Аннотация результатов, полученных в 2014 году
Реализован синтез квантовых точек строения ядро/оболочки разных цветов эмиссии. Установлены условия, позволяющие на выходе получать КТ с заданными спектральными характеристиками (положение полосы испускания). Установлены состав и строение квантовых точек (КТ) и платформ гигинтского комбинационного рассеяния (ГКР), позволяющие получить минимальное неспецифическое взаимодействие с внутренней поверхностью фотонно-кристаллических волноводов (ФКВ). Показано, что основным критерием является заряд и количество ПЕГ во внешних оболочках меток. Разработаны методики получения таких полимеров и гидрофилизации КТ. Разработана методика синтеза усиленной флуоресцентной метки с использованием наночастиц оксида кремния в качестве носителя для квантовых точек. Установлены условия получения оптимальных меток. Для дальнейшего биоконъюгирования усиленных меток КТ@SiO2 с биологическими молекулами, на поверхности частиц вводили функциональные амино-группы путем модификации КТ@SiO2 2-аминопропилтриэтоксисиланом. Для повышения буферной стабильности на поверхность частиц КТ@SiO2 был добавлен полиэтиленгликоль, так же снижающего неспецифическую сорбцию частиц на разнообразных поверхностях. Частицы КТ@SiO2 модифицированные амино-группами и ПЭГ фрагментами показывают узкое распределение по размерам, а также высокую стабильность в буферных растворах в широком диапазоне рН. Разработаны методики включения квантовых точек в микрокапсулы. При этом КТ вводили как в темплат (ядра карбоната кальция), так и в оболочки полиэлектрлитов. Показано, что положение спектров не изменяется при внесении КТ в наночастицы оксида кемния и микрокапсулы. Получены нанокомпозитные микрокапсулы на основе кальций карбонатных ядер и полиэлектролитов полиаллиламин гидрохлорид и полистиролсульфонат натрия включающие квантовые точки на основе селенида калия с различным цветом свечения. Эффективность включения КТ в состав полиэлектролитной оболочки можно увеличить путем предварительного связывания квантовых точек в комплекс с полиэлектролитом. Получены конъюгаты люминесцентных меток на основе КТ с иммунореагентами. Получены и оптимизированы свойства 2 типов платформ для ГКР: структуры «ядро-оболочка», состоящие из микроядер карбоната кальция, содержащих наночастицы магнетита и покрытые серебром; золь-гель материалы, содержащие наночастицы серебра. Методом пьезокварцевого микровзвешивания (регистрируя изменение частоты пьезокварцевого резонатора) изучены системы: хитозан / гиалуроновая кислота со связыванием антител по карбоксигруппам гиалуроновой кислоты карбодиимидным методом; полистиролсульфонат / хитозан со связыванием антител с по аминогруппам хитозана с использованием глутарового альдегида; полиэтиленимин / гиалуроновая кислота также со связыванием антител карбодиимидным методом. Показано максимальное нарастание массы для третьей системы, что свидетельствует о наиболее эффективном связывании. Разработаны условия модификации внутренней поверхности ФКВ для внесения меток и реагентов методами последовательного нанесения электролитов и силанизации. Предварительно показана высокая равномерность распределения вносимых реагентов внутри мульткапилляров, установлены закономерности сорбции. Установлены закономерности влияния состава смеси и условий реакции на скорость образования золь-гель материалов, содержащих наночастицы металлов, в качестве платформ для ГКР. Показана необходимость снижения концентрации силанизирующих агентов при переходе от мультикапилляров к ФКВ. При исследовании влияния параметров модификации на спектральные измерения характеристики ФКВ установлены оптимальные условия формирования поверхностного слоя активных ОН-групп С целью получения активных функциональных групп на поверхности ФКВ изучена возможность прививки алкосиланов на активированную поверхность. В качестве модификатора использовали этанольный раствор APTES, использование которого предполагает модификацию ФКВ NH2-группами. Установлено, что после пропускания раствора APTES через ФКВ наблюдается смещение положения полос в спектрах пропускания, что свидетельствует, с одной стороны, об эффективной модификации, а с другой стороны о необходимости учета этого эффекта при дальнейшей работе. Реализовано ковалентное связывание белковых молекул с поверхностью модифицированного ФКВ использовали с