КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ
Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.
ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ
Номер проекта 19-74-00124
НазваниеИзучение процессов адаптации и интерференции нативных CRISPR-Cas систем типа III бактерии Thermus thermophilus
Руководитель Артамонова Дарья Николаевна, кандидат наук (признаваемый в РФ PhD)
Организация финансирования, регион Автономная некоммерческая образовательная организация высшего образования «Сколковский институт науки и технологий» , г Москва
Конкурс №40 - Конкурс 2019 года «Проведение инициативных исследований молодыми учеными» Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными, в том числе молодыми учеными
Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни; 04-208 - Молекулярная биология
Ключевые слова CRISPR-Cas системы, тип III, CSM, CMR, адаптация, интерференция, Cas1, бактериофаги, иммунитет бактерий, резистентность, термофильные бактерии
Код ГРНТИ34.15.23
ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ
Аннотация
CRISPR-Cas системы - системы адаптивного и наследуемого иммунитета прокариот, защищающие клетки бактерий и архей от вторжения вирусов и препятствующие проникновению плазмид. CRISPR-Cas системы состоят из CRISPR-кассет и сопряженных с ними cas генов. CRISPR-кассеты - особое место в геноме, где идентичные участки - повторы - перемежаются с уникальными участками - спейсерами. Глобально механизм действия всех CRISPR-Cas систем можно разделить на 3 стадии: первая - адаптация - приобретение иммунологической памяти путем встраивания в CRISPR-кассету спейсеров - участков чужеродной ДНК, вторая - экспрессия и созревание в клетке всех компонентов систем, необходимых для защиты, третья - интерференция - специфическое узнавание и уничтожение “врага”. На сегодняшний день выделено 6 различных типов систем: с I по VI. Классификация проведена на основе белкового состава рибонуклеопротеиновых комплексов, так называемых эффекторных комплексов, обеспечивающих стадию интерференции. Уникальность CRISPR-Cas систем типа III заключается в том, что это единственный тип из всех ныне известных, для которого характерен транскрипционно-зависимый механизм действия, т.е. иммунность может обеспечиваться только в случае транскрипции мишени. Исключительно у систем типа III эффекторный комплекс обладает одновременно и РНКазной и ДНКазной активностью. Как следствие, механизм интерференции для CRISPR-Cas систем типа III наиболее сложный. Он включают в себя большое количество подстадий, тонко скоординированных друг с другом и требующих присутствия многих белковых компонентов, как в составе эффекторного комплекса, так и вне его. По сей день остается много открытых вопросов как относительно стадии адаптации, так и интерференции. Данный проект предполагает решение двух глобальных задач. Во-первых, в ходе проекта будет произведено исследование процесса адаптации в лабораторном штамме термофильной бактерии Thermus thermophilus Hb27, обладающей активными системами типа III, как в условиях заражения двумя разными бактериофагами, способными инфицировать данный штамм, так и в условиях трансформации клеток плазмидой. Эта задача является крайне актуальной, поскольку на сегодняшний день только одной лаборатории в мире удалось создать условия для наблюдения адаптации в бактериях (Marinomonas mediterranea), обладающих CRISPR-Cas системами типа III. При этом следует отметить, что M. mediterranea кодирует ключевой белок адаптации - Cas1 - слитый с доменом обратной транскриптазы, позволяющим приобретать спейсеры из РНК. В штамме Thermus thermophilus Hb27 обратная транскриптаза отсутствует, тем не менее полученные в нашей лаборатории предварительные данные показали, что адаптация систем типа III в T. thermophilus Hb27 возможна. Это свидетельствует о принципиально отличном механизме приобретения спейсеров. В рамках проекта будет проведено высокоэффективного секвенирование для анализа большой выборки приобретенных спейсеров в случае взаимодействия CRISPR-Cas систем с каждым из фагов и плазмидой. Кроме того методом гомологичной рекомбинации будут получены мутантные штаммы с делецией генов, предположительно необходимых для процесса адаптации, после чего эксперименты по детекции адаптации будут проведены на этих штаммах. Второй задачей является определение эффективности и особенностей процесса интерференции. Будет проведена проверка способности клеток, приобретших спейсер, противостоять инфекции соответствующим фагом либо трансформации плазмидой. Планируется сравнить эффективность защиты в случае приобретения спейсеров из различных регионов для каждого из фагов / плазмиды. Кроме того будет изучена деградация ДНК-мишени методами количественной ПЦР и проведено исследование деградации чужеродной ДНК с использованием высокоэффективного секвенирования. Актуальность этой задачи также высока, поскольку на данный момент мировым научным сообществом установлено, что эффекторный комплекс систем типа III обладает нуклеазной активностью в отношении однонитевой ДНК, однако детали процесса раскуса ДНК-мишени неизвестны.
ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