Фотопереключаемые флуоресцентные капсулы как новый подход в изучении процессов миграции клеток, их поведения и функций в фундаментальной биомедицине

КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер проекта 22-15-00292

НазваниеФотопереключаемые флуоресцентные капсулы как новый подход в изучении процессов миграции клеток, их поведения и функций в фундаментальной биомедицине

Руководитель Сухоруков Глеб Борисович, Кандидат физико-математических наук

Организация финансирования, регион Автономная некоммерческая образовательная организация высшего образования «Сколковский институт науки и технологий» , г Москва

Конкурс №68 - Конкурс 2022 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами»

Область знания, основной код классификатора 05 - Фундаментальные исследования для медицины; 05-106 - Нейробиология

Ключевые слова маркировка единичных клеток, отслеживание, миграция, фотопереключаемые микрокапсулы, стволовые клетки, нейрон, ткань мозга, нейробиология, восстановление мозга

Код ГРНТИ76.03.00

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Необходимость исследования тонких биологических процессов, происходящих в мозге в нормальном и патологическом состояниях на клеточном и субклеточном уровнях потребовало разработки новых сложных оптических методов мечения, детектирования и визуализации как функциональных кластеров, так и отдельных клеток. Серьёзным прорывом в данной области стала разработка трансгенных линий клеток и живых организмов, продуцирующих флуоресцентные фотоконвертируемые белки. Новая технология дала возможность визуализировать и понять ранее неизвестные процессы функционирования и взаимодействия нейронов. Полученные данные позволили по-новому взглянуть на проблему восстановления функций и регенерации нервной ткани. Фотоконвертиртируемые белки позволили следить за процессами, происходящими с нейронами не по статичным (фиксированным) микропрепаратам срезов тканей, а в живых клетках (как в культурах клеток, так и в нативной ткани) в режиме реального времени. Это не только повысило точность получаемых результатов, но и существенно снизило необходимость использования большого количества лабораторных животных в научных экспериментах. Полученные данные стали основанием для разработки новых, более эффективных принципов и подходов в терапии нервной системы. Однако, как любой метод, фотоконвертируемые белки имели и до сих пор имеют ряд существенных недостатков, которые являются причиной продолжающихся исследований. К этим недостаткам можно отнести: склонность фотоконвертируемых белков к деградации, проявление цитотоксичных свойств, склонность к агрегации, недостаточный уровень флуоресценции, невозможность длительного (в течении нескольких дней\недель) отслеживания объектов, выгорание и «разбавление» фотоконвертированного белка при делении клеток. Однако, наиболее значимым недостатком является необходимость генной модификации биологических объектов (отдельных клеток, их культур или организма) для возможности реализации фотомечения. Генная модификация первичных культур клеток, выделенных из пациента, является спорным и достаточно противоречивым вопросом в случае, когда терапия предполагает аутотрансплантацию выделенных и размноженных клеток обратно в организм. При этом, проблема использования генетически-модифицированного живого материала для дальнейшей терапии носит не только объективный медицинский характер, но и субъективный социально-религиозный. В связи с необходимостью устранения описанных недостатков научные группы по всему миру сконцентрировались в двух направлениях решения проблемы: устранение отдельных единичных недостатков конкретных фотопереключаемых белков и поиск альтернативных фотопереключаемых меток на основе наноматериалов и красителей. Исследования, ведущиеся в первом направлении, позволили решить ряд проблем: были получены более стабильные и менее токсичные виды отдельных белков, однако ключевой недостаток – генная модификация, лежащая в основе метода, является не разрешимым ограничением этого метода. Поиск альтернативных фотопереключаемых меток способствовал разработке флуоресцентных фотопереключаемых красителей, однако и у этого метода есть свои недостатки, свойственные и белкам, - значительно ограниченный выбор длины волны для возбуждения, невозможность идентифицировать отдельную клетку среди нескольких помеченных клеток. Кроме того, фотопереключаемые красители и белки не обеспечивают возможность длительного отслеживания из-за постепенного разбавления красителя при делении и выгорания, а также исключают дополнительную прокраску нескольких типов рецепторов (например, антителами), из-за общей прокраски всей клетки и мембраны. В связи с этим, создание принципиально новой фотопереключаемой метки является важной задачей не только для нейробиологии, но и для других отраслей биомедицины. Проведённые нами предварительные исследования показали, что многослойные полимерные капсулы легко захватываются клетками и могут оставаться в них в течении нескольких дней/недель. Микронный размер и яркость капсул с одной стороны, обеспечивает их надёжное детектирование внутри живых клеток, с другой стороны, оставляет возможность прокраски мембраны и цитоскелета дополнительными красителями, флуоресцирующими даже в той же области спектра. Мы показали, что полимерные капсулы, полученные методом гидротермального синтеза в растворе родамина B, обладают способностью необратимого изменения спектра флуоресценции при воздействии на них лазерного излучения определённой длины волны и мощности - фотопереключения [1]. Эксперименты на клеточных культурах свидетельствуют об отсутствии выраженной токсичности, разрабатываемой нами фотопереключаемой метки, при этом она демонстрирует высокий уровень флуоресценции и отличную фотостабильность. Важным преимуществом разрабатываемого метода перед существующими аналогами, является возможность индивидуальной маркировки и последующей идентификации каждой конкретной клетки среди помеченных. Это возможность реализуется за счёт способности клеток захватывать несколько капсул одновременно, что позволяет присвоить клетке индивидуальный цветовой код за счёт комбинации переключенных и непереключенных капсул. Все эти качества делают разрабатываемые нами фотопереключаемые флуоресцентные капсулы перспективными кандидатами для изучения процессов миграции клеток, их поведения и функций в фундаментальной биомедицине. 1. Demina, P. A., Sindeeva, O. A., Abramova, A. M., Prikhozhdenko, E. S., Verkhovskii, R. A., Lengert, E. V., ... Goryacheva I.Yu. & Sukhorukov, G. B. (2021). Fluorescent Convertible Capsule Coding Systems for Individual Cell Labeling and Tracking. ACS Applied Materials & Interfaces, 13(17), 19701-19709. doi: 10.1021/acsami.1c02767.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Публикации

