Аннотация результатов, полученных в 2024 году
В 2024 году в соответствии с планом, нами были выполнены этапы 1 и 2 Задачи 2 «Определить, на какие стадии транскрипционного цикла влияют тканеспецифические транскрипционные факторы-партнеры (ткТФ-партнеры) экдизонового рецептора, помогающие ему активировать транскрипцию генов в различных тканях дрозофилы», а также был получен ряд дополнительных результатов по Задаче 1 «Определение эффекторных генов-мишеней экдизонового гормона в различных тканях на стадии метаморфоза». Были получены следующие научные результаты: 1) Были подобраны условия экстракции биотинилированных белков из тканей дрозофилы. Был преодолен ряд критических трудностей (избыточное количество стрептавидина в экстрагируемом образце, избыточная активность биотин-лигазы контрольного образца). Мы показали, что наилучшим способом экстракции биотинилированных белков с целью последующего протеомного анализа является использование химически-модифицированной стрептавидин-сефарозы, устойчивой к действию трипсина. В качестве пилотного эксперимента по поиску тканеспецифичных партнеров экдизонового рецептора мы провели выделение комплексов, биотинилированных EcR, слитым с TurboID, и экспрессированным в соматических клетках яичников дрозофилы. Было показано, что EcR-TurboID, экспрессированный в клетках яичников, биотинилирует белки Smr, CtBP и dSki8. Первые два белка являются известными корепрессорами транскрипции. Причем, для Smr была ранее показана роль в репрессии именно экдизон-зависимых генов. Белок dSki8 является субъединицей комплекса PAF, позитивного регулятора элонгации транскрипции. Мы полагаем, что обнаруженные нами белки участвуют в регуляции транскрипции экдизоновым рецептором, то есть являются его белками-партнерами в тканях яичников. 2) Было проведено ткане- и изоформ- специфическое выделение белков, биотинилированных биотин-лигазой, слитой с EcR-A и EcR-B1 изоформами экдизонового рецептора, из тканей мозга и слюнных желез личинки третьего возраста. Для того, чтобы определить белки, ассоциированные с экдизоновым рецептором, мы экспрессировали слитные белки EcR-A-TurboID и EcR-B1-TurboID в ткани мозга и слюнных желез третьей личинки (при помощи драйверов elav-GAL4 и sgs3-GAL4 соответственно). Биотинилированные белки были преципитированы с помощью стрептавидин-сефарозы, устойчивой к трипсину. Анализ преципитированных белков проводился при помощи трипсинолиза и LC-MS/MS. Проведенный анализ позволил нам установить белки-партнеры изоформ EcR в тканях личинки. Среди них мы обнаружили ДНК-связывающие белки, которые потенциально могут выступать в качестве тканеспецифических транскрипционных факторов-партнеров EcR. В частности, мы обнаружили, что EcR-A изоформа в мозге ассоциирована со многими архитектурными белками (к которым относятся CTCF, BEAF32, ZFH2, Pzg, GAF/Trl). В слюнных железах EcR-B1 изоформа ассоциирована с транскрипционным фактором Relish, контролирующим у дрозофилы гены иммунного ответа. В качестве перспективного транскрипционного фактора для последующего его исследования среди обнаруженных партнеров EcR был выбран белок Crp, обладающий повышенным уровнем экспрессии в ткани мозга в ходе метаморфоза. 3) Были получены и охарактеризованы специфические антитела к потенциальным партнерам экдизонового рецептора ДНК-связывающим белкам SRP/dGATAb, Tj/TrafficJam, Crp и Broad. Мы полагаем, что данные ДНК-связывающие белки могут участвовать в активации энхансеров под воздействием экдизона в тканях дрозофилы. Для описания механизма участия белка SRP/dGATAb в работе экдизон-зависимых энхансеров была проведена серия экспериментов в S2 клетках дрозофилы по активации транскрипции экдизоном на фоне нокдауна SRP/dGATAb (ChIP-Seq с использованием антител к EcR, SRP/dGATAb, H3K27Ac и RNA-Seq эксперименты). Был проведен предварительный анализ полученных данных, который показал, что белок SRP/dGATAb действительно необходим для активности некоторых экдизон-зависимых энхансеров. В настоящее время мы заканчиваем биоинформатический анализ полученных результатов и приступаем к написанию статьи по данной работе. 