Аннотация результатов, полученных в 2014 году
В рамках проекта проводится комплексное исследование фукозилированных хондроитинсульфатов (ФХС) – уникальных полисахаридов, выделенных из морских иглокожих. С целью выявления активных фрагментов ФХС, были выполнены работы по следующим направлениям: 1. Выделение нативных полисахаридов ФХС из различных видов голотурий, их фракционирование и химическая модификация. Из 4 видов голотурий, собранных в акватории Японского и Средиземного морей, выделены 4 суммарных препарата сульфатированных полисахаридов, основными компонентами которых являлись фукозилированные хондроитинсульфаты (ФХС). Методом ионообменной хроматографии из суммарных препаратов были выделены фракции особо чистых ФХС. С использованием разработанного авторами проекта метода исчерпывающего сульфатирования полиолов из очищенных ФХС были получены высокосульфатированные производные. Полисахариды данной серии существенно различались моносахаридным составом и содержанием сульфатных групп. 2. Химический синтез олигосахаридов, родственных различным участкам цепей ФХС. Исходя из доступных моносахаридов N-ацетил-D-глюкозамина, пентаацетата D-глюкозы и L-фукозы были синтезированы несульфатированные и избирательно сульфатированные ди-, три- и тетрасахариды, родственные разветвленным участкам цепей ФХС. Синтез большей части этих соединений представлен в публикации [1], включенной в тематический номер Synthesis around Marine Natural Products международного журнала Marine Drugs (IF 3.5). Для синтеза целевых соединений были получены моно- и дифукозидные гликозил-донорные блоки, содержащие несоучаствующую бензильную группу при О-2 и монохорацетильные заместители при О-3 и/или О-4. Реакции гликозилирования с использованием этих соединений проходили стереоспецифично с образованием требуемых α-изомеров. Стереохимический результат реакций объяснялся образованием стабилизированных за счет анхимерного содействия ацильных заместителей гликозил-катионов, нуклеофильная атака которых предпочтительна с α-стороны. Экспериментальные данные хорошо согласовывались с данными расчетов (метод ab initio с использованием приближения SCF/MP2, программа NWChem 6.3). Подробное описание этой части работы также представлено в публикации [1]. 3. Спектроскопический (ЯМР) и теоретический конформационный анализ синтетических олигосахаридов. Был проведен детальный спектроскопический (ЯМР) и теоретический конформационный анализ синтетических олигосахаридов. Определены оптимальные методы расчетов конформаций олигосахаридов - модель SASA и модель с явным учетом молекул воды. Наибольший интерес представляла конформация фукозил-глюкуронидного фрагмента, поскольку в реальных молекулах ФХС она составляет точку присоединения боковой цепи к основной. Результаты проведенных исследований показали, что для данного фрагмента характерно присутствие двух конформеров, доминирующим из которых является конформер А. Результаты исследований представлены в публикации [2], включенной в тематический номер Marine Polysaccharides международного журнала Marine Drugs (IF 3.5). 4. Молекулярное моделирование взаимодействия синтетических олигосахаридов с белками-мишенями, определяющими протекание процессов коагуляции крови и тромбообразования. Было проведено компьютерное моделирование взаимодействия полученных соединений и белков-мишеней, определяющих процесс формирования фибринового сгустка (тромбин, фактор Xa) и агрегацию тромбоцитов (Р-селектин). Были определены структурные элементы, необходимые для эффективного углевод-белкового взаимодействия исследуемых соединений. Так, для образования тринарного комплекса ФХС-тромбин-антитромбин III углеводная цепь должна состоять, как минимум, из 16 остатков. Полученные же результаты для фактора Ха свидетельствуют, что активность можно ожидать уже для октасахаридных соединений. Для эффективного связывания с Р-селектином достаточно 5 моносахаридных звеньев. Большая часть результатов проведенного исследования представлена в публикации [3]. 