Аннотация результатов, полученных в 2020 году
В ходе выполнения работ первого года исследований проводились работы по выяснению базовых механизмов системного контроля ветвления корневой системы у овоще-бахчевых и зерновых культур на примере огурца (Cucumis sativus) и гречихи (Fagopyrum esculentum), у которых боковые корни формируются непосредственно в меристеме родительского корня. Проводилась идентификация ортологов генов RALFL34, THE1, CEP5 и CEPR1 Arabidopsis у огурца и гречихи. В протеоме огурца нами найдено 17 белков RALFL, из них 4 идентифицированы впервые, и 21 рецепторная киназа CrRLK1-like RLKs. Также у огурца впервые были идентифицированы единственные ортологи AtRALFL34 и его рецепторной киназы AtTHE1 - пептид CsRALFL34 и киназа CsTHE1. У гречихи идентифицированы 21 белок семейства RALFL и 29 рецепторных киназ. Впервые был выявлен единственный ортолог AtRALFL34 у гречихи – FesRALFL34, а также ортолог AtTHE1 у гречихи (FesTHE1). В результате анализа протеомов огурца и гречихи было идентифицировано 8 белков CEP огурца и 11 белков CEP гречихи. Однако, с использованием биоинформационных подходов не представляется возможным выявить ортологи белка CEP5 Arabidopsis в протеоме огурца и гречихи. Нами идентифицировано два возможных ортолога CEPR1 Arabidopsis у огурца (CsaCEPR1-like1 и 2) и четыре ортолога CEPR1 Arabidopsis у гречихи (FesCEPR1-like1, 2, 3, 4). Впервые были клонированы промоторы генов RALFL34 и его рецептора THESEUS1 огурца и гречихи. Созданы новые генетические конструкты для изучения паттернов экспрессии RALFL34 и THE1 огурца с репортером NeonGreen с ядерной локализацией. Клонированы кодирующие последовательности выявленных ортологов RALFL34 и THE1 у огурца и гречихи. Для анализа распределения белка RALFL34 в корне огурца были получены два новых вектора, имеющих различные варианты трансляционных сшивок. Также получен вектор для одновременного анализа распределения белка RALFL4 и визуализации максимумов ответа на ауксин, что позволит выявить последовательность участия RALFL34 в наиболее ранних этапах инициации бокового корня. При помощи метода агробактериальной трансформации штаммами Agrobacterium rhizogenes были получены трансгенные корни огурца, несущие вставки полученных генетических кассет. Нами впервые проведен детальный анализ тканевого паттерна распределения малого сигнального пептида CsRALFL34 в кончике корня огурца. Визуализацию паттерна экспрессии CsRALFL34 и CsTHE1 и распределения белка CsRALFL34 проводили с применением конфокальной микроскопии. С использованием конструкции без линкера мы показали, что у огурца CsRALFL34 транспортируется из клеток первичной ксилемы, где начинается его синтез, и развивающихся примордиев боковых корней, в апопласт клеток первичной коры, где, вероятно, может влиять на транспорт ауксина или блокировать рост растяжением клеток корня за счет подщелачивания апопласта. Анализ транспорта этого пептида в надземную часть будет продолжен в ходе работ 2021 года. Активность промотора гена CsTHESEUS1, предполагаемого рецептора RALFL34, происходит в клетках всех тканей родительского корня, а также в примордиях развивающихся боковых корней. Вероятно, ген THESEUS1 у огурца, обладает конститутивной экспрессией в кончике корня и все клетки корня потенциально могут рецептировать малый сигнальный пептид RALFLF34. Также нами были сконструирован вектор для повышенной конститутивной экспрессии гена CsRALFL34 и получены трансгенные корни огурца. Данные работы являются подготовительным этапом для сравнительного анализа транскриптомов в зоне инициации примордиев бокового корня у огурца. Все запланированные на 2020 год работы выполнены в полном объеме. По результатам проведенных работ подготовлена рукопись публикации.

