Аннотация результатов, полученных в 2014 году
1. Расчетно-теоретические результаты. Разработана многомасштабная модель (ММ) для виртуального конструирования макромолекул с сополимерными последовательностями гидрофобных и гидрофильных звеньев, способная учитывать особенности экспериментальных условий синтеза ферментоподобных макромолекул – тип реакции, мольный состав реакционной смеси мономеров, ее температуру, особенности растворителя и процент выхода продукта реакции. Отличительной особенностью нашей ММ является возможность переноса полученных конечных состояний моделируемых систем на атомистический уровень и квантово-механический уровни компьютерного моделирования, реализованные в программных пакетах других разработчиков. Учет особенностей экспериментального синтеза позволяет нам напрямую сопрягать теоретические расчеты с проводимым экспериментальным синтезом, «налету» уточнять параметризацию модели, что позволит на следующем этапе проекта значительно увеличить точность теоретических предсказаний. Разработанная модель была использована для моделирования реакции получения синтетического аналога α-химотрипсина посредством сополимеризации мономеров NVCL (N-винил-капролактам) с мономерами NABAL (N-акрилоил-β-аланин), NAMEA (N-акрилоилмоноэтаноламин) и NAHA (N-акрилоил-гистамин) в различном соотношении. Разработан и запрограммирован способ получения белковоподобных глобул в растворе для дальнейшего моделирования огрубленным методом диссипативной динамики частиц. Исследовано, как доля сольвофильных звеньев влияет на стабильность одиночных глобул в растворе; определено, при каком соотношении сольвофильных и сольвофобных звеньев не происходит агрегации. Предложена и реализована новая модель гем-содержащего белковоподобного полимера: белковоподобная глобула находится в растворе, содержащем некоторую концентрацию гемов; если свободный гем подходит к двум звеньям короны на расстояние r<rc, где rc – радиус координации, то с некоторой вероятностью он координируется этими двумя звеньями; такие координационные связи имеют некоторое конечное время жизни. Исследовано влияние координации гемов глобулой на ее свойства; показано, что наличие большого количества связанных гемов существенно влияет на конформационные свойства, делая корону более плотной и менее флуктуирующей. 2. Экспериментальные результаты В отчетный период мы разработали два подхода для химического синтеза синтетических энзимо-подобных катализаторов, которые способны воспроизводить базовые функции таких природных ферментов как сериновые гидролазы (в частности, α-химотрипсина) и гемоглобина. Первый способ заключается в свободно-радикальной сополимеризации NVCL с функциональными сомономерами NAHA, NABAL и NAMEA, содержащими в боковой цепи, соответственно, имидазольный фрагмент, карбоксильную и гидроксильную группу. Введение в основную полимерную цепь PNVCL группировок, входящих в состав каталитически-активной триады сериновых гидролаз, необходимо для получения «сополимерных моделей» α-химотрипсина. Разработаны схемы синтеза и получены в препаративных количествах недоступные коммерчески функциональные мономеры, а именно: NAHA, NABAL и NAMEA. Осуществлен синтез сополимеров NVCL различного состава c указанными сомономерами в условиях, обеспечивающих, как было показано ранее, образование белковоподобных сополимеров. Найден состав исходной реакционной смеси (~ 90 мол.% NVCL и 10 мол.% функциональных сомономеров), позволяющий получить сополимерные продукты, потенциально содержащие макромолекулы с белковоподобными свойствами. Второй способ заключается в двухстадийной контролируемой радикальной сополимеризации по механизму присоединения-фрагментации (RAFT) NVCL и 1-винилимидазола (VI). На первой стадии реакции получали гидрофобный поли-NVCL-блок (PNVCL). Реакцию проводили в присутствии инициатора - динитрила азо-изомасляной кислоты (ДАК) и низкомолекулярного RAFT-агента - [1-(O-этилксантил)этил]бензола.На второй стадии синтезировали РNVCL-блок-(PNVCL-PVI)-сополимеры сополимеризацией NVCL и VI в присутствии ДАК и полимерного RAFT-агента - РNVCL с концевой 1-(О-этилксантил)этильной группой. В условиях фазового расслоения первый PNVCL-блок белковоподобных сополимеров будет формировать ядро плотных глобул, а второй, более гидрофильный РNVCL-РVI-блок, – стабилизирующую гидрофильную оболочку. Способность PNVCL формировать гидрофобное ядро будет зависеть от длины полимерных цепей, поэтому были синтезированы PNVCL с разной молекулярной массой. Разработана методика синтеза белковоподобных сополимеров NVCL и VI методом двухстадийной RAFT-полимеризации. Получены РNVCL-блок-(PNVCL-PVI)-сополимеры с различной длиной гидрофильных PNVCL-PVI-блоков. Показана возможность характеризации методом жидкостной хроматографии состава и полидисперсности синтезированных образцов сополимеров. Методом ВЧ-ДСК исследовано термическое поведение синтезированных белковоподобных сополимеров и определены вероятные условия существования стабильных глобул сополимеров NVCL определенного состава.