5. Исследование антикоагулянтной и антитромботической активностей поли- и олигосахаридов в экспериментах in vitro. Была изучена способность полученных нами поли- и олигосахаридов влиять на скорость формирования фибринового сгустка в экспериментах in vitro. Было показано, что суммарные препараты сульфатированных полисахаридов (crude extracts) малоактивны, в то время как очищенные фракции ФХС обладают высокой активностью, превышающей эффект гепариноида Клексана, который широко используется в настоящее время в медицинской практике. Наиболее активными были образцы CJ и AJ, полученные из голотурий видов Cucumaria japonica и Apostichopus japonicus. Введение дополнительных сульфатных групп в структуру полимеров незначительно влияло на величину активности. Синтетические низкомолекулярные олигосахариды не оказывали действия на процесс коагуляции крови, что свидетельствовало о том, что для значимого эффекта требуются более крупные фрагменты ФХС. [1] N. Ustyuzhanina, P. Fomitskaya, A. Gerbst, A. Dmitrenok, N. Nifantiev (2015) Synthesis of the Oligosaccharides Related to Side Chains of Fucosylated Chondroitin Sulfates from Sea Cucumbers. Marine Drugs, special issue Synthesis around Marine Natural Products, принята к печати. [2] A. Gerbst, A. Dmitrenok, N. Ustyuzhanina, N. Nifantiev (2015) Conformational analysis of the Oligosaccharides Related to Side Chains of Holothurian Fucosylated Chondroitin Sulfates Marine Drugs, special issue Marine Polysaccharides, принята к печати. [3] A. Gerbst, N. Ustyuzhanina, N. Nifantiev (2014) In silico docking elucidation of possible ternary complex comprising thrombin, antithrombin and fucosylated vs. nonfucosylated chondroitin sulfate derivatives. Тезисы конференции 20th EuroQSAR, 93.

Аннотация результатов, полученных в 2015 году
В 2015 году было продолжено комплексное исследование фукозилированных хондроитинсульфатов (ФХС), включающее выделение, фракционирование и химическую модификацию природных полисахаридов, синтез структурно родственных крупных олигосахаридов, спектроскопический (ЯМР) и теоретический конформационный анализ полученных соединений, исследование биологической активности в экспериментах in vitro. Работы были проведены по следующим главным направлениям: 1. Выделение, очистка и структурная характеристика фукозилированных хондроитинсульфатов из различных видов морских беспозвоночных. В 2015 году было проведено выделение суммарных препаратов анионных полисахаридов из 5 видов голотурий. Таким образом, в ходе проекта за два года была собрана уникальная коллекция полисахаридов рассматриваемого ряда из 9-ти видов голотурий. Дальнейшая очистка полученных образцов ФХС была выполнена методом ионообменной хроматографии на носителе DEAE Sephacel при элюировании 1,0М раствором NaCl. Обессоливание образцов полисахаридов выполняли методом гель-проникающей хроматографии на носителе G-15 в воде. Из всех суммарных препаратов, полученных нами из морских огурцов, указанным способом были выделены особо чистые образцы ФХС, предназначенные для структурных и биохимических исследований. Структура полученных полисахаридов была установлена с использованием методов ЯМР-спектроскопии. Найдено, что использование имидазольного буфера в качестве растворителя позволяет получать спектры ФХС с хорошим разрешением сигналов. Показано, что полученные биополимеры представляют собой полисахариды, основная цепь которых состоит, главным образом, из дисахаридных блоков →3)-β-D-GalNAc-(1→4)-β-D-GlcA-(1→, в которых при О-3 GlcA содержатся фукозные заместители. Полисахариды из разных источников различаются положением сульфатных групп в остатках N-ацетилгалактозамина и фукозы. Кроме того, были обнаружены неизвестные ранее структурные элементы ФХС. В структуре ФХС из Cucumaria japonica установлен структурный фрагмент, представляющий собой звено 3-О-сульфатированной глюкуроновой кислоты, образующее второй тип повторяющегося блока основной цепи. А в структуре ФХС из Actinopyca mauritiana было впервые установлено наличие бокового фукозного заместителя при О-6 остатка GalNAc. Полученные данные существенно расширяют представление о структуре природных ФХС, что важно для понимания строения их биологически активных фрагментов - фармакофоров. 