательностями, формирующие короткие ДНК-шпильки и 7-звенные дуплексы, с которыми гетеродимер Ku по данным работы (WalkerJ.R., Nature, 2001, 412, 607-614) не взаимодействует. Нами был проведен дизайн и синтез олигонуклеотидов, из которых формировали необходимую структуру. Методом торможения в геле было изучено взаимодействия такой ДНК с гетеродимером Ku. В качестве контроля использовали 21-звенный участок U5 LTR со свободными концами. Оказалось, что Ku эффективно связывает не только ДНК со свободными концами, но и изучаемую составную конструкцию. На следующем этапе мы планируем получить конструкции подобной структуры, содержащие различные внутренние участки из LTR ВИЧ-1, а также контрольные "случайные" последовательности ДНК. Ковалентное специфичное присоединение белков к ДНК (кросс-линкинг) позволяет не только изучать детали НК-белковых взаимодействий, но и понять особенности функционирования сложных динамических белковых ансамблей, взаимодействующих с ДНК, за счет фиксации одного из компонентов на нуклеиновой кислоте. В этой связи было решено использовать этот метод для более детального исследования взаимодействия Ku с ДНК. Для отработки условий реакции в качестве модельного объекта исследования был выбран белок MutS из E coli. Как и белок Ku, белок MutS является участником системы репарации ДНК в клетке. Оба белка (Ku и MutS) кольцом обвиваются вокруг ДНК-дуплекса, но при этом не взаимодействуют с основаниями ДНК, а образуют несколько контактов с углеводофосфатным остовом, поэтому использование MutS в качестве модельного белка являлось правомерным. Синтезированы 3'-амидофосфитные производные 2'-дезоксиуридина с терминальной этинильной группировкой, присоединенной к С5-атому урацила с помощью линкеров различной длины, и олигодезоксирибонуклеотиды с включениями данных модифицированных звеньев – предшественники химически активных фрагментов ДНК. С высокими выходами получена серия ДНК, содержащих акриламидную группировку, которые были успешно использованы для аффинной модификации белка системы репарации неканонических пар нуклеотидов – MutS. Показано, что реакция кросслинкинга эффективна, региоселективна и специфична и может быть рекомендована для зондирования ДНК-белковых контактов в комплексе Ku с ДНК. В экспериментах на модельной системе также установлено, что для изучения окружения остатка цистеина в комплексах гетеродимерных белков с ДНК удобно использовать метод «фотосшивки» ДНК-белкового комплекса с помощью бифункционального фотоактивируемого реагента 4-(N-малеимидо)бензофенона. Одним из наиболее частых повреждений ДНК является окисление двойной связи тимидина с образованием 5,6-дигидро-5,6-дигидрокситимидина (тимидингликоля, Tg). Удаление Tg приводит к образованию апуриновых сайтов, в репарации которых важную роль играет гетеродимер Ku (Kosova AA. et al., Mol Biol (Mosk). 2015, 49(1), 67-74). Нами был осуществлен синтез модифицированных фрагментов ДНК с остатком тимидингликоля в различных положениях олигонуклеотидной цепи, с использованием которых впервые обнаружено влияние Tg на взаимодействие ДНК с фактором транскрипции NF-карраВ. Установлено, что эффективность связывания NF-κB с модифицированными дуплексами зависит от субъединичного состава белка, от положения тимидингликоля и его нуклеотидного окружения в κB-участке. Сродство субъединицы p65 к Tg-содержащим ДНК значительно ниже по сравнению с субъединицей р50.

Аннотация результатов, полученных в 2016 году
Настоящий проект направлен на исследование влияния белка человека Ku, представляющего собой гетеродимер Ku70/Ku80, на процесс репликации ВИЧ-1 с целью выявления новых мишеней для создания противовирусных препаратов. Роль клеточного белка Ku в репликации вируса еще не до конца изучена, однако предполагается, что он может участвовать, по крайней мере, в двух стадиях жизненного цикла ВИЧ-1: защите вирусной интегразы (ИН) от протеасомной деградации и активации транскрипции с интегрированного провируса. Еще одной стадией, в которой может участвовать белок Ku, является репарация одноцепочечных разрывов, возникающих в геноме человека после интеграции в него вирусной ДНК. Таким образом, Ku может оказаться очень перспективной мишенью для ингибирования репликации ВИЧ-1. С целью дальнейшего изучения взаимодействия интегразы ВИЧ-1 с α2-субъединицей протеасомы была получена серия плазмидных эукариотических конструкций, кодирующих делеционные мутанты интегразы (1-160, 1-220, 47-220). После чего, мы провели выделение макромолекулярных комплексов, формируемых ИН, экспрессированной в клетках НЕК 293Т. Было показано, что даже фрагмент ИН 1_160, не содержащий основного сайта узнавания Ku70, способен эффективно соосаждать 20S протеосому. Следовательно, наши результаты показывают, что ассоциация ИН с протеосомой скорее всего не связано с ее взаимодействием с Ku70. В рамках продолжения изучения влияния стабилизирующего действия делеционных мутантов Ku70(1-250 и 250-609) на ИН при суперэкспрессии было показало, что на фоне нормального клеточного уровня Ku70 оба домена стабилизируют ИН. При этом на фоне подавленного эндогенного Ku70, стабилизирующего эффекта домена Ku70(250-609) на ИН обнаружено не было. Необходимо отметить, что описанный эффект наблюдался как для полноразмерной ИН, так и для ИН(1-220) и для ИН(1-160). Мы предполагаем, что стабилизирующий эффект оказывает N-концевая часть Ku70 (1-250), что согласуется с результатами, полученными на очищенных белках. В связи с этим взаимодействие Ku70 с ИН может рассматриваться как потенциальная мишень для создания новых анти-ВИЧ препаратов. Помимо этого, на III этапе выполнения проекта было оценено влияние суперэкспрессии Ku80 на стабильность суперэкспрессированного Ku70. Были получены соответствующие конструкции, однако ко-экспрессия белка Ku80 с полноразмерным Ku70 и с его двумя делеционными мутантами (1-250 и 250-609) не дала их заметной стабилизации (менее 20% относительно контроля). Наряду с изучением взаимодействия ИН с 20S-субъединицей протеасомы методом коиммунопреципитации из клеток, мы решили оценить эффект разных внутриклеточных концентраций Ku70 (условия сниженной, нативной или повышенной экспрессии Ku70) на колокализацию 20S-протеасомы с суперэкспрессированной с плазмидного вектора ИН. Оказалось, что разные внутриклеточные концентраций Ku70 не оказывают значимого влияния на степень колокализации 20S-протеасомы с суперэкспрессированной с плазмидного вектора ИН, которая во всех случаях лежит в диапазоне 40-60%. На предыдущем отчетном этапе мы показали, что уровень Ku70 несколько снижается (на 40-50%) в клетках HEK 293T, инфицированных репликативно-некомпетентным вектором на основе ВИЧ-1. Необходимо было провести аналогичный эксперимент на другой клеточной линии. Для этого была выбрана клеточная линия HeLa, на которой мы получили схожий результат, однако в этом случай уровень Ku70 понижался менее значительно (20-30%). Более того, уровень Ku80 в данном эксперименте тоже снижался. Помимо этого, мы выяснили, что подавление количества Ku70 за счет трансфекции коктейля соответствующих siРНК стимулирует репликацию репликативно-некомпетентного люциферазного вектора на основе ВИЧ-1. Этот результат противоречит данным (Manic et al. PLOS One, 2013), однако отчасти согласуется с данными недавней работы (Hultquist et al. Cell Rep., 2016), в которой показали, что стабильный нок-аут Ku70 в первичных лимфоцитах человека из периферической крови приводит к стимуляции инфекции ВИЧ-1. Следующей задачей данного этапа проекта было продолжить изучение взаимодействия белка Ku с внутренними областями LTR в составе ДНК ВИЧ-1. Для этого двумя независимыми способами была изучена эффективность взаимодействия Ku c комплексами радиоактивно-меченных участков LTR ВИЧ-1 (1-150, 125-272, 241-372, 355-507, 442-568, 492-633), содержащих на 5’-концах биотин, со стрептавидином, блокирующим концы ДНК. Было установлено, что гетеродимер Ku с одинаковой эффективностью связывается со всеми ДНК-фрагментами, но при этом в 2 раза хуже, чем с контрольной ДНК, содержащей биотин только на одном из концов. После этого мы изучили взаимодействие гетеродимера Ku, а также белка Ku70, с конструкциями, содержащим внутренний 21-звенный предполагаемый сайт связывания Ku в промоторе MMTV или гомологичный ему участок LTR ВИЧ-1 (238-258), а также концевые последовательности, формирующие короткие ДНК-шпильки и 7-звенные дуплексы, с которыми гетеродимер Ku по литературным данным (Walker J.R. et al., Nature, 2001, 412, 607-614) не взаимодействует. Помимо этого, был изучен ряд контрольных ДНК. Оказалось, что гетеродимер Ku и изолированный Ku70 не проявляют сиквенс-специфичности и по отношению к коротким ДНК. Более того, футпринтинг ДНКазой I показал, что взаимодействие с Ku обеспечивается короткими концевыми шпильками, а не внутренними специфическими участками. Таким образом выявленное отсутствие специфичности взаимодействия Кu c внутренними участками ДНК по всей видимости объясняется тем, что в данном случае взаимодействие осуществляется не за счет особенностей нуклеотидной последовательности, а из-за элементов вторичной структуры (шпильки, кресты). При этом на уровне одноцепочечных ДНК изолированный Ku70 эффективно связывает участок в промоторе MMTV, но не взаимодействует с участком LTR ВИЧ-1, а также контрольной инвертированной последовательностью. Помимо этого, была предпринята попытка изучения взаимодействия гетеродимера Кu с ДНК методом кросс-линкинга. Для фиксации белка были получены ДНК-дуплексы, содержащие пиридилдисульфидную группировку на линкерах различной длины. К сожалению, в виду необходимости проводить кросслинкинг в отсутствие восстановителей (меркаптоэтанол, дитиотреит и т.д.) и повышенной агрегации белков, не было зафиксировано образования ДНК-белковых конъюгатов ни с одним из ДНК-дуплексов.