Аннотация результатов, полученных в 2015 году
Расчетно-теоретические результаты В рамках многомаштабного моделирования выполнено виртуальное конструирование сополимера, который по своим функциям является искусственным аналогом α-химотрипсина. При моделировании реакции свободно-радикальной сополимеризации были задействованы модели тех же мономеров, что используются в реальном эксперименте. Это позволило нам в итоге восстановить полноатомную структуру «виртуально синтезированных» полимерных цепей с целью их дальнейшей характеризации с использованием метода молекулярной динамики. Некоторые варианты глобулярных структур (построенные из 500 мономеров) были преобразованы в эквивалентные атомистические модели. Это позволило провести анализ возможности формирования структуры глобул на основе полноатомных моделей сополимеров в условиях водного раствора и вакуума. Показано, что структура полученных белково-подобных глобул в условиях водного раствора похожа на структуру расплавленной белковой глобулы. Сконструированный сополимер не агрегирует в течение достигнутых времен моделирования. Гидрофобные сегменты сконструированного сополимера, обогащенные мономерами NVCL, стабилизируют глобулярную конформацию и обеспечивают формирование гидрофобных областей окружающих каталитически активные триады (что можно рассматривать как грубую аналогию гидрофобного кармана). Основным фактором стабилизации структуры ядро-оболочка сконструированного сополимера является наличие водородных связей, которые снижают степень доступности внутренних доменов глобул для растворителя. Количество случайно формируемых потенциально активных каталитических центров может достигать значения 10 на одну молекулу из 500 мономеров. На основе полученных результатов можно заключить, что выполненное моделирование косвенно подтверждает вывод, полученный в экспериментальной части проекта, что сконструированный нами искусственный катализатор ускоряет гидролиз pNAP, если цепь сополимера находится в глобулярной конформации, в то время как скорость реакции должна возрастать лишь незначительно, если цепь находится конформации клубка. Таким образом, предложенный протокол синтеза искусственных ферментов позволяет получить сополимеры с хорошо выраженной конформационно-зависимой каталитической активностью. Экспериментальные результаты Найдено оптимальное мольное соотношение N-винилкапролактама, N-акрилоилгистамина, N-акрилоил-β-аланина и N-акрилоилмоноэтаноламина в исходном реакционном растворе, позволившее получить белковоподобный сополимер с близким к соотношению имидазольной, карбоксильной и гидроксильной функций, свойственному активному центру сериновых гидролаз. Для такого сополимера наибольшая каталитическая активность в реакции гидролиза п-нитропропионата проявляется, когда цепи принимают белковоподобную конформацию. Разработана схема синтеза двойных белковоподобных сополимеров N-винилкапролактама и N-акрилоилгистамина, являющихся синтетическими моделями гем-содержащих белков. Синтезированы термочувствительные диблок-сополимеры N-винилкапролактама (NVCL) и N-винилимидазола (NVI) контролируемой радикальной полимеризации с обратимой передачей цепи по механизму присоединение-фрагментация (RAFT-полимеризация). В качестве агента передачи цепи использовали PNVCL-RAFT –агент с концевой ((О-этилксантил)этил)бензольной группой (MADIX-процесс). Синтезированы серии сополимеров с постоянной молекулярной массой первого РNVCL-блока, но разными молекулярной массой и составом второго (РNVCL-РVI)-блока, а также с постоянной молекулярной массой и составом (РNVCL-РNVI)-блока, но с разной молекулярной массой первого РNVCL-блока. При сополимеризации в диметилформамиде получены блок-сополимеры с унимодальным и узким ММР, что свидетельствует об отсутствии процессов неуправляемой радикальной полимеризации. Исследование свойств разбавленных водных растворов образцов PNVCL и блок-сополимеров методом СРС-ДРС в широком диапазоне температур выявило следующее: обнаружена тенденция к агрегации при температурах ниже θ-температуры PNVCL; показано, что на температуры фазового расслоения PNVCL влияет длина цепи, концентрация и состав растворителя; в) обнаружено явление перехода в устойчивое обратимое мицеллярное состояние в области температур между θ-температурой и температурой фазового расслоения. Методом высокочувствительной дифференциальной сканирующей калориметрии исследовано влияние природных полиаминов на энергетику перехода клубок-глобула белковоподобных сополимеров N-изопропилакриламида со стиролсульфонатом натрия с различным содержанием заряженных групп. Определены зависимости основных термодинамических параметров перехода от концентрации лигандов. Их анализ показывает, что полиамины связываются предпочтительно сополимерами в глобулярной конформации. Связывание полиаминов усиливается с увеличением функциональности лиганда в ряду путресцин<спермидин<спермин, что указывает на кооперативный характер взаимодействия лиганд-матрица.