2. Синтез олигосахаридов и гликоконъюгатов, родственных линейным и разветвленным участкам ФХС. Важнейшая часть исследовательских работ в рамках данного проекта РНФ посвящена стерео- и регионаправленному синтезу олигосахаридных производных, структурно родственных фрагментам исследуемых ФХС. Данные олигосахариды предназначены для сравнительных исследований особенностей спектров, конформаций и биологической активности ФХС. Продолжая работы 2014 года, были проведены синтезы спейсерированных производных тетра-, гекса- и октасахаридов, родственных линейным и разветвлённым фрагментам ФХС. Были получены избирательно сульфатированные олигосахариды, различавшиеся модержанием сульфатных групп в остатках N-ацетил-галактозамина и фукозы. Наличие спейсерной аминопропильной группы в аномерном положении целевых соединений позволило получить гликоконъюгаты, несущие флуоресцентную метку. Эти соединения будут необходимы для изучения взаимодействия ФХС с белками, единичными клеточными рецепторами и агрегатами клеток методом флуоресцентной микроскопии, которое будет выполнено в 2016 году. 3. Спектроскопический (ЯМР) и конформационный анализ синтетических олигосахаридов. Был проведен детальный спектроскопический (ЯМР) и теоретический конформационный анализ синтетических олигосахаридов. Определены оптимальные методы расчетов конформаций олигосахаридов - модель SASA и модель с явным учетом молекул воды. Наибольший интерес представляла конформация фукозил-глюкуронидного фрагмента, поскольку в реальных молекулах ФХС она составляет точку присоединения боковой цепи к основной. Полученные данные будут подробно рассмотрены в отчете по проекту за 2016 год. 4. Молекулярное моделирование взаимодействия синтетических олигосахаридов с белками-мишенями, определяющими протекание процессов коагуляции крови и тромбообразования. Было проведено компьютерное моделирование взаимодействия полученных соединений и белков-мишеней, определяющих процесс формирования фибринового сгустка (антитромбин III, тромбин, фактор Xa) и агрегацию тромбоцитов (Р-селектин). Были определены структурные элементы, необходимые для эффективного углевод-белкового взаимодействия исследуемых соединений. Так, для образования тринарного комплекса ФХС-тромбин-антитромбин III углеводная цепи должна состоять, как минимум, из 16 остатков. Полученные же результаты для фактора Ха свидетельствуют, что активность можно ожидать уже для октасахаридных соединений. Для эффективного связывания с Р-селектином достаточно 5 моносахаридных звеньев. 5. Исследование антикоагулянтной и антитромботической активностей поли- и олигосахаридов в экспериментах in vitro. Была изучена способность полученных ФХС и родственных олигосахаридов влиять на агрегацию тромбоцитов и скорость формирования фибринового сгустка в экспериментах in vitro. Было показано, что интегральный антикоагулянтный эффект ФХС, отмеченный в тесте АЧТВ, превышает действие низкомолекулярного гепарина (НМГ), а в экспериментах с очищенными белками ФХС, наоборот, были менее активны, чем НМГ. Это свидетельствует о том, что антикоагулянтное действие ФХС определяется не только их влиянием на тромбин и фактор Ха, но и также влиянием на фактор Виллебранда, которое наблюдали в экспериментах с тромбоцитами. Такой механизм действия, отличающий ФХС от НМГ, был отмечен впервые. Синтетические низкомолекулярные олигосахариды не оказывали действия на процесс коагуляции крови, что свидетельствовало о том, что для значимого эффекта требуются более крупные фрагменты ФХС.

