КАРТОЧКА ПРОЕКТА,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ


Номер 14-14-00234

НазваниеКомплексное исследование структуры и динамики ключевых актинсвязывающих белковых комплексов

РуководительСоколова Ольга Сергеевна, Доктор биологических наук

Организация финансирования, регионФедеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Московский государственный университет имени M.В.Ломоносова», г Москва

Годы выполнения при поддержке РНФ 2014 - 2016  , продлен на 2017 - 2018. Карточка проекта продления (ссылка)

КонкурсКонкурс 2014 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами»

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни, 04-202 - Протеомика; структура и функции белков

Ключевые словаМакромолекулы, структура, актинсвязывающие белки, липиды, электронная микроскопия, электронная томография, молекулярное моделирование, конформационные изменения, динамика.

Код ГРНТИ34.17.21


СтатусУспешно завершен


 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ


Аннотация
В проекте будут исследованы структурные и молекулярные особенности белок-белковых и липид-белковых взаимодействий ключевых актинсвязывающих белков. Эта фундаментальная проблема является весьма актуальной, так как многие актинсвязывающие белки до сих пор не закристаллизованы и их атомная структура не известна. Для изучения структуры и конформационных изменений будут использованы современные аналитические методики. На основании разработанного нами ранее комплексного подхода, включающего методики криогенной микроскопии и биоинформатики планируется осуществить трехмерную реконструкцию структуры актинсвязывающих молекул и рассчитать их псевдо-атомную структуру. Научная новизна планируемых исследований состоит в том, что будут получены данные, раскрывающие на молекулярном уровне не изученные прежде специфические взаимодействия между актинсвязывающими белками, их лигандами, актином и липидами. После опубликования, эта результаты могут быть применены для планирования экспериментов по направленному мутагенезу с целью идентификации функционально значимых участков в молекулах актинсвязывающих белков-мишеней лекарственных средств.

Ожидаемые результаты
В данной работе мы планируем получить впервые трехмерные (3D) структуры актинсвязывающего комплекса Arp2/3 с Gmf и другими инактиваторами (арпин, Crn). Для оценки свободной энергии связывания инактиваторов с Arp2/3 комплексом мы применим метод молекулярной динамики. Для построения профиля свободной энергии будет использован метод зонтичного сэмплирования (umbrella sampling). С его использованием свободная энергия может быть вычислена из потенциала средней силы, рассчитываемого для серии конформаций, получаемых в результате молекулярной динамики. Для определения структур высшего порядка, формируемых F-BAR белками на мембранах и определения трехмерной структуры полноразмерного Nwk, мы используем метод ПЭМ с негативным контрастированием. Введение точечных мутаций позволит определить аминокислотные остатки, участвующие в межбелковом взаимодействии и взаимодействии с активаторами (например с Dap160 (1)). Мы впервые получим 3D реконструкцию полноразмерного Srv2 комплекса, которая в сочетании с томографическими исследованиями и результатами молекулярного моделирования позволит построить молекулярную модель полноразмерного человеческого комплекса CAP. Для интерпретации полученных структурных данных мы планируем разработать методику интеграции данных ПЭМ с известными данными по атомной структуре АСБ. Для интеграции данных будут использованы методы молекулярной динамики с использованием параллельных суперкомпьютерных вычисления для релаксации предварительных структур комплексов (будет использован программный пакет GROMACS 4.6 (2) и суперкомпьютер МГУ «Ломоносов»), методы гибкого докинга (3), основанные на методе молекулярной динамики, позволяющие проводить деформацию молекулярных структур белков, вписывая их в экспериментальную электронную плотность. Возможность взаимной интеграции классического метода электронной микроскопии с современными вычислительными техниками для расчета трехмерной структуры комплекса, а так же для молекулярного моделирования структуры, позволяет существенно ускорять и удешевлять определенные этапы исследования объектов. Возможными путями и действиями по обнародованию результатов исследования являются: опубликование статей по полученным экспериментальным данным, участие в конференциях, опубликование материалов по итогом проекта на сайтах Московского государственного университета имени М.В.Ломоносова (www.msu.ru) и Российского Научного фонда (www.rcsf.ru). Не менее 3 статей по результатам проекта будет опубликовано в изданиях c высоким импакт-фактором, индексируемых в базе данных «Сеть науки» (Web of Science). Потребителями результатов предлагаемого проекта станут научные учреждения, занимающиеся структурной биологией, организации, занимающиеся теоретическими исследованиями структур бионаночастиц, разработкой новых биомедицинских технологий и скринингом лекарственных средств, а также все мировое сообщество структурных биологов.