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
В ходе второго года реализации гранта проводились работы по анализу влияния сверхэкспрессии гена малого сигнального пептида CsRALFL34 на паттерн ветвления корневой системы огурца (Cucumis sativus), а также комплексные исследования роли RALFL34 в системной регуляции быстрого ветвления корневых систем огурца и гречихи. Были получены генетические конструкции, позволяющие изучить паттерн тканевой активности генов RALFL34 и его рецептора THESEUS1 у гречихи. Проведены обширные работы по адаптации методики агробактериальной трансформации этого объекта. При помощи метода ПЦР-РВ проведён детальный анализ распределения экспрессии CsRALFL34 в различных органах огурца. Нами показано, что CsRALF34 экспрессируется во всех основных органах растения: корне, гипокотиле, семядолях, листьях, цветках и плодах. Также был выполнен анализ динамики уровня экспрессии гена CsRALF34 в ответ на экзогенную обработку корней синтетическим ауксином (нафтилуксусной кислотой). Нами впервые показано, что ауксин не влияет на уровень экспрессии сигнального пептида CsRALF34 в корне огурца. В результате анализа аминокислотных последовательностей белков RALF34 у 19 видов порядка Cucurbitales (Тыквоцветные) было выявлено значительное сходство между зрелыми пептидами RALF34 в этом порядке и у Arabidopsis thaliana. Был синтезирован синтетический пептид CsRALFL34. Было установлено, что кокультивация с синтетическим пептидом CsRALF34 в гидропонной культуре в концентрации 1 мкМ не приводила к статистически достоверным изменениям количества формируемых примордиев боковых корней у огурца и гречихи. Также проведен комплекс работ по анализу влияния сверхэкспрессии CsRALFL34 на паттерн ветвления корневой системы огурца. При помощи метода агробактериальной трансформации Agrobacterium rhizogenes были получены трансгенные корни огурца, несущие вставки генетических кассет p35S-CsRALF34-TermAct и p35S-GUS-TermAct (контрольная группа). Для корней опытной и контрольной группы измеряли индекс инициации боковых корней (ИБК), позволяющий оценить влияние на процессы инициации примордиев. Мы не обнаружили статистически значимых различий в значениях индекса ИБК между корнями со сверхэкспрессией CsRALF34 и корнями контрольной группы. Подготовлены библиотеки кДНК кончиков корней огурца со сверхэкспрессией CsRALFL34 и контрольной группы для последующего анализа транскриптомов и получения данных о генах, экспрессия которых связана с работой гена CsRALFL34. Впервые получены вектора для трансформации растений, позволяющие проводить одновременное изучение экспрессии гена CsRALFL34 и визуализацию максимумов клеточного ответа на ауксин с целью выявления взаимосвязи инициации бокового корня огурца и запуска тканеспецифичной экспрессии сигнальных пептидов. Получено два варианта векторов на основе 236 pKGW-RR-MGW, в которых экспрессионые кассеты DR5::mRuby3-H2B-TermAct (для локализации максимумов клеточного ответа на ауксин) и pCsRALFL34::NeonGreen-H2B-TermAct (для изучения тканевой активности промотора CsRALFL34) находятся по отношению друг к другу в ориентациях «хвост к хвосту» и «голова к хвосту». Получены предварительные данные о возможном влиянии друг на друга кассет в последней ориентации. Проведен анализ данных о распределении малого сигнального пептида CsRALFL34 и максимумов клеточного ответа на ауксин в кончике корня огурца. Показано отсутствие связи накопления пептида в апопласте клеток коры с формированием примордиев бокового корня. Также показано отсутствие транспорта этого пептида в побег. Все запланированные на 2021 год работы выполнены в полном объеме. Результаты работы представлены на двух конференциях. По результатам проведенных работ опубликован обзор в журнале Q1. Две публикации поданы в печать.