4) Охарактеризовали роль белка Tj/Traffic Jam в экдизон-зависимой транскрипции генов. При помощи ChIP-Seq показали, что Tj/Traffic Jam рекрутируется на сайты хроматина, в которых присутствует EcR, на фоне экзогенной экспрессии данного белка в эмбриональных клетках S2. Также была обнаружена колокализация сайтов связывания Tj/Traffic Jam и EcR в ткани яичников дрозофилы. То есть, результаты предварительных экспериментов показывают, что Tj/Traffic Jam может принимать участие в работе экдизон-зависимых генов, на которых присутствует EcR. Предварительные функциональные эксперименты с использованием клеток S2 (оценивающие влияние экзогенной экспрессии Tj/Traffic Jam на уровень экдизон-зависимой транскрипции) показали, что присутствие белка Tj/Traffic Jam оказывает репрессирующее действие на транскрипцию известных экдизон-зависимых генов. В связи с этим, работы по исследованию Tj/Traffic Jam в качестве партнера EcR было решено не продолжать. 5) По запросу ревьюеров в ходе публикации статьи о механизме тканеспецифической регуляции транскрипции генов экдизоном, мы провели дополнительные полногеномные эксперименты (ChIP-Seq) на ткани слюнных желез личинки L3 на фоне экспрессии транспортера экдизона Е23 и в контроле. Мы показали, что деплеция экдизона на фоне экспрессии его транспортера Е23 в клетках слюнных желез приводит к снижению на промоторах экдизон-индуцируемых генов белка ТВР, являющегося субьединицей общего фактора транскрипции TFIID. Полученный результат означает, что концентрация экдизона на промоторах данных генов контролирует процесс инициации транскрипции.

Аннотация результатов, полученных в 2025 году
В 2025 году были получены следующие научные результаты в рамках выполнения Задачи 2 «Определить, на какие стадии транскрипционного цикла влияют тканеспецифические транскрипционные факторы-партнеры (ткТФ-партнеры) экдизонового рецептора, помогающие ему активировать транскрипцию генов в различных тканях дрозофилы»: 1) Была охарактеризована роль SRP/dGATAb в работе экдизон-зависимых энхансеров и промоторов. Были определены гены, активация которых под действием экдизона зависит от нокдауна SRP/dGATAb в S2 клетках дрозофилы. Выделенные гены были разделены на две группы: «жирового тела» и «экдизонового каскада» (в зависимости от позитивной или негативной роли SRP/dGATAb в их экдизон-зависимой транскрипции). В локусах данных генов при помощи FAIRE-Seq были определены регуляторные элементы-энхансеры, на которых EcR и SRP/dGATAb функционируют совместно. Было показано, что в группе генов «жирового тела» EcR/SRP энхансеры обогащены мотивами SRP/dGATAb, но не EcR. Нокдаун SRP/dGATAb приводит к нарушению рекрутирования EcR к данным энхансерам, а также к нарушению их активности, которая выражается в снижении уровня активного маркера H3K27Ac. Мы полагаем, что именно эти изменения и приводят к снижению транскрипции данных генов на фоне нокдауна SRP/dGATAb. Молекулярным механизмом, приводящим к снижению транскрипции на фоне более низкой активности совместных EcR/SRP энхансеров, мы считаем нарушение механизмов инициации транскрипции. Было обнаружено, что в группе генов «экдизонового каскада» рекрутирование EcR на совместные EcR/SRP энхансеры не зависит от уровня SRP/dGATAb. На фоне SRP/dGATAb нокдауна наблюдается распространение маркера H3K27Ac по локусам генов данной группы. Именно повышенную активность энхансеров на фоне нокдауна SRP/dGATAb, выражающуюся в виде роста ацетилирования, мы и связываем с более высокой экдизон-зависимой активностью данной группы генов на фоне деплеции SRP/dGATAb. Проведенные нами эксперименты позволили продемонстрировать, что тканеспецифический фактор транскрипции, которым является SRP/dGATAb, может влиять на экдизон-зависимую индукцию транскрипции разнонаправленно, в зависимости от организации регуляторных элементов-энхансеров, находящихся в локусе. В зависимости от того, рекрутируется ли транскрипционный фактор непосредственно на регуляторные элементы ДНК, или, вторично, посредством белок-белковых взаимодействий, его влияние на транскрипцию может быть различным. 