Разработка многопараметрических биофизических тестов для исследования функции рецепторов, сопряжённых с G белком

КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер проекта 22-74-10036

НазваниеРазработка многопараметрических биофизических тестов для исследования функции рецепторов, сопряжённых с G белком

Руководитель Мишин Алексей Викторович, Кандидат физико-математических наук

Организация финансирования, регион федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Московский физико-технический институт (национальный исследовательский университет)" , г Москва

Конкурс №71 - Конкурс 2022 года «Проведение исследований научными группами под руководством молодых ученых» Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными, в том числе молодыми учеными

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни; 04-204 - Биофизика

Ключевые слова Биофизические функциональные тесты активности рецепторов, молекулярные механизмы функционирования, рецепторы, сопряжённые с G белком (GPCR); экспрессия белка, интегральные мембранные белки, рациональная разработка и скрининг лекарственных средств, микромасштабный термофорез, времяразрешённый резонансный перенос энергии (FRET, BRET, HTRF),масс-спектрометрия, дифференциальная сканирующая флуориметрия

Код ГРНТИ34.15.15

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Исследования мембранных белков in vitro всегда сдерживались трудностями получения чистых образцов и сложностью организации функциональных анализов на основе клеток и выделенных препаратов очищенного белка. Важнейшими трансмембранными белками в организме человека являются многочисленное суперсемейство рецепторов, сопряжённых с G белком (GPCR), функция которых заключается в передаче сигналов внутрь клетки. Данные рецепторы участвуют в регуляции всех основных функций организма и являются наиболее заметной группой терапевтических мишеней. Однако высокая конформационная подвижность и низкая термостабильность этих рецепторов всегда представляли серьезные проблемы для их экспериментальной характеризации. Подготовка образцов требует существенных усилий в белковой инженерии для разработки конструкций GPCR, подходящих для использования в экспериментальных исследованиях. Проект посвящён созданию и адаптацию палитры биофизических методик для проведения функциональных тестов для GPCR, которые давали бы важную комплементарную по отношению к структуре информацию о молекулярных механизмах работы рецептора и активируемого им сигнального пути. Наши анализы включают методики измерения констант связывания и изучение вторичных мессенджеров и партнеров по взаимодействию при формировании комплексов, а также полезны для изучения аллостерических лигандов и смещённой передачи сигнала (biased signalling), что является горячей темой в разработке лекарств для GPCR мишеней. В прикладном аспекте, настоящий проект направлен на принципиальное улучшение методов тестирования взаимодействия GPCR рецепторов c направленными на них лекарственными средствами при помощи использования биофизических методов исследования. Протоколы, которые мы разрабатываем, почти повсеместно могут быть перенесены на изучение многих других важных классов мембранных белков.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Публикации

1. Елизавета Ляпина ... Александра Лугинина .... Полина Хорн, Михаил Шевцов, Кирилл Ковалев, Сергей Бухдрюкер, Иван Охрименко ... Иван Гущин, Андрей Рогачев,… Валентин Борщевский, Алексей Мишин, Вадим Черезов Structural basis for receptor selectivity and inverse agonism in S1P5 receptors Nature Communications, Nat Commun 13, 4736 (2022). (год публикации - 2022)
10.1038/s41467-022-32447-1

2. Маслов Иван, Полина Хорн, Орехов Филипп, Анастасия Гусач, Павел Кузьмичев, Андрей Герасимов, Александра Лугинина, Андрей Богородский, Валентин Горделий,... Алексей Мишин, ...Вадим Черезов, .... Валентин Борщевский Sub-millisecond conformational dynamics of the A2A adenosine receptor revealed by single-molecule FRET Communications Biology, Commun Biol 6, 362 (2023). (год публикации - 2023)
10.1038/s42003-023-04727-z

3. Дмитриева Дарья, Котова Татьяна, Сафронова Надежда, Садова Александра, Дмитрий Дашевский, Алексей Мишин Protein Design Strategies for the Structural–Functional Studies of G Protein-Coupled Receptors Biochemistry Moscow, Biochemistry Moscow 88 (Suppl 1), S192–S226 (2023). (год публикации - 2023)
10.1134/S0006297923140110

4. Александра Лугинина, Анастасия Гусач, Елизавета Ляпина, Полина Хорн, Надежда Сафронова, Михаил Шевцов, Дарья Дмитриева, Дмитрий Дашевский, Татьяна Котова, Екатерина Смирнова, Валентин Борщевский, Вадим Черезов, Алексей Мишин Structural diversity of leukotriene G-protein coupled receptors Journal of Biological Chemistry, Journal of Biological Chemistry, Volume 299, Issue 10, 2023, 105247, ISSN 0021-9258 (год публикации - 2023)
10.1016/j.jbc.2023.105247