 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ


Аннотация результатов, полученных в 2014 году
При финансовой поддержке РНФ были исследованы трехмерная структура и функции актинсвязывающих белков: CAP, Nwk и сравнены с другими белками, Syndapin и Pinkbar. Были впервые получены трехмерные структуры N-концевого олигомера белка CAP и полноразмерного белка Nwk. Nervous Wreck (Nwk) – белок, регулирующий траффик рецепторов роста в нервно-мышечном синапсе у дрозофилы. В своем составе он содержит F-BAR домен, взаимодействующий с липидной мембраной и изгибающий её и два SH3 домена. Параллельно с деформацией мембраны происходит перестройка актиновых филаментов. Согласованность этих событий лежит в основе образования филоподий, движения клетки, эндо- и экзоцитоза и многих других клеточных процессов. Nwk отличается от других белков тем, что даже в автоингибированном состоянии он способен взаимодействовать с полярной липидной мембраной, хотя и с более низким сродством. В результате работы по проекту нами была предложена модель, объясняющая авторегулирование Nwk. Мембранно-дефомирующая активность F-BAR белка Nwk может авторегулироваться его C-концевыми SH3 доменами за счет электростатических взаимодействий. Основной эффект авторегуляции выражается в ингибировании возможности мембраны формировать изгибы в отсутствии белковых структур более высокого порядка. Комплекс CAP является одним из широко распространенных эукариотических актинсвязывающих белков, играющим основную роль в организации цитоскелета клетки. N-концевой домен комплекса CAP взаимодействует с аденилатциклазным комплексом, и участвует в формировании клеточного ответа путем активации Ras-белков. С-концевой домен белка CAP связывает мономеры актина и участвует в сборке-разборке актинового филамента. Мы опубликовали впервые трехмерную структуру белка N-CAP в Journal of biological chemistry и продемонстрировали, что мышиный N-CAP, как и его гомолог из дрожжей Srv2, является гексамером. В присутствии N-CAP также наблюдали усиление в 8 раз разрезания актиновых филаментов. Было высказано предположение, что структура и функции N-концевого фрагмента Srv2/CAP являются консервативными у разных видов. Взаимодействие N-CAP с F-актином изменяет параметры спирализации филамента, что ведет к дестабилизации и, в конечном итоге, к разрушению актинового филамента.

 

Публикации

1. Jansen, S., Collins, A., Golden, L., Sokolova, O., Goode, B.L Structure and mechanism of mouse cyclase-associated protein (CAP1) in regulating actin dynamics J Biol Chem., V 289, pp 30732-30742. (год публикации - 2014).