2) Была охарактеризована роль транскрипционного фактора Crp в работе экдизон-зависимых генов в S2 клетках дрозофилы. При помощи РНК-интерференции была продемонстрирована позитивная роль Crp в активации транскрипции ряда генов гормоном экдизоном в S2 клетках. Был выполнен ChIP-Seq анализ с использованием антител Crp и показано, что большинство Crp-зависимых генов, регулируемых экдизоном, не являются первичными мишенями (не содержат пики Crp. Для Crp-зависимых промоторов двух экдизон-зависимых генов (sox14 и eip75b) была исследована роль белка Crp в инициации транскрипции. Было обнаружено, что Crp необходим для привлечения на Crp-зависимые промоторы экдизон-зависимых генов ТВР субъединицы комплекса TFIID и, как результат, рекрутированию РНК-полимеразы II. В связи с тем, что белок Crp не был нами обнаружен ни на каких регуляторных элементах-энхансерах (а только на промоторах), его роль в активности энхансеров не исследовалась. 3) Была охарактеризована роль изоформ Broad в работе экдизон-зависимых генов При помощи специфических антител к Broad было показано, что данный белок не экспрессируется в S2 клетках дрозофилы, но его экспрессия может быть индуцирована обработкой клеток экдизоном. В экспериментах по ко-иммунопреципитации было продемонстрировано, что Broad и EcR входят в состав единого мультибелкового комплекса, то есть могут совместно управлять активностью регуляторных элементов в геноме дрозофилы. Были получены линии S2 клеток дрозофилы, способные экспрессировать Z1, Z2 и Z3 изоформы Broad на фоне индукции солями меди. Было исследовано, как экспрессия изоформ Broad влияет на базовый и индуцируемый уровень транскрипции экдизон-зависимых генов в S2 клетках. Было обнаружено, что даже в отсутствии экдизона изоформа Z1 стимулирует транскрипцию некоторых экдизон-зависимых генов. При этом, Z2 и Z3 изоформы, напротив, оказывают репрессирующий эффект на экдизон-зависимую транскрипцию. При помощи экспериментов ChIP-Seq было показано, что Z1 изоформа Broad рекрутируется на регуляторные участки генов, транскрипцию которых она позитивно регулирует. 4) Была охарактеризована роль белка Crol в работе экдизон-зависимых генов Были получены данные, демонстрирующие, что транскрипция отдельных экдизон-зависимых генов в слюнных железах личинки зависит от ДНК-связывающего белка Crol. Было обнаружено, что Crol связывает промоторы и энхансеры экдизон-зависимых генов, причём, уровень связывания данного белка выше в ткани слюнных желез, где данные гены активны, по сравнению с мозгом, где они неактивны. При помощи линии дрозофилы, нокаутной по гену crol, было показано, что, по крайней мере, на отдельных экдизон-зависимых энхансерах, белок Crol является фактором, праймирующим рекрутирование экдизонового рецептора EcR. Нарушение связывания Crol с данными сайтами на фоне нокаута приводит к снижению уровня связывания их экдизоновым рецептором EcR, а также к снижению уровня транскрипции экдизон-зависимых генов, содержащих данные регуляторные элементы. На основании полученных результатов мы полагаем, что белок Crol является одним из многих белков, которые подготавливают энхансеры для рекрутирования экдизонового рецептора в ткани слюнных желез личинки и, тем самым, обеспечивают специфический эффект экдизонового гормона на ткани D. melanogaster. 5) Были определены гены-мишени экдизонового гормона в ткани слюнных желез, характерные для предкуколочной стадии развития С использованием линии дрозофилы, экспрессирующей экспортер экдизона Е23, при помощи метода RNA-Seq был описан пул генов, чья транскрипция зависит от уровня гормона экдизона в ткани слюнных желез предкуколки. Был проведен сравнительный анализ генов-мишеней экдизона в ткани слюнных желез личинки третьей стадии и ткани предкуколки. Было показано, что в ткани предкуколки экдизон управляет транскрипцией генов, контролирующих процесс клеточной гибели (апоптоза и аутофагии) и иммунного и антимикробного ответа. 6) В 2025 году были опубликованы статьи по полученным данным в следующих журналах: Nucleic acids research (Q1 Scopus), International journal of molecular sciences (Q1 Scopus), Epigenetics & chromatin (Q1 Scopus), BMC genomics (Q1 Scopus), и одна статья принята в журнал Молекулярная биология.