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
В ходе третьего года реализации проекта проводились работы по анализу доменов экспрессии генов малых сигнальных пептидов RALF34 и CEP в корнях растений с быстрой стратегией ветвления – огурца (Cucumis sativus) и гречихи (Fagopyrum esculentum). Были получены новые генетические конструкции pKGW-DR-MGW-pCsCEPs::mNeonGreen-H2B, позволяющие изучить тканевую активность промоторов генов ортологов генов CEP огурца совместно с распределением клеточного ответа на ауксин (DR5). Анализ данных показал, что домены экспрессии генов CEP огурца не совпадают с максимумами клеточного ответа на ауксин. В пределах апикальной меристемы родительского корня огурца слабая и непродолжительная экспрессия CsCEP1 в клетках перицикла на флоэмном полюсе начиналась после первых периклинальных делений при инициации примордия бокового корня. Также экспрессия CsCEP1 детектировалась между примордиями в рядах перицикла на ксилемном полюсе. Промотор гена CsCEP2 был активен в центральном цилиндре, перицикле и коре корня, но не в примордиях боковых корней. Экспрессия гена CsCEP4 была приурочена к покоящемуся центру, инициалям рядов клеток, перициклу на ксилемном полюсе, а также его слабая активность наблюдалась в примордиях после периклинальных делений. CsCEP5 активно экспрессировался в покоящемся центре и инициалях чехлика, а также в примордиях боковых корней на всех стадиях их развития, начиная от инициации. Высокий уровень экспрессии CsCEP6 наблюдался в покоящемся центре и колумелле чехлика, а также на всех стадиях развития примордиев боковых корней. Однако, уровень его экспрессии в примордиях был значительно ниже, чем в рядах перицикла ксилемного полюса между примордиями. Таким образом, наши данные впервые убедительно показали, что только экспрессия CsCEP5 приурочена к начальным этапам инициации бокового корня – формированию клеток-предшественниц. Был проведен комплекс работ по анализу влияния сверхэкспрессии шести ортологов генов CsCEP на паттерн ветвления корневой системы огурца. Вектор pB7WG2D, позволяющий проводить сверхэкспрессию отдельных генов под контролем 35S промотора, модифицирован с учётом особенностей объекта исследования: скрининговый ген зелёного флуоресцентного белка GFP заменён на ген DsRed1, кодирующий белок с флуоресценцией в оранжевой области видимого спектра. На основе нового вектора pB7WG2R были получены конструкции для сверхэкспрессии шести ортологов генов CEP огурца. Также был выполнен анализ динамики уровня экспрессии шести генов CsCEP в ответ на экзогенную обработку корней синтетическим ауксином (нафтилуксусной кислотой). Нами впервые показано, что повышение концентрации ауксина за счёт экзогенной обработки снижает уровень экспрессии всех генов CEP огурца, кроме CsCEP3. Из шести генов CEP огурца только CsCEP4 можно отнести к генам раннего ответа на ауксин. Были получены данные по влиянию конститутивного запуска экспрессии гена CsRALF34 на экспрессию отдельных транскрипционных факторов (GATA) и ключевых факторов регуляции пролиферации клеток (E2F). Убедительно показано, что экспрессия CsGATA14 и CsGATA24, двух возможных ортологов гена транскрипционного фактора GATA23 Arabidopsis, не изменялась при сверхэкспрессии CsRALF34 в корнях огурца. В результате филогенетического анализа было найдено шесть белков CsE2F/DP – ортологов фактора регуляции пролиферации клеток E2F Arabidopsis. Уровень экспрессии всех генов, кодирующих данные белки, не изменялся при конститутивной сверхэкспрессии CsRALF34. В совокупности данные, полученные при оценке экспрессии CsE2F/DP, CsGATA14, CsGATA24, позволяют предположить, что CsRALF34 не является ключевым компонентом регуляторных генных сетей, связанных с наиболее ранними этапами инициации бокового корня. Также были получены данные о регуляции работы гена CsRALF34 этиленом. Так, экспрессия CsRALF34 статистически значимо снижалась под действием предшественника синтеза этилена (1-аминоциклопропан-1-карбоновой кислоты), но в то же время не изменялась под действием блокатора синтеза этилена (2-аминоизомасляной кислоты). Эти данные позволяют предположить, что, в отличие от AtRALF34 Arabidopsis, CsRALF34 лишь частично задействован в сигнальном пути этилена. С целью выявления белков дифференциально синтезирующихся при повышении концентрации CsRALF34, был проведён анализ биохимических маркеров стресса, первичного и вторичного метаболома, а также протеома корней огурца с конститутивной повышенной экспрессией гена CsRALF34. Впервые было убедительно показано, что CsRALF34 опосредует подавление роста корня через регуляцию клеточного цикла (остановка в G2-фазе митотического цикла) за счет повышения уровня киназы контрольной точки (Chk) и снижению содержания фосфатазы-индуктора М-фазы (CDC). Индукция адаптации к условиям стресса происходит через повышение чувствительности клеток к абсцизовой кислоте и активацию антиоксидантных систем, метаболизм клетки перестраивается на получение энергии из сахаров и их производных.