помощью глутарового альдегид (на примере пероксидазы хрена). Установлено, что после добавления в систему хромогенного субстрата развивается окраска, свидетельствующая о эффективном связывании фермента. Доработаны модули импорта данных спектральной микроскопии комбинационного рассеяния (КР) из форматов NTMDT и NanoScanTech и разработан новый модуль Renishaw WiRE. Данные разработки позволяют реализовать количественный химический анализ образца на его поверхности по данным микроскопии КР в том случае, если размер исследуемых областей превышает разрешение оптической системы регистрации. Articles: Приняты в печать (вышли) статьи: 1. Goryacheva I.Yu., Speranskaya E.S., Goftman V.V., Tang D., De Saeger S. Nanostructures multiloaded with quantum dots: construction and bioanalytical applications. Trends in Anal. Chem, in press. 2. Beloglazova N.V., Goryacheva O.A., Speranskaya E.S., Aubert T., Goryacheva I.Y., De Saeger S., Silica-coated liposomes loaded with quantum dots as labels for multiplex fluorescent immunoassay. Talanta 2015, V 134, P. 120-125. 3. N.V. Beloglazova, I.Yu. Goryacheva, S. De Saeger Preparation and characterization of stable phospholipids-silica nanostructures loaded with quantum dots Submitted to Journal of Materials Chemistry B DOI: 10.1039/C4TB01662A

Аннотация результатов, полученных в 2015 году
В соответствии с заявленным планом, предполагалось проведение работ по двум направлениям: 1) оптимизация люминесцентных и ГКР меток и 2) модификация ФКВ и разработка сенсоров. Люминесцентные метки, содержащие одну и несколько квантовых точек структуры ядро/оболочка, получали силанизацией КТ и КТ-содержащих структур. Получен набор стабильных пегилированных функционализированных амино-, меркапто- или эпокси-группами нанокомпозитов КТ@SiO2. Данные методики позволяют контролировать размер полученных меток, величину дзета-потенциала, а также сохранять высокие квантовые выходы люминесценции. Показано, что введение в дополнение к функциональным группам ПЕГ фрагментов позволяет повысить стабильность КТ@SiO2 в буферных растворах с широким диапазоном рН и ионной силы. Была проведена биоконъюгация полученных нанокомпозитов с антителами и полученные метки применены в твердофазном иммуноферментном анализе и колоночном тест-методе. Разработана методики получения, конъюгации и применения силанизированных липосом, содержащих несколько КТ в липидном гидрофобном бислое. Оптимизированя свойства КТ, методики конъюгации и аналитического применения. Разработаны методики получения силанизированных микрокапсул как потенциальных носителей Лм и ГКР частиц. Другой способ, использовавшийся для перевода в воду гидрофобных КТ, состоял в использовании амфифильного полимера. Были разработаны методики гидрофилизации с использованием трех полимеров, отличающихся наличием ПЕГ-фрагментов и видом функциональных групп. Сравнение стабильности КТ, гидрофилизованных посредством силанизации и включения в оболочки амфифильного полимера показало, что при воздействии внешним электрическим полем снижение интенсивности флуоресценции гидрофилизированных полимером КТ наблюдается при мощности электрического поля примерно на 4 порядка меньше, чем это описано в литературе для твердых полимерных матриц. Получены стабильные в водных растворах КТ, модифицированные с помощью полиамидоаминного дендримера (ПАМАМ 4-го и 5-го поколения). Показана высокая коллоидная стабильность полученных частиц (Z-потенциал -50 мВ) и высокий квантовый выход комплексов ПАМАМ-КТ в водных растворах. Получены ГКР метки на основе наночастиц серебра, покрытых слоем 4-меркаптобензойной кислоты и стабилизированных оболочкой диоксида кремния. Размер серебряных НЧ составил 50±12 нм, при Z-потенциале в районе -40 мВ. Проведенное изучение влияния степени агрегации серебряных НЧ в растворе на интенсивность сигнала ГКР меток показало, что формирование агрегатов состоящих из двух и трех НЧ позволяет более чем в 7-8 раз повысил интенсивность спектров ГКР. Выбрана оптимальная архитектура ФКВ, представляющая поместить пробу аналита в полую сердцевину и содержащая в спектре пропускания несколько локальных максимумов интенсивности с большой глубиной модуляции, что позволяет осуществлять анализ сигнала КТ в широком диапазоне длин волн. Разработан способ селективной изоляции зоны структурной оболочки ФКВ с полой сердцевиной методом