Аннотация результатов, полученных в 2014 году
При финансовой поддержке РНФ были исследованы трехмерная структура и функции актинсвязывающих белков: CAP, Nwk и сравнены с другими белками, Syndapin и Pinkbar. Были впервые получены трехмерные структуры N-концевого олигомера белка CAP и полноразмерного белка Nwk. Nervous Wreck (Nwk) – белок, регулирующий траффик рецепторов роста в нервно-мышечном синапсе у дрозофилы. В своем составе он содержит F-BAR домен, взаимодействующий с липидной мембраной и изгибающий её и два SH3 домена. Параллельно с деформацией мембраны происходит перестройка актиновых филаментов. Согласованность этих событий лежит в основе образования филоподий, движения клетки, эндо- и экзоцитоза и многих других клеточных процессов. Nwk отличается от других белков тем, что даже в автоингибированном состоянии он способен взаимодействовать с полярной липидной мембраной, хотя и с более низким сродством. В результате работы по проекту нами была предложена модель, объясняющая авторегулирование Nwk. Мембранно-дефомирующая активность F-BAR белка Nwk может авторегулироваться его C-концевыми SH3 доменами за счет электростатических взаимодействий. Основной эффект авторегуляции выражается в ингибировании возможности мембраны формировать изгибы в отсутствии белковых структур более высокого порядка. Комплекс CAP является одним из широко распространенных эукариотических актинсвязывающих белков, играющим основную роль в организации цитоскелета клетки. N-концевой домен комплекса CAP взаимодействует с аденилатциклазным комплексом, и участвует в формировании клеточного ответа путем активации Ras-белков. С-концевой домен белка CAP связывает мономеры актина и участвует в сборке-разборке актинового филамента. Мы опубликовали впервые трехмерную структуру белка N-CAP в Journal of biological chemistry и продемонстрировали, что мышиный N-CAP, как и его гомолог из дрожжей Srv2, является гексамером. В присутствии N-CAP также наблюдали усиление в 8 раз разрезания актиновых филаментов. Было высказано предположение, что структура и функции N-концевого фрагмента Srv2/CAP являются консервативными у разных видов. Взаимодействие N-CAP с F-актином изменяет параметры спирализации филамента, что ведет к дестабилизации и, в конечном итоге, к разрушению актинового филамента.

Аннотация результатов, полученных в 2015 году
При поддержке РНФ исследовались структуры и функции белков, регулирующих динамику актинового цитоскелета: Arp2/3, CAP/Srv2 и Nwk. Были впервые получены трехмерные структуры полноразмерного белка Nwk в автоингибированной конформации и С-концевого домена белка Srv2. Был разработан подход к изучению взаимодействия белков с липосомами методом крио-электронной микроскопии. Arp2/3 комплекс является одним из основных нуклеаторов актина. В присутствии АТФ, различных активаторов и пула актиновых мономеров он формирует «узел разветвления», инициируя рост дочернего актинового филамента. Ранее было показано, что взаимодействие фактора созревания глии (Gmf1) с Arp2/3 комплексом инактивует комплекс и блокирует ветвление актиновых филаментов. Еще один инактиватор – арпин был обнаружен в 2013 г. Предполагается, что главная роль арпина состоит в контроле миграции клеток, в том числе и раковых, поэтому детальное изучение механизмов, регулирующих ингибирование комплекса Arp2/3 арпином, является важной задачей. С помощью просвечивающей электронной микроскопии макромолекул мы получили трехмерные реконструкции комплекса Arp2/3 с арпином и Gmf1. Их изучение показало наличие двух сайтов связывания для каждого ингибитора. Расположение сайтов связывания арпина близко к предсказанному расположению сайтов связывания факторов нуклеации (VCA), что объясняет механизм ингибирования Arp2/3 комплекса арпином. Для комплекса Arp2/3-Gmf1 были описаны две неактивные конформации, причем одна их них была описана впервые. Наличие двух конформаций можно объяснить наличием двух сайтов связывания Gmf1 с различной аффинностью. Методом молекулярной динамики был проведен структурно-динамический анализ взаимодействий Arp2/3 комплекса и ингибитора Gmf1 в различных сайтах связывания, были охарактеризованы новые гидрофобные интерфейсы сайтов связывания, показаны количественные и качественные изменения водородных связей, рассчитана средняя величина энергии взаимодействия. Nervous Wreck (Nwk) – белок, регулирующий траффик рецепторов роста в нервно-мышечном синапсе у дрозофилы. Он функционирует в виде димера, в котором каждый мономер содержит F-BAR домен и два SH3 домена. Функцией F-BAR домена является связывание и деформация мембраны, а SH3 домены взаимодействуют с белками-партнёрами и регулируют активность F-BAR домена. Нами была получена трёхмерная реконструкция полноразмерного автоингибированного Nwk.Мы сравнили ее с полученной в прошлом году 3D реконструкцией активированного Nwk на липидном монослое. Их различие заключается в расположении SH3 доменов, что позволило сделать вывод о конформационных изменениях, возникающих в белке при связывании с мембраной и уточнить предложенную в прошлом году модель, объясняющую авторегулирование Nwk. Полученные нами результаты были опубликованы в рецензируемых журналах, доложены на международных конференциях.

Аннотация результатов, полученных в 2016 году
При поддержке РНФ исследовались структуры и функции белков, регулирующих динамику актинового цитоскелета: Arp2/3, CAP/Srv2 и Nwk. Исследование комплексов CAP/Srv2 с различными структурными метками показало, что OD-домен олигомеризует и пространственно организует HFD-мономеры в симметричный кластер, и что в полноразмерном белке C-концевой домен является мономером. В результате была построена модель взаимодействия CAP/Srv2 комплекса с актиновым филаментом. Используя данные ПЭМ была построена молекулярная модель комплекса Arp2/3, взаимодействующего с арпином, и было впервые показано, что арпин имеет два сайта связывания на Arp2/3 комплексе. С помощью метода молекулярной динамики была рассчитана свободная энергия связывания арпина с Arp2/3 для каждого из сайтов. Методом молекулярной динамики были выявлены аминокислотные остатки, которые имеют наибольшее значение для связывания F-BAR-домена Nwk с липидами. С помощью метода электронной микроскопии была получена трёхмерная структура полноразмерного белка, связанного с мембраной, и было определено расположение F-BAR и SH3-доменов в построенной реконструкции. Также была предложена модель, объясняющая изменение конформации белка при связывании с мембраной и биологическое значение этого процесса. Cоздан научный задел для будущих исследований по тематике настоящего проекта. Полученные нами результаты были опубликованы в рецензируемых журналах, доложены на международных конференциях.