Аннотация результатов, полученных в 2015 году
При поддержке РНФ исследовались структуры и функции белков, регулирующих динамику актинового цитоскелета: Arp2/3, CAP/Srv2 и Nwk. Были впервые получены трехмерные структуры полноразмерного белка Nwk в автоингибированной конформации и С-концевого домена белка Srv2. Был разработан подход к изучению взаимодействия белков с липосомами методом крио-электронной микроскопии. Arp2/3 комплекс является одним из основных нуклеаторов актина. В присутствии АТФ, различных активаторов и пула актиновых мономеров он формирует «узел разветвления», инициируя рост дочернего актинового филамента. Ранее было показано, что взаимодействие фактора созревания глии (Gmf1) с Arp2/3 комплексом инактивует комплекс и блокирует ветвление актиновых филаментов. Еще один инактиватор – арпин был обнаружен в 2013 г. Предполагается, что главная роль арпина состоит в контроле миграции клеток, в том числе и раковых, поэтому детальное изучение механизмов, регулирующих ингибирование комплекса Arp2/3 арпином, является важной задачей. С помощью просвечивающей электронной микроскопии макромолекул мы получили трехмерные реконструкции комплекса Arp2/3 с арпином и Gmf1. Их изучение показало наличие двух сайтов связывания для каждого ингибитора. Расположение сайтов связывания арпина близко к предсказанному расположению сайтов связывания факторов нуклеации (VCA), что объясняет механизм ингибирования Arp2/3 комплекса арпином. Для комплекса Arp2/3-Gmf1 были описаны две неактивные конформации, причем одна их них была описана впервые. Наличие двух конформаций можно объяснить наличием двух сайтов связывания Gmf1 с различной аффинностью. Методом молекулярной динамики был проведен структурно-динамический анализ взаимодействий Arp2/3 комплекса и ингибитора Gmf1 в различных сайтах связывания, были охарактеризованы новые гидрофобные интерфейсы сайтов связывания, показаны количественные и качественные изменения водородных связей, рассчитана средняя величина энергии взаимодействия. Nervous Wreck (Nwk) – белок, регулирующий траффик рецепторов роста в нервно-мышечном синапсе у дрозофилы. Он функционирует в виде димера, в котором каждый мономер содержит F-BAR домен и два SH3 домена. Функцией F-BAR домена является связывание и деформация мембраны, а SH3 домены взаимодействуют с белками-партнёрами и регулируют активность F-BAR домена. Нами была получена трёхмерная реконструкция полноразмерного автоингибированного Nwk.Мы сравнили ее с полученной в прошлом году 3D реконструкцией активированного Nwk на липидном монослое. Их различие заключается в расположении SH3 доменов, что позволило сделать вывод о конформационных изменениях, возникающих в белке при связывании с мембраной и уточнить предложенную в прошлом году модель, объясняющую авторегулирование Nwk. Полученные нами результаты были опубликованы в рецензируемых журналах, доложены на международных конференциях.

 

Публикации

1. Angelina Chemeris, Sean Guo, Alexis Gautreau, Bruce Goode, Olga Sokolova Structural insights into conformational changes of Arp2/3 complex, induced by ligand binding The FEBS Journal, v 282(S1), pp 220-221 (год публикации - 2015).

2. I. A. Orshanskiy, A. V. Popinako, A. D. Koromyslova, O. I. Volokh, K. V. Shaitan and O. S. Sokolova The Molecular Dynamics of N and C-Terminal Interactions during Autoinhibition and Activation of Formin mDial Biophysics, 60(3):361–366 (год публикации - 2015).

3. M. Antonov, A. Popinako, O. Sokolova Molecular modeling of Gmf to Arp2/3 complex binding: search amino acids important for interaction The FEBS Journal, v 282(S1), p 387 (год публикации - 2015).

4. Stanishneva-Konovalova T., Kelley C., Popinako A., Messelaar E., Volokh O., Rodal A.A., Sokolova O. Structural study of Nervous wreck inhibition The FEBS Journal, v 282(S1), p 22 (год публикации - 2015).

5. T.B. Stanishneva-Konovalova, O.S. Sokolova Molecular dynamics simulations of negatively charged dppc/dppi lipid bilayers at two levels of resolution Computational and Theoretical Chemistry, 1058, pp 61–66 (год публикации - 2015).

6. Yuri N. Antonenko, Grigory S. Gluhov, Alexander M. Firsov, Irina D. Pogozheva, Sergey I. Kovalchuk, Evgeniya V. Pechnikova, Elena A. Kotova, and Olga S. Sokolova Gramicidin a disassembles large conductive clusters of its lysine-substituted derivatives in lipid membranes Physical Chemistry Chemical Physics, v 17, pp 17461–17470 (год публикации - 2015).