Аннотация результатов, полученных в 2016 году
Расчетно-теоретическая часть С использованием концепции многомасштабного моделирования выполнено виртуальное конструирование сополимерных последовательностей из мономеров различной полярности, которые способны в условиях водного раствора формировать компактные глобулярные водорастворимые глобулы со структурой “ядро-оболочка”. В случае использования сомономеров четырех типов, подобных по своим функциональным свойствам гидрофильным Ser, His, Asp и гидрофобным аминокислотным остаткам, формирующиеся глобулы по своим каталитическим центрам являются искусственными аналогами α-химотрипсина. При использовании в качестве сомономеров N-винилкапролактама (NVCL) и N-винилимидазола (NVI) глобулярные структуры, возникающие в ходе двухстадийной реакции синтеза (получение первого блока и наращивании на его основе случайного блок-сополимера), рассматриваются нами как модельные объекты для проверки возможности использования новых упрощенных методик синтеза синэнзимов. В обоих случаях при мезомасштабном моделировании реакций синтеза были задействованы модели тех же мономеров, что используются в экспериментальной части проекта. В случае моделирования аналогов α-химотрипсина на основе «виртуально синтезированных» полимерных цепей были построены полноатомные модели глобул синэнзима с различной степенью протонирования каталитически активных сомономеров, что отвечает разным значениям pH водного раствора. Полноатомное моделирование позволило провести детальный анализ строения каталитических глобул и особенностей функционирования каталитических глобул. Полученные результаты указывают, что для повышения каталитической активности синэнзимов, получаемых в рамках сформулированной в проекте концепции “биомиметического дизайна”, необходимо снизить конформационную подвижности скелетной цепи синэнзима. В ходе моделирования реакции свободно-радикальной сополимеризации NVCL и NVI показано, что на основе образующихся молекулярных цепей можно получить стабилизированные глобулярные наноструктуры с морфологией типа ядро–оболочка в узкой области изменения параметров модели, а именно когда массовая доля первого блока составляет ~25% от общей массы цепи, а объемная доля NVI в составе реакционной смеси оставляет ~70%. Экспериментальная часть Определены оптимальные условия синтеза белковоподобных сополимеров (БП) NVCL c N-акрилоилгистамином. Изучена структура (мономерный состав) синтезированных сополимеров, исследовано температурно-зависимое поведение их водных растворов и проявление комплесообразующей способности в различных условиях. Выполнено изучение координационного комплексообразования синтезированных БП с гемином и продемонстрирован эффект конформационно-зависимого связывания данной простерической группы с синтетической моделью апобелка. Найдены условия получения диблок-сополимеров (ДС) NVCL и NVI, содержащих не менее 20 мол. % NVI-звеньев, за счет изменения состава растворителя, увеличения концентрации сомономеров. Содержание звеньев NVI в ДС определяется природой растворителя и молекулярной массой PNVCL-блока: чем лучше растворитель для PNVCL-блока с данной молекулярной массой, тем выше концентрация NVI-звеньев в сополимере. В ТГФ удалось получить ДС с 26 мол. % NVI-звеньев. При использовании водно-органических смесей в качестве растворителя можно регулировать еще и истинную реакционную способность мономера и растущего радикала. В смешанном растворителе удалось получить полимер, содержащий 40 мол. % NVI-звеньев. Температурно-зависимое поведение ДС исследовано методом СРС-ДРС. Показано, что температура фазового расслоения (Т с.р.) практически не зависит от длины PNVI-блока, но зависит от концентрации и состава растворителя, понижаясь в ряду вода ≥ TRIS-буфер > фосфатный буфер, что связано с дестабилизирующим влиянием фосфат-аниона на PVCL-гидратные комплексы. Обнаружено явление перехода растворов ДС в обратимое мицеллярное состояние (мезоглобулы с числом агрегации 2000–3000, Rh 200–250 нм, Rg/Rh≤1) в области температур между θ-температурой и Тс.р.. Скорость гидролиза п-нитрофенилпропионата растет с увеличением молекулярной массы PNVCL- и PNVI-блоков. Каталитическая активность ДС зависит от состава второго полимерного блока. ДС, состоящий из PNVCL-блока и PNVI-блока, менее активен, чем ДС, состоящий из PNVCL (первый блок) и сополимера NVCL и NVI (второй блок), несмотря на меньшее содержание NVI-звеньев в сополимере. Наибольшую каталитическую активность проявляет сополимер с Mn первого блока, равной 5180 Да, и содержащий 13.8 мол. % звеньев NVI: скорость гидролиза увеличивается в 23 раза по сравнению со скоростью реакции без добавления полимера. Исследовано влияние антидепрессанта доксепина, на энергетику перехода клубок-глобула белковоподобных сополимеров N-изопропилакриламида со стиролсульфонатом натрия (НИПАМ-ССН) с содержанием заряженных групп 1.1 и 14.9 мол.%. Получены зависимости термодинамических параметров перехода от концентрации доксепина. Они указывают на предпочтительное связывание доксепина сополимером в глобулярной конформации. Определены константы связывания доксепина сополимерами Kb = 250 M-1 (1.1% ССН) и Kb = 140 М-1 (14.9% ССН).