Бактерии обладают адаптивным иммунитетом к чужеродному наследственному материалу, например ДНК других бактерий и вирусов. Он обеспечивается различными защитными системами, одна из которых — CRISPR/Cas система. CRISPR — это участки молекулы ДНК бактерий, состоящие из палиндромных последовательностей (при считывании с разных концов последовательности одинаковы). Они разделены уникальными участками — спейсерами, — которые заимствуются из чужеродных молекул нуклеиновых кислот. РНК, которая образуется после считывания всей CRISPR-кассеты, взаимодействует с белками Cas. Этот комплекс распознает инородную ДНК (протоспейсер) и уничтожает ее. Сейчас использование CRISPR/Cas систем в генной инженерии перспективно для направленного редактирования генома. Однако молекулярный механизм этой адаптации (добавления новых спейсеров) плохо изучен. Было известно, что процесс внедрения новых участков в CRISPR-кассету осуществляет комплекс белков Cas1-Cas2, а участки чужеродной ДНК, которые деградируют в ходе иммунного ответа, служат источниками новых спейсеров. Поэтому предполагалось, что в клетках существуют молекулы-предшественники спейсеров — преспейсеры. Это фрагменты ДНК, которые были вырезаны из чужеродного генома, но еще не встроены в CRISPR-кассету. Более ранние эксперименты выявили, какие фрагменты ДНК связывает комплекс Cas1-Cas2 и внедряет в CRISPR-кассету in vitro, но структура преспейсеров in vivo оставалась неизвестной.
Ученые из Сколковского института науки и технологий и Университета Ратгерса (США) разработали метод выделения из клеток коротких фрагментов ДНК и высокопроизводительного определения их последовательности (FragSeq). Специалисты провели CRISPR/Cas адаптацию у кишечной палочки Escherichia coli и применили метод FragSeq для анализа накопленных фрагментов ДНК в клетках. Результаты показали, что из участков ДНК, окружающих протоспейсер, образуются короткие преспейсеры. Их последовательности совпали с последовательностями спейсеров, встроенных в CRISPR-кассету в ходе адаптации. Выявленные преспейсеры имели характерную асимметричную структуру. Предполагается, что такая организация необходима для встраивания нового спейсера, узнавания чужеродных молекул и их разрушения.
«Дальнейшие исследования будут направлены на то, чтобы получить полную картину молекулярных взаимодействий в процессе CRISPR/Cas адаптации, — говорит Анна Ширяева, аспирантка Сколковского института науки и технологий. — Это позволит исследовать принципы адаптивного иммунитета у бактерий и развивать технологию для направленного редактирования генома».
