Роль инсулиноподобного фактора роста 2 и связывающих его белков в молекулярных механизмах памяти

КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер проекта 18-75-10112

НазваниеРоль инсулиноподобного фактора роста 2 и связывающих его белков в молекулярных механизмах памяти

Руководитель Баль Наталья Вячеславовна, Кандидат биологических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт высшей нервной деятельности и нейрофизиологии Российской академии наук , г Москва

Конкурс №30 - Конкурс 2018 года по мероприятию «Проведение исследований научными группами под руководством молодых ученых» Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными, в том числе молодыми учеными

Область знания, основной код классификатора 05 - Фундаментальные исследования для медицины; 05-106 - Нейробиология

Ключевые слова Память, консолидация, реконсолидация, инсулиноподобный фактор роста 2, ИФР-2, Igf2, синаптическая пластичность, угашение памяти

Код ГРНТИ34.15.43

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Память – это способность живых организмов сохранять и воспроизводить информацию. В ходе формирования память превращается из нестабильной (лабильной) формы в стабильную – этот процесс называется консолидацией памяти. При предъявлении условного стимула после обучения происходит реактивация памяти, которая на некоторое время также становится лабильной. После реактивации, в зависимости от условий напоминания, память может сохраняться или даже усиливаться, и позднее вновь стать стабильной – этот процесс обозначают термином «реконсолидация памяти». При многократном напоминании без подкрепляющего сигнала (подачи пищи, воды, электрокожного раздражения) происходит угашение памяти. Какие молекулярные и клеточные процессы лежат в основе процессов консолидации, реконсолидации и угашения? Основные исследования на молекулярном и клеточном уровне, которые проводились многие десятилетия, касались в первую очередь изучения формирования памяти. Так, были открыты ранние гены, которые экспрессируются в первые минуты и часы после обучения, и которые запускают синтез поздних генов, изменяющих структурно-функциональные свойства нейронов, причем эти изменения могут сохраняться в течение длительного времени. В течение последних двух десятилетий накапливаются экспериментальные данные о молекулярных процессах, происходящих при напоминании и реконсолидации/угашении памяти, однако эти данные пока разрозненные и не образуют стройную картину. Появление новых методов исследования экспрессии генов привело к обнаружению фактора, играющего важную роль в образовании памяти – инсулиноподобного фактора роста 2 (ИФР-2, Igf2). Это белок, для которого ранее было показано участие в развитии организма и в онкологических процессах, ранее привлекал мало внимания нейробиологов. Однако в последнее время накапливаются данные о том, что Igf2 и связывающие его белки (Igfbp - Insulin-like growth factor-binding protein) и рецепторы играют важную роль как в формировании, так и в угашении памяти. Этот белок можно отнести как к ранним генам, так и к поздним, поскольку в некоторых работах показывают его увеличение как через 1 час, так и через 20 часов после обучения. В предварительных пилотных экспериментах на небольшой группе мы также обнаружили недостоверное увеличение экспрессии Igf2 в гиппокампе крыс через час после обучения в модели условно-рефлекторного страха. По литературным данным, внутримозговое введение Igf2 приводит к усилению памяти, тогда как блокада его экспрессии с помощью введения антисмысловых олигонуклеотидов нарушает формирование памяти. В одной из работ показано изменение экспрессии Igf2 и Igfbp7 при обучении и угашении памяти. Кроме того, показано изменение уровня Igf2 и Igfbp2 в мышиной модели болезни Альцгеймера. Несмотря на отдельные работы, систематического морфофункционального Igf-связывающих белков в формировании и модификации памяти в настоящее время проведено не было, есть лишь несколько работ, посвященных роли только Igf2, поэтому данный проект актуален для получения новых данных о физиологии и патофизиологии мозга. Кроме того, практически отсутствуют работы о функции Igf-связывающих белков в мозге, хотя показана их экспрессия в мозге. Для исследования роли инсулиноподобного фактора роста 2 и связывающих его белков в механизмах нормальной работы памяти и при нарушении памяти будут проведены следующие эксперименты: Июль 2018-июнь 2019 года 1) Иммунофлуоресцентное окрашивание срезов мозга на Igf2 и Igf-связывающие белки с помощью специфичных антител. Будет проведено изучение колоколизации изучаемых белков с нейрональными и глиальными маркерами. 2) Проведение поведенческих экспериментов с обучением и напоминанием на грызунах с последующим сбором материала для измерения уровня экспрессии изучаемых генов с помощью количественного ПЦР на разных временных точках после обучения и напоминания. 3) На основе морфологических данных и измерения уровня экспрессии генов после обучения и напоминания будут выбраны как минимум два IGF-связывающих белка, наиболее интересных для данного исследования, для которых будут подобраны последовательности для производства плазмид и вирусов для РНК-интерференции. Для каждого гена будут подобраны минимум две последовательности, для каждой из которых будет сконструирована плазмида – вектор для сборки вирусов. 4) Будет сконструированы два вектора для подавления синтеза гена Igf2 и один вектор для его сверхэкспрессии. Анализ работоспособности вирусных конструкций будет проводиться с помощью вестерн-блоттинга со специфичными антителами. Июль 2019 – Июнь 2020 1) Сборка вирусов и проверка работоспособности генетических конструкций для подавления синтеза выбранных Igf-связывающих белков с помощью вестерн-блоттинга 2) Проведение исследований роли Igf2 и Igf-связывающих белков после подавления его синтеза и сверхэкспрессии в морфологии и функционировании пресинаптических и компонентов после in utero электропорации конструкций во 2-3 слои мозга крыс: анализ количества пресинаптических областей на длину отростка нейрона с помощью генетически-кодируемого маркера пресинапсов синаптофизина, конъюгированного с зеленым флуоресцентным белком GFP. Для функционального исследования пресинаптической функции вместе с изучаемой плазмидной конструкцией в нейроны будет введен светочувствительный канал (ChR2), вызывающий деполяризацию клетки. Сочетание электрофизиологической записи от постсинаптической клетки со световой стимуляцией трансфицированной клетки позволит получит данные о роли белков в синаптической передаче. 3) Морфологическое исследование локализации мРНК изучаемых генов в срезах мозга с помощью новейшей чувствительной методики RNAScope. 4) Выбор и отработка модели нарушения памяти при патологии головного мозга (при гипоксии, фармакологическом или стрессовом воздействии). Июль 2020-Июнь 2021 1) Проведение исследования роли Igf2 и Igf-связывающих белков в регуляции работы постсинапсов и в синаптической пластичности после инъекции полученных ранее вирусов в гиппокамп. 2) Проведение исследования роли Igf2 и Igf-связывающих белков в консолидации, реконсолидации и угашении памяти с помощью внутримозговых инъекций вирусов. 3) Изучение роли сверхэкспрессии и подавления синтеза Igf2 в развитии патологии в модели нарушения памяти, выбранной на 2-м году выполнения проекта.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