7. Волох О.И., Боздаганян М.Е., Шайтан К.В. ОЦЕНКА CВОЙCТВ CВЯЗЫВАНИЯ АКТИНОМИЦИНА И ЕГО ПPОИЗВОДНЫX C МОЛЕКУЛОЙ ДНК МЕТОДОМ МОЛЕКУЛЯPНОЙ ДИНАМИКИ Биофизика, том 60, № 6, с. 1077-1084 (год публикации - 2015).


Аннотация результатов, полученных в 2016 году
При поддержке РНФ исследовались структуры и функции белков, регулирующих динамику актинового цитоскелета: Arp2/3, CAP/Srv2 и Nwk. Исследование комплексов CAP/Srv2 с различными структурными метками показало, что OD-домен олигомеризует и пространственно организует HFD-мономеры в симметричный кластер, и что в полноразмерном белке C-концевой домен является мономером. В результате была построена модель взаимодействия CAP/Srv2 комплекса с актиновым филаментом. Используя данные ПЭМ была построена молекулярная модель комплекса Arp2/3, взаимодействующего с арпином, и было впервые показано, что арпин имеет два сайта связывания на Arp2/3 комплексе. С помощью метода молекулярной динамики была рассчитана свободная энергия связывания арпина с Arp2/3 для каждого из сайтов. Методом молекулярной динамики были выявлены аминокислотные остатки, которые имеют наибольшее значение для связывания F-BAR-домена Nwk с липидами. С помощью метода электронной микроскопии была получена трёхмерная структура полноразмерного белка, связанного с мембраной, и было определено расположение F-BAR и SH3-доменов в построенной реконструкции. Также была предложена модель, объясняющая изменение конформации белка при связывании с мембраной и биологическое значение этого процесса. Cоздан научный задел для будущих исследований по тематике настоящего проекта. Полученные нами результаты были опубликованы в рецензируемых журналах, доложены на международных конференциях.

 

Публикации

1. Келли Ш.Ф., Месселаар Е.М., Эскин Т.Л., Вонг С., Сонг К., Вишня К., Бекалска А.Н., Щупляков О., Хаган М.А., Данино Д., Соколова О.С., Никастро Д., Родал А.А. Membrane charge directs the outcome of F-BAR domain lipid binding and autoregulation Cell Reports, Volume 13, Issue 11, pp 2597–2609 (год публикации - 2015).

2. Полевова С.В., Крамина Т., Соколова О.С. A novel approach to evaluate ultrathin section distortion Microscopy and Analysis, V. 30(5), pp S8-S10 (год публикации - 2016).

3. Соколова О.С., Чемерис А., Гуо Ш., Алиото С.Л., Ганди М., Падрик Ш., Печникова Е., Давид В., Гатре А., Гуде Б.Л. Structural basis of Arp2/3 complex inhibition by GMF, Coronin, and Arpin Journal of Molecular Biology, - (год публикации - 2016).

4. СТАНИШНЕВА-КОНОВАЛОВА Т. Б. РЕГУЛЯЦИЯ ДИНАМИКИ МЕМБРАН F-BAR-ДОМЕННЫМ БЕЛКОМ NERVOUS WRECK автореферат диссертации, Москва, - (год публикации - 2016).

5. Станишнева-Коновалова Т.Б., Деркачева Н.И., Полевова С.В., Соколова О.С. The role of bar domain proteins in the regulation of membrane dynamics Acta Naturae, VOL. 8 № 3 (30), pp 52-61 (год публикации - 2016).

6. Станишнева-Коновалова Т.Б., Келли Ш.Ф., Эскин Т.Л., Месселаар Е.М., Вассерман С.А., Соколова О.С., Родал А.А. Coordinated autoinhibition of F-BAR domain membrane binding and WASp activation by Nervous Wreck Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, - (год публикации - 2016).


Возможность практического использования результатов
не указано