Аннотация результатов, полученных в 2019 году
На первом этапе реализации проекта проанализирована ассоциация различных фенотипов циркулирующих опухолевых клеток (ЦОК) и костномозговых клеток-предшественников с гематогенным метастазированием, отслеженным в течение 4 лет. Определены две субпопуляции ЦОК, ассоциированных с развитием гематогенных метастазов, то есть обладающих свойствами метастаз-инициирующих и нишеобразующих. Среди исследованных костномозговых клеток-предшественников выявлены два типа клеток, ассоциация которых с гематогенным метастазированием предполагает их участие в формировании преметастатических ниш. Получены ассоциативные данные относительно связи эффективности НАХТ с популяционным составом ЦОК и костномозговых клеток-предшественников. Было показано, что в крови пациентов с полной или частичной регрессией опухоли в ответ на НАХТ уровень ЦОК, ассоциированных с гематогенным метастазированием, перед биопсией был значительно ниже чем у пациентов не отвечающих на проводимое предоперационное лечение (стабилизация или прогрессия). Оценена хемотаксическая способность ЦОК по экспрессии рецепторов CXCR4 и CXCR7 к CXCL12 (SDF-1), обеспечивающих экстравазацию ЦОК и их миграцию в преметастатические ниши. Показано, что рецепторы CXCR4 и CXCR7 экспрессировали все популяции ЦОК независимо от наличия признаков стволовости и эпителиально-мезенхимального перехода (ЭМП). Показано, что среди популяций ЦОК чаще всего и в большем количестве обнаруживаются клетки без признаков стволовости. Была охарактеризована фенотипическая гетерогенность популяций стволовых ЦОК, ассоциативно связанных с гематогенным метастазированием, на основе оценки сочетания трех маркеров стволовости CD44+CD24-, CD133+, ALDH1+. Обнаружены различные варианты сочетания маркеров, характеризующих наличие стволовоподобных свойств ЦОК. Проведена оценка степени мезенхимизации популяций ЦОК с признаками ЭМП, ассоциативно связанных с гематогенным метастазированием, на основании определения экспрессии EpCam, CK7, Snail и N-cadherin. Обнаружено, что метастаз-инициирующие и нишеобразующие ЦОК находились в разных фазах ЭМП. Было проведено сравнение популяционного состава опухолевых клеток и костномозговых клеток-предшественников в первичной опухоли (биопсийный и операционный материал) и в крови. В первичной опухоли встречались все популяции опухолевых клеток с признаками стволовости и ЭМП и их сочетанием, обнаруживаемые среди ЦОК. Анализ ассоциации субпопуляций опухолевых клеток первичной опухоли с гематогенным метастазированием позволил установить, что клетки первичной опухоли, ассоциированные с гематогенным метастазированием, имели тот же фенотип, что и метастаз-инициирующие ЦОК. Кроме того, обнаружены корреляционные связи различной силы и направленности между количеством различных клеток-предшественников в крови и соответствующих им по фенотипу клеточных элементов в опухолевой ткани. Проведена научно-практическая школа “Секвенирование единичных клеток”. На школе были представлены лекции ведущих специалистов в области клеточного анализа и секвенирования из Rockefeller University (США), German Cancer Research Center (Германия), Университета ИТМО, Института биоорганической химии РАН и Томского НИМЦ РАН. Участие в школе приняли молодые учёные из МГУ им. М.В. Ломоносова, Национального исследовательского центра эпидемиологии и микробиологии имени почётного академика Н. Ф. Гамалеи, Института биоорганической химии РАН, Института высшей нервной деятельности и нейрофизиологии РАН, Мордовского государственного университета им. Н.П. Огарева, НМИЦ им. В. А. Алмазова, ФИЦ Институт цитологии и генетики СО РАН, Томского НИМЦ РАН и Лимнологического института СО РАН. Школа состояла из трёх блоков: экспериментального (подготовка кДНК-библиотек с помощью системы 10x Genomics), круглого стола (доклады лекторов и участников) и биоинформатического (демонстрация методов обработки данных секвенирования). В результате реализации первого этапа проекта получены данные, которые будут положены в основу разработки запланированной на следующих этапах технологии мультиадресной пошаговой молекулярно-ориентированной химио- и таргетной терапии больных раком молочной железы с учетом чувствительности каждой из популяций ЦОК, ассоциированных с гематогенным метастазированием. Полученные результаты доложены на международных конференциях: EACR-ESMO Joint Conference Liquid Biopsies, 15 - 17 May 2019, Bergamo, Italy ESMO congress, 27 Sept - 1 Oct 2019, Barcelona, Spain 6th Zoo Meeting “Cell Adhesion and Migration in Inflammation and Cancer”, Rotterdam, The Netherlands, May 15-18, 2019 4th ACTC meeting “Liquid Biopsy: Latest Advances and Future Challenges”, October 2nd - 5th, 2019 г. Greece. II Объединенный научный форум, включающий VI Съезд биохимиков России, VI Съезд физиологов СНГ и XII Съезд иммунологов и аллергологов СНГ совместно с Конгрессом РААКИ, 1-6 октября, 2019 г., г. Сочи-Дагомыс. Результаты опубликованы в журналах: Annals of Oncology,Q1; Journal of Cell Science, Q1; Journal of Clinical Medicine,Q1; Breast Cancer: Targets and Therapy, Q2; «Биохимия»,Q2, « Гены и клетки», Q3. Освещение результатов в средствах массовой информации: https://nauka.tass.ru/nauka/7053002 https://www.poisknews.ru/wp-content/uploads/2019/06/POISK_23-24_20190607.pdf https://www.poisknews.ru/wp-content/uploads/2019/06/POISK_25_20190621.pdf https://medvestnik.ru/content/news/Tomskii-NII-onkologii-predlojil-sposob-raspoznat-porojdaushie-metastazy-rakovye-kletki.html https://www.gazeta.ru/science/news/2019/10/29/n_13633268.shtml https://polit.ru/news/2019/10/29/ps_rnf/ http://www.tsu.ru/news/v-tomske-prokhodit-pervaya-v-rf-shkola-sekvenirova/?sphrase_id=209965 http://krasnoeznamya.tomsk.ru/index.html?news-name