Аннотация результатов, полученных в 2016 году
В 2016 году в рамках Проекта были получены следующие результаты: (1) Были детально охарактеризованы структуры фукозилированных хондроитинсульфатов из морских огурцов видов Massinium magnum, Cucumaria frondosa и Eupentacta fraudatrix. Было показано, что полисахарид MM из M. magnum обладает уникальной регулярной структурой. В отличие от всех изученных нами ранее полисахаридов, этот биополимер содержит только один тип боковых заместителей - 3,4-ди-О-сульфатированный фукозильный остаток при О-3 глюкуроновой кислоты. Результаты проведенной работы представлены в статье, принятой к печати в специализированном международном журнале Carbohydrate Polymers [1]. Намного более сложной структурой обладал ФХС CF, выделенный из морского огурца C. frondosa. Наряду с известными для ФХС элементами – звеньями, построенными из чередующихся остатков N-ацетил-галактозамина и 3-О-фукозилированной глюкуроновой кислоты, в структуре этого полисахарида были обнаружены необычные боковые фрагменты - сполна сульфатированные фукозные остатки, присоединенные к О-6 N-ацетил-галактозамина. Кроме того, в структуре данного ФХС были идентифицированы 3-О-сульфатированные остатки глюкуроновой кислоты в основной цепи. Результаты проведенной работы представлены в статье, принятой к печати в специализированном международном журнале Carbohydrate Polymers [2]. Самыми богатыми по структурному разнообразию были ФХС, выделенные из морского огурца E. fraudatrix. Примечательно, что данный вид голотурий продуцирует не один, а два структурно различных ФХС, которые были нами разделены методом ионообменной хроматографии. Первый полисахарид EF1 состоял из звеньев, несущих при О-3 остатков глюкуроновой кислоты как монофукозильные звенья, так и не описанные ранее дифукозильные фрагменты α-L-Fuc-(1-2)-α-L-Fuc3S4S-(1-. В состав же второго полисахарида EF2, наряду с фрагментами, характерными для EF1, входили 2,3-ди-О-сульфатированные остатки глюкуроновой кислоты и 6-О-сульфатированного N-ацетил-галактозамина. Результаты проведенной работы представлены в статье, принятой к печати в специализированном международном журнале Carbohydrate Polymers [3]. Был проведен анализ структурных характеристик ФХС, обнаруженных в исследованных биополимерах за все время выполнения Проекта. Было найдено, что ФХС имеют общие и различающиеся структурные элементы. Так, для всех исследованных полимеров характерно наличие повторяющихся звеньев, построенных из чередующихся остатков N-ацетил-галактозамина и 3-О-фукозилированной глюкуроновой кислоты. Различия же определяются расположением сульфатных групп в остатках фукозы, N-ацетил-галактозамина и даже глюкуроновой кислоты, а также типами боковых заместителей. Наличие общих и различающихся структурных элементов в фукозилированных хондроитинсульфатах затрудняет выявление фармакофоров, ответственных за те или иные виды биологической активности. Решение данной задачи требует применения олигосахаридов строго определенного строения, включая крупные олигосахариды, в которых присутствуют только выбранные отдельные виды структурных элементов ФХС. Именно поэтому в ходе Проекта 2014 нами были получены олигосахариды, родственные некоторым из ФХС, структура которых была детально установлена. Специально отметим, что из-за обнаружения не известных ранее структурных элементов ФХС, данные работы пришлось расширить. Исследование в данном приоритетном направлении будет развито в продолжении настоящего проекта, как это рассмотрено в соответствующей заявке на его продление. (2) Были получены крупные олигосахариды, родственные ФХС, построенным из чередующихся остатков N-ацетил-галактозамина и 3-О-фукозилированной глюкуроновой кислоты. Целевые соединения различались количеством моносахаридных остатков (9 и 12) и положением сульфатных групп в фукозильных заместителях. Была