кратковременной температурной обработки для запайки внешних полых оболочек. Для каждого типа ФКВ с полой сердцевиной подобраны индивидуальные режимы обработки. Для активации поверхности ФКВ подобран состав смеси пероксида водорода (конц) - серная кислота (конц), способ и время обработки. Установлено, что положение максимумов в спектре пропускания ФКВ коррелирует с количеством силанольных групп на внутренней поверхности полой сердцевины и может быть использовано для управления эффективностью ее дальнейшей модификации. Разработан метод модификации поверхности ФКВ послойной адсорбцией противоположно заряженных компонентов. В качестве меток использовали гидрофилизованные КТ ядро/оболочка на основе CdSe различных цветов свечения (отрицательно заряженные наночастицы) и полиэтиленимин (положительно заряженный полимер). Показано, что нанесение одного бислоя в ФКВ не приводит к сдвигу спектров пропускания, но вызывает увеличение интенсивности, это вызвано изменением показателя преломления сердцевины. Дополнительно к плану изучены возможности модификации внутренней поверхности ФКВ полианилином. Подобраны условия получения стабильных сплошных пленок полианилина толщиной 100-150 нм. . Проведено сравнение сорбционных свойств ФКВ и мультикапилляров. Установлено, что в качестве материалов для твердофазной экстракции применение мультикапилляров предпочтительнее, поскольку попадание анализируемых растворов в обкладки ФКВ приводит к сильным изменениям оптических свойств ФКВ (светопропускания) из-за изменений показателей преломления на границе раздела фаз внутри ФКВ, а также из-за частичной закупорки обкладок. В то же время ФКВ с запаянными обкладками имели низкую сорбционную способность, обусловленную низкой удельной поверхностью центрального канала. Изучено использование в качестве модифицирующего покрытия ГКР сенсоров на основе ФКВ оксида алюминия со встроенными НЧ серебра (ГКР-активные сорбенты). Разработан простой, дешевый и надежный способ синтеза ГКР-активных сорбентов путем реакции осаждения гидроксида алюминия в водном растворе, содержащем предварительно синтезированные НЧ серебра, с последующим высушиванием полученного композита. В качестве дополнительно фактора, усиливающего ГКР-сигнал, предложено встраивание искусственно агрегированных НЧ серебра в ГКР-активные сорбенты. Показано, что ГКР-активные сорбенты со встроенными агрегатами усиливают спектры ГКР больше чем на порядок, по сравнению с сорбентами содержащими неагрегированные НЧ. Были доработаны стандартные модули анализа объёмных данных в пакете Gwyddion. Был разработан новый модуль кластерного анализа спектральных данных K-medians (K-срединных) и доработан разработанный в ходе выполнения работ прошлого года модуль K-means (K-средних). Для работы в качестве чувствительного элементы ФКВ с активным слоем совмещены с одноразовым наконечником на дозатор, оптимизируются условия считывания сигнала.

Аннотация результатов, полученных в 2016 году
Разработаны методики внесения люминесцентных и ГКР меток на внутреннюю поверхность фотонно-кристаллических волноводов при использовании самоорганизующихся пленок полианилина, образующихся в результате окислительной поликонденсации анилина, силанольных покрытий, формирующихся на поверхности капилляра в результате золь-гель процесса а так же покрытий, полученные методом послойного нанесения полиэлектролитов (layer-by-layer) различного состава и количества слоев. Получены закономерности синтеза и свойств люминесцентных и ГКР меток (спектральные свойства, размер, вид внешнего покрытия, количество и качество функциональных групп на поверхности) и их конъюгатов с иммунореагентами для использования в сенсорах на основе ФКВ. Разработаны методики модификации полой середины ФКВ для изготовления чувствительного элемента биосенсора на основе ФКВ при использовании следующих способов модификации: самоорганизующихся пленок полианилина, образующихся в результате окислительной поликонденсации анилина, силанольных покрытий, формирующихся на поверхности капилляра в результате золь-гель процесса а так же покрытий, полученные методом послойного нанесения полиэлектролитов (layer-by-layer) различного состава и количества слоев. Установлено, что нанесение полимерного слоя полианилина на внутреннюю поверхность ФКВ приводит к существенному смещению (~20 нм) полос в спектрах пропускания ФКВ Изучено связывание белковых молекул на внутренней поверхности модифицированных ФКВ за счет электростатического взаимодействия (в качестве индикаторного белка выступала пероксидаза хрена). Изучено влияние морфологии пленок модификаторов и методов включения люминесцентных и ГКР меток и их коньюгатов с антителами на интенсивность сигналов люминесценции и ГКР для применения в биосенсорах. Установлены закономерности управления положением фотонных запрещенных зон в ФКВ на основе разных способов модификации для выделения целевых сигналов лежащих в пределах «запрещенных» и «разрешенных» зон полос пропускания ФКВ. Показано, что при попадании в запрещенные зоны, либо на границы разрешенных зон спектры люминесценции КТ претерпевают длинноволновые сдвиги. На примере КТ в качестве люминесцентной метки показано 300 кратное усиление аналитического сигнала при переходе от капилляров к фотонно-кристаллическим волноводам. Показано, что ФКВ с люминесцентным детектированием применим как к гетерогенному, так и к гомогенному формату иммуноанализа. Оценено влияние качества подготовки образцов ФКВ на положение спектральных полос и воспроизводимость аналитического сигнала. Интересным эффектом, наблюдаемым в экспериментах с ФКВ, являлось запаивание отдельных боковых обкладок за счёт плазмонного поглощения золотыми наночастицами при включении лазера установки на полную мощность (30 мВт), что приводило к значительному разогреву локальной области на торце ФКВ выше температуры плавления стекла. Этот эффект позволяет управлять тем, в какие из обкладок будет наноситься покрытие или входить аналит, но практическое использование данного подхода требует отдельной разработки в дальнейшем. При переходе к взаимодействию фермент-хромогенный субстрат ФКВ существенно проигрывает микропланшетному (и вообще любому планарному) формату, поскольку образующиеся в процессе хромогенной субстратной реакции микроколичества кислорода блокируют ФКВ, что приводит к фатальному изменению пропускания ФКВ. Показана применимость ФКВ для детектрования с использованием реагентов, меченных люминесцентными метками – КТ и флуоресцеином. Для модельного белка чувствительность составляет 2,5 мкМ. Разработана методика восстановления трёхмерной морфологии поверхности из снятых в конфокальном режиме сканирующего лазерного микроскопа Z-стеков основанная на использовании максимума по глубине (оси Z) сигнала отражения лазера или максимума сигнала ФЛ для образцов, обладающих люминесцентными свойствами. Разработан оптимальный дизайн системы, позволяющей работать в «безреагентном» режиме. Показана необходимость запайки полых обкладок ФКВ перед проведением подготовки ФКВ. Оптимизирована методика работы с ФКВ, позволяющая минимизировать стандартное отклонение сигналов и добиться максимальной воспроизводимости. Разработаны методики получения ГКР спектров крови в ФКВ. Интенсивность сигнала КР, получаемого с помощью ФКВ, сильно зависит от эффективности согласования числовой апертуры и точки фокусировки пучка света и апертуры входного сечения ФКВ, хотя данный вопрос требует дополнительных исследований. Оптимизация сечения ФКВ привела к значительному увеличению сигнала при меньшей используемой мощности лазера. Показано, что ФКВ оптимально подходит для работы именно с люминесцентными метками, позволяя усиливать сигнал и отделить его от мешающих сигналов и фона. В ходе выполнения проекта в 2016 году опубликована монография в издательства Elsevier (реферируется в Scopus), два обзор (Trends in Analytical Chemistry, Talanta), экспериментальные статьи (частично по результатам 2015 года) (Biosensors and Bioelectronics, ACS Applied Materials & Interfaces, Journal of Luminescence, Colloids and Surfaces A: Physicochemical and Engineering Aspects, Optical Materials и две статьи в Journal of Nanoparticle Research), направлен исправленный после рецензии обзор по КР меткам в ФКВ в Trends in Analytical Chemistry, экспериментальная статья в Microchim Acta. Материалы исследований, которые пока не опубликованы, представлены детально в разделе отчета «Сведения о фактическом выполнении плана работы на год». Результаты работы представлены в виде приглашенного, двух устных и большого количества стендовых докладов на международных и всероссийских конференциях. План работ выполнен полностью. Очерчены перспективы развития основных направлений проекта.