1. Сапач А.Ю., Синдеева О.А., Нестерчук М.В., Цитрина А.А., Майорова О.А., Прихожденко Е.С., Верховский Р.А., Микаелян А.С., Котелевцев Ю.В., Сухоруков Г.Б. Macrophage in vitro and in vivo tracking via anchored microcapsules ACS Applied Materials & Interfaces (год публикации - 2022)
10.1021/acsami.2c12004

2. Синдеева О.А., Демина П.А., Козырева Ж.В., Муслимов А.Р., Гуслякова О.И., Лаушкина В.О., Мордовина Е.А., Цюпка Д., Епифановская О.С., Сапач А.Ю., Горячева И.Ю., Сухоруков Г.Б. Labeling and tracking of individual human mesenchymal stromal cells using photoconvertible fluorescent microcapsules International Journal of Molecular Sciences, Т. 24. – №. 17. – С. 13665. (год публикации - 2023)
10.3390/ijms241713665

3. Смирнов И. В., Усатова В. С., Берестовой М. А., Федотов А. Б., Ланин А. А., Белоусов В. В., Сухоруков Г. Б. Long-term tracing of individual human neural cells using multiphoton microscopy and photoconvertible polymer capsules Journal of the Royal Society Interface, 21(219), 20240497. (год публикации - 2024)
10.1098/rsif.2024.0497

4. Козырева З. В., Демина П. А., Гуслякова О. И., Сухоруков Г. Б., Синдеева О. А. Exchange of free and capsule conjugated cyanine dyes between cells Journal of Materials Chemistry B, 12, 12672 - 12683 (год публикации - 2024)
10.1039/D4TB01874E

5. Козырева З. В., Демина П. А., Сапач А. Ю., Терентьева Д. А., Гуслякова О. И., Абрамова А. М., Горячева И. Ю., Трушина Д. Б., Сухоруков Г. Б., Синдеева О. А. Multiple dyes applications for fluorescent convertible polymer capsules as macrophages tracking labels Heliyon, Volume 10, Issue 10, e30680. (год публикации - 2024)
10.1016/j.heliyon.2024.e30680

6. Синдеева О. А., Демина П. А., Козырева З. В., Терентьева Д. А., Гуслякова О. И., Муслимов А. Р., Сухоруков Г. Б. Single mesenchymal stromal cell migration tracking into glioblastoma using photoconvertible vesicles Nanomaterials, 14(14), 1215. (год публикации - 2024)
10.3390/nano14141215