разработана блочная схема сборки углеводного скелета целевых соединений, ключевым предшественником в которой являлся дисахарид, построенный из остатков глюкозы и N-трихлорацетил-глюкозамина. Рациональная расстановка защитных групп в нем позволила получить из него, как гликозил-акцепторные, так и гликозил-донорные блоки. Удлинение основной цепи было выполнено по схемам [2+2], [2+4], [2+6]. Стереоизбирательное введение боковых альфа-фукозильных заместителей в положение 3 остатков глюкуроновой кислоты было проведено с использованием фукозил-донора, содержащего несоучаствующую бензильную группу при О-2 и соучаствующие ацильные заместители при О-3 и О-4. Стереохимический результат реакции определялся образованием стабилизированных за счет анхимерного содействия гликозил-катионов, нуклеофильная атака которых предпочтительна с альфа-стороны. Перевод остатков глюкозы в остатки глюкуроновой кислоты был осуществлен путем высвобождения первичной гидроксильной группы при О-6 и последующим её окислением действием системы TEMPO − бис-ацетокси-йодбензол. Для перевода остатков N-трихлорацетил-глюкозамина в остатки N-трихлорацетил-галактозамина было выполнено обращение конфигурации при С-4 через промежуточное образование трифторметансульфоната. Сульфатирование гидроксильных групп было проведено действием комплекса Py.SO3. Наряду с разветвленными олигосахаридами были синтезированы линейные олигосахариды, содержащие 3-О-сульфатированные остатки глюкуроновой кислоты. Такие фрагменты были обнаружены нами в структуре ФХС, выделенных из голотурий видов C. japonica и C. fraudatrix. В связи с обнаружением в структуре ФХС не описанных ранее фрагментов, построенных из остатков N-ацетил-галактозамина, несущих фукозильные заместители при О-6, нами был проведен синтез соответствующих дисахаридов. Часть из рассмотренных синтетических работ была опубликована в статье в специализированном международном журнале Carbohydrate Research [4]. Кроме того, полученные результаты были представлены на Научной конференции грантодержателей РНФ
«Фундаментальные химические исследования XXI-го века» (устный и стендовый доклады). (3) Был проведен спектроскопический (ЯМР) и теоретический конформационный анализ олигосахаридов, отвечающих обнаруженным структурным фрагментам ФХС, таким как GalNAc-(1-4)-β-GlсA и Fuc(1-6)GalNAc. С использованием молекулярного моделирования углевод-белкового взаимодействия были оценены энергии связывания олигосахаридов, отвечающих обнаруженным структурным фрагментам ФХС, с белками-мишенями, определяющими процессы коагуляции крови и тромбообразования. Важно отметить, что для образования тринарного комплекса ФХС-тромбин-антитромбин III углеводная цепи должна состоять, как минимум, из 16 остатков. Полученные же результаты для фактора Ха свидетельствуют, что активность можно ожидать уже для октасахаридных соединений. (4) Были получены данные о влиянии ФХС MM, CF, EF1, EF2 и синтетических олигосахаридов на процессы агрегации тромбоцитов и формирования фибринового сгустка. В качестве препарата сравнения был выбран низкомолекулярный гепарин эноксапарин (Enox, Клексан®, Sanofi), широко используемой в настоящее время в медицинской практике в качестве антитромботического средства. Кроме того, в серию исследуемых соединений был включен линейный хондроитинсульфат CS из хрящей млекопитающих (Sigma). Было показано, что исследуемые полисахариды и синтетические олигосахариды не влияют на агрегацию тромбоцитов, индуцируемую АДФ. Однако при использовании коллагена в качестве индуктора ФХС и эноксапарин демонстрируют высокий уровень активности. Наиболее интересные результаты были получены в экспериментах с ристомицином. Гепариноид эноксапарин был неактивен, в то время как ФХС эффективно блокировали агрегацию тромбоцитов. Такой тип активности свидетельствует о влиянии ФХС на фактор Виллебранда – белка, влияющего