5. Полина Хорн, Александра Лугинина, Владимир Поспелов, Дмитрий Дашевский, Андрей Хныкин, Ольга Моисеева, Надежда Сафронова, Анатолий Белоусов, Алексей Мишин, Валентин Борщевский Rational Design of Drugs Targeting G-Protein-Coupled Receptors: A Structural Biology Perspective Biochemistry (Moscow), Biochemistry (Moscow), 2024, Vol. 89, No. 4, pp. 747-764 (год публикации - 2024)
10.1134/S0006297924040138

6. Анатолий Белоусов, Иван Маслов, Филипп Орехов, Полина Хорн, Павел Кузьмичев, Надежда Балеева, Владислав Мотов, Андрей Богородский, Светлана Краснова, Константин Минеев, Дмитрий Зинченко, Евгений Зерний, Валентин Иванович, Сергей Пермяков, Йохан Хофкенс, Йелле Хендрикс, Вадим Черезов, Томас Генш, Александр Мишин, Михаил Баранов, Алексей Мишин, Валентин Борщевский. Monitoring GPCR conformation with GFP-inspired dyes iScience, Anatoliy Belousov, Ivan Maslov, Philipp Orekhov, Polina Khorn, Pavel Kuzmichev, Nadezhda Baleeva, Vladislav Motov, Andrey Bogorodskiy, Svetlana Krasnova, Konstantin Mineev, Dmitry Zinchenko, Evgeni Zernii, Valentin Ivanovich, Sergei Permyakov, Johan Hofkens, Jelle Hendrix, Vadim Cherezov, Thomas Gensch, Alexander Mishin, Mikhail Baranov, Alexey Mishin, Valentin Borshchevskiy, Monitoring GPCR conformation with GFP-inspired dyes, iScience, Volume 27, Issue 8, 2024, 110466, ISSN 2589-0042, https://doi.org/10.1016/j.isci.2024.110466. (https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S2589004224016912) (год публикации - 2024)
10.1016/j.isci.2024.110466

7. Дмитрий Буркатовский, Андрей Богородский, Иван Маслов, Ольга Моисеева, Роман Чупров-Неточин, Екатерина Смирнова, Николай Ильинский, Алексей Мишин, Сергей Леонов, Георг Бюлдт, Валентин Горделий, Томас Генш, Валентин Борщевский. Examining transfer of TERT to mitochondria under oxidative stress Scientific Reports , Burkatovskii, D., Bogorodskiy, A., Maslov, I. et al. Examining transfer of TERT to mitochondria under oxidative stress. Sci Rep 14, 24185 (2024). https://doi.org/10.1038/s41598-024-75127-4 (год публикации - 2024)
10.1038/s41598-024-75127-4

8. Д. А. Дмитриева, Е. А. Смирнова, А. А. Садова, Л. М. Василенко, В. И. Борщевский, А. В. Мишин Expression and Stabilization of Recombinant Human C3aR Receptor Biochemistry (Moscow), Supplement Series A: Membrane and Cell Biology, Expression and Stabilization of Recombinant Human C3aR Receptor BIOCHEMISTRY (MOSCOW), SUPPLEMENT SERIES A: MEMBRANE AND CELL BIOLOGY Vol. 19 No. 2 2025 10.1134/S1990747825700084 (год публикации - 2025)
10.1134/S1990747825700084

9. Дмитрий Дашевский, Александра Лугинина, Иван Маслов, Марина Шевелёва, Полина Хорн, Дарья Дмитриева, Иван Капранов, Анатолий Белоусов, Сергей Пермяков, Вадим Черезов, Валентин Борщевский, Алексей Мишин. Unlocking GPCR-ligand interactions: Measuring binding affinities with thermal shift assay Protein Science, Dashevskii D, Luginina A, Maslov I, Shevelyova M, Khorn P, Dmitrieva D, Kapranov I, Belousov A, Permyakov S, Cherezov V, Borshchevskiy V, Mishin A. Unlocking GPCR-ligand interactions: Measuring binding affinities with thermal shift assay. Protein Sci. 2025 May;34(5):e70120. doi: 10.1002/pro.70120. PMID: 40247825; PMCID: PMC12006757. (год публикации - 2025)
10.1002/pro.70120

Публикации

Аннотация результатов, полученных в 2025 году
В рамках проекта достигнуты следующие научные результаты, подтверждающие прогресс в разработке многопараметрических биофизических тестов для исследования функции рецепторов, сопряжённых с G-белками. Разработаны и валидированы клеточные функциональные тесты для анализа активации сигнальных путей для целевых GPCR, сопряжённых с Gs, Gi и Gq-белками и бета-аррестином (по отдельности, исходя из профиля их активности). Проанализирован массив соответствующих данных, для ряда белков был проведён SAR анализ мутантов и проведён экспериментальный скрининг in silico предсказанных лигандов. Разработанные в рамках проекта подходы по исследованию функциональной активности GPCR методом nanoDSF были использованы в работе “Monitoring GPCR conformation with GFP-inspired dyes”, опубликованной нами в журнале iScience. Получены и проанализированы данные экспериментов по определению констант связывания лигандов с целевым GPCR методом анализа темического сдвига (Thermal shift assay, TSA). Работа была опубликована в журнале Protein Science. В рамках проекта разработан и верифицирован метод количественного анализа взаимодействия лигандов с рецепторами семейства GPCR на основе анализа термического сдвига (TSA). В качестве модельной системы был выбран аденозиновый рецептор A2A человека (A2AAR). Проведена оптимизация пробоподготовки, включая выбор красителя (CPM), концентраций белка (25 нМ) и красителя, что обеспечило высокую чувствительность и воспроизводимость при минимальном расходе образца (менее 1 мкг на полный эксперимент). Разработан универсальный протокол измерений, позволяющий определять константы диссоциации (Kd) ортостерических и аллостерических лигандов. Проведено тестирование трёх математических моделей анализа (на основе свободной энергии, температурного сдвига и изотермических кривых), обеспечивших согласованные между собой и с литературными данными значения Kd для четырёх ортостерических (ZM241385, LUF5834, CGS21680, NECA) и одного аллостерического (Na⁺) лиганда A2AAR. Показано, что разработанный подход позволяет достоверно различать аффинность различных лигандов, включая частичных агонистов и аллостерических модуляторов, с высокой чувствительностью. Полученные значения Kd сопоставимы с результатами SPR и радиолигандного анализа, что подтверждает валидность метода. Константа связывания ионов натрия, определённая методом TSA, согласуется с опубликованными данными ЯМР-спектроскопии. Проведена теоретическая оценка масштабируемости метода: TSA обладает высокой скоростью, простотой исполнения, совместим с высокопроизводительным скринингом и требует минимальных количеств рецептора. Метод не зависит от радиоактивных или труднодоступных компонентов и может быть реализован в любом молекулярно-биологическом лабораторном комплексе с оборудованием для real-time ПЦР. Подход особенно перспективен для первичного скрининга и количественной оценки связывания лигандов с трудно экспрессируемыми мишенями, включая GPCR и другие мембранные белки.

Публикации

Возможность практического использования результатов
Результаты проекта имеют высокий потенциал практического применения в фармацевтической и биомедицинской отраслях. Разработанные и валидированные в рамках проекта многопараметрические биофизические и клеточные тесты для GPCR позволяют создавать платформы для оценки активности разрабатываемых лекарственных соединений. Используемые и разрабатываемые в проекте технологии критически важны для этапов раннего доклинического скрининга, оптимизации структуры hit/lead соединений и рациональной разработки новых лекарств. Семейство GPCR — одни из наиболее актуальных и социально значимых классов молекулярных целей, на которые приходится более 30% всех препаратов на рынке. Формирование стабильных, воспроизводимых протоколов получения гомогенных GPCR-препаратов, а также методов количественной оценки связывания и активности лигандов создаёт научно-технологические заделы для внедрения наукоёмких производственных решений в области ранней разработки терапевтических агентов, в первую очередь — для лечения нейродегенеративных, аутоиммунных, онкологических, сердечно-сосудистых заболеваний и других социально значимых и орфанных заболеваний. Разработанный в рамках проекта универсальный, экономически эффективный и воспроизводимый метод количественного анализа взаимодействия лигандов с GPCR на основе анализа термического сдвига (TSA) открывает возможность для раннего и высокопроизводительного скрининга перспективных лекарственных кандидатов. Метод требует минимального количества белка, не использует радиоактивные реагенты и может быть масштабирован с использованием стандартного лабораторного оборудования, что обеспечивает его широкое внедрение в фармацевтических и биотехнологических компаниях, а также в структурах контрактных исследований (contract research organizations, CRO). Полученные результаты могут быть использованы в рамках: -разработки оригинальных лекарственных препаратов и воспроизведения биологических аналогов; -повышения эффективности скрининга и снижения стоимости доклинических испытаний; -создания отечественных биосенсорных и аналитических платформ для фармакологического анализа. Междисциплинарная команда, сформированная в рамках проекта, обладает необходимыми компетенциями для трансфера технологий в фармацевтическую индустрию и сопровождения внедрения на предприятиях. Оптимизируемые методы позволяют существенно сократить время и затраты на раннюю стадию доклинической разработки, повышая эффективность селекции «лидерных» соединений и снижая риск выбраковки на поздних этапах. Это критически важно для обеспечения фармацевтической независимости и лекарственной безопасности России, импортозамещения и реализации государственной стратегии в области биомедицины и здравоохранения.Таким образом, проект вносит вклад в укрепление технологического суверенитета, повышение конкурентоспособности российской фармацевтики и формирование условий для устойчивого экономического роста и улучшения качества жизни населения за счёт разработки эффективных подходов для ранней разработки оригинальных лекарств. Кроме того, предложенные подходы способствуют развитию отечественной исследовательской инфраструктуры в области структурной биологии и молекулярной биофизики, стимулирует подготовку высококвалифицированных кадров и создание рабочих мест в сфере высоких технологий. Таким образом, проект способствует как экономическому росту, так и социальному развитию Российской Федерации.