Публикации

Аннотация результатов, полученных в 2024 году
В ходе реализации третьего (заключительного) этапа проекта проводились детальные эксперименты по тестированию применимости биосовместимых, синтетических, фотопереключаемых капсул в качестве меток для отслеживания нейронов в 3D моделях нервной ткани, моделях остроизолированных и органотипических срезов мозга, а также in vivo с применением мультифотонной и двухфотонной микроскопии. Исследования с применением двухфотонной микроскопии показали, что микрокапсулы могут быть захвачены нейронами гиппокампа в остроизолированных срезах мозга уже через 4 часа после введения в нервную ткань. При этом было обнаружено, что более мелкие капсулы, размером 2-3 мкм захватываются нейронами гораздо эффективнее, в сравнении с капсулами большего размера (5 мкм), и надёжно идентифицируются в тканях органотипических срезов мозга даже спустя 7 дней после начала эксперимента. Капсулы сохраняют целостностность оболочки и яркость флуоресценции, достаточную для их надежной идентификации в тканях на разной глубине в течении этого времени. Инкапсуляция красителя в слои микрокапсул препятствует высвобождению красителя из них, что предотвращает окрашивание соседних клеток и тканей. На мышиной модели in vivo было показано, что микрокапсулы медленно распространяются в ткани, и к 4 часу эксперимента (как и в случае органотипическими срезами) уже встречаются внутри некоторых кортикальных нейронов, близко расположенных к месту введения. Яркий флуоресцентный сигнал позволяет идентифицировать капсулы in vivo на глубине 50-150 мкм, что значительно превышает пределы визуализации, характерные для конфокальной микроскопии (не более 70 мкм). Капсулы сохраняют яркий флуоресцентный сигнал даже через 14 дней после введения в мозг мыши. Как и в случае с органотипическими срезами мозга, диффузия красителя из оболочек микрокапсул и окрашивание близкорасположенных клеток и тканей не отмечались. На модели инсульта мыши была показана возможность идентификации стволовых клеток в ткани мозга, меченных микрокапсулами, через 7 дней после введения клеток через атланто-окципитальную мембрану. Была отмечена колокализация сигнала от капсул, стандартного мембранного красителя и областей ишемического повреждения мозга, что свидетельствует о миграции стволовых клеток, меченных микрокапсулами, в ишемические зоны. Кроме того, наблюдалось окрашивание близкорасположенных клеток и тканей в результате миграции красителя (RAPID DiL) на мембраны соседних клеток, что показывает несомненное преимущество микрокапсул над липофильными мембранными красителями в качестве меток для длительной трассировки клеток in vivo. Аналогичный результат был получен в in vitro исследовании по сравнению фотопереключаемых капсул на основе цианиновых красителей с этими же красителями в свободной форме. На модели нервной ткани (3D нейросфероидах) были подобраны параметры лазерного воздействия, необходимые для фотопереключения микрокапсул, с использованием мультифотонной оптической системы, включающей сверхбыстрые лазеры (1050 нм) и модифицированный многофотонный микроскоп. Успешное фотопереключение удалось продемонстрировать для капсул, локализованных на разной глубине (60–320 мкм). Микрокапсулы демонстрировали желаемое изменение спектра флуоресценции, что открывает возможность их использования для отслеживания отдельных нейральных клеток в более комплексных многоклеточных структурах. Возможность фотопереключения микрокапсул также была продемонстрирована в кортикальных нейронах остроизолированных срезов мозга мыши с применением двухфотонной микроскопии. Однако, подобного изменения удавалось достичь только при длительном и мощном воздействии двухфотонного фемтосекундного лазера (более 1 мин, ~ 40-70 мВт, длина волны 910 nm). С применением двухфотонной микроскопии удавалось фотопереключить микрокапсулы, интернализованные нейронами, даже на глубине 150 мкм in vivo. Тем не менее, достигнуть такого эффекта удавалось только при параметрах экспозиции 1-3 мин, 70 мВт, длина волны 910 нм. Стоит, однако, отметить, что некоторые клетки значительно изменяли свою морфологию после воздействия лазерного излучения на капсулы, что может свидетельствовать о нарушении их жизнеспособности, как в случае in vivo исследования, как и в случае с остроизолированными срезами. В целом, двухфотонная и мультифотонная микроскопия позволила метить и изучать глубоко расположенные живые клетки как в срезах мозга, так и in vivo. Однако, необходимость значительного увеличения мощности лазера и длительности его воздействия из-за неоптимальной длины волны для фотопереключения микрокапсул, ставит под вопрос безопасность применения этого метода для маркировки клеток. В связи с этим, возможность повреждения клеток должна быть учтена, детально исследована и проанализирована при планировании экспериментов с применением двухфотонной микроскопии. Разработанная методика для трекинга индивидуальных клеток с применением фотопереключаемых микрокапсул имеет широкий потенциал для разработки и анализа новых подходов клеточной терапии неврологических расстройств за счет исследования фундаментальных механизмов миграции единичных клеток in vitro и in vivo.

Публикации

Возможность практического использования результатов
Полученные результаты могут стать толчком к развитию многих аспектов современной биологии и медицины. Разработанная уникальная методика мечения и маркировки отдельных клеток может быть использована как для фундаментальных исследований, так и решения сугубо прикладных задач по изучению механизмов развития и поиску новых способов терапии нейродегенеративных заболеваний. Понимание процессов, происходящих на клеточном уровне, позволит создать более эффективную и направленную терапию различных онкологических заболеваний. Разработанные в ходе реализации проекта подходы и протоколы позволяют использовать их не только для научных исследований, но также для визуализации фундаментальных процессов в медицине и биологии при обучении студентов, аспирантов и ординаторов, что существенно повысит качество образовательного процесса, позволит подготовить специалистов более высокого уровня, обеспечит экономический рост и социальное развитие Российской Федерации.