на агрегацию тромбоцитов, и способствующего запуску процесса коагуляции. Дополнительно это было подтверждено в экспериментах с тромбоцитами, фиксированными формальдегидом, с использованием стандартных тест-систем. Для оценки влияния полученных нами поли- и олигосахаридов на процесс формирования фибринового сгустка были проведены эксперименты с нормальной плазмой. Было показано, что в тесте АЧТ ФХС обладают высокой антикоагулянтной активностью, превышающей эффект эноксапарина. Критическими структурными элементами полисахаридов для данного типа активности было наличие 4,6-ди-О-сульфатированных остатков N-ацетил-галактозамина, боковых сульфатированных фукозных заместителей, а также сульфатированых остатков глюкуроновой кислоты. Синтетические низкомолекулярные олигосахариды не оказывали действия на процесс коагуляции крови, а вот для окта- и додекасахаридов была показана активность, сопоставимая с эффектом эноксапарина. В эксперименты с очищенными белками – тромбином, фактором Ха и антитромбином III -было показано, что полисахариды ФХС эффективно ингибируют действие тромбина и фактора Ха в присутствии ATIII, в то время как без ATIII реакции не происходит. Синтетические окта- и додекасахаиды не оказывали влияния на активность тромбина, но при этом для них была отмечена значимая анти-Xa-активность. Эти данные свидетельствуют, что антикоагулянтная активность зависит от длины цепи углевода, что коррелирует с результатами расчетов, представленными в предыдущем разделе. Примечательно, что неразветвленный хондроитинсульфат CS из хрящей млекопитающих был неактивен во всех проведенных тестах. Это свидетельствует о критической роли разветвлений в структуре ФХС для эффективного связывания с белками и формирования тринарных комплексов [тромбин-ATIII-ФХС] и [фактор Ха-ATIII-ФХС], что также коррелирует с результатами расчетов, представленными в предыдущем разделе. Обращает на себя внимание тот факт, что активность ФХС в тесте АЧТВ, где оценивается интегральный эффект, была существенно выше таковой для эноксапарина, в то время как в экспериментах с очищенными белками эффект эноксапарина, наоборот, превосходил таковой для ФХС. Это свидетельствует о том, что для ФХС характерен альтернативный механизм антикоагулянтного действия, который вносит дополнительный вклад в интегральную картину. Таковым, по-видимому, является взаимодействие ФХС с комплексом [фактор Виллебранда-фактор VIII], которое мы наблюдали в экспериментах по агрегации тромбоцитов. Результаты биологических исследований были представлены в статье, принятой к печати в специализированном международном журнале Carbohydrate Polymers [1], а также были доложены на конференциях: European Congress on Thrombosis and Hemostasis (The Hague, Netherlands), Научной конференции грантодержателей РНФ
«Фундаментальные химические исследования XXI-го века». Список публикаций: [1] Ustyuzhanina N.E., Bilan M.I., Dmitrenok A.S., Borodina E.Yu., Stonik V.A., Nifantiev N.E., Usov A.I. A highly regular fucosylated chondroitin sulfate from the sea cucumber Massinium magnum: structure and effects on coagulation. Carbohydrate Polymers (2017), принята к печати. [2] Ustyuzhanina N.E., Bilan M.I., Dmitrenok A.S., Shashkov A.S., Nifantiev N.E., Usov A.I. The structure of a fucosylated chondroitin sulfate from the sea cucumber Cucumaria frondosa. Carbohydrate Polymers (2017), принята к печати. [3] Ustyuzhanina N.E., Bilan M.I., Dmitrenok A.S., Nifantiev N.E., Usov A.I. Two fucosylated chondroitin sulfates from the sea cucumber Eupentacta fraudatrix. Carbohydrate Polymers (2017), принята к печати. [4] Vinnitskiy D.Z., Ustyuzhanina N.E., Dmitrenok A.S., Shashkov A.S., Nifantiev N.E. Synthesis and NMR analysis of model compounds related to fucosylated chondroitin sulfates: GalNAc and Fuc(1-6)GalNAc derivatives. Carbohydrate Research (2017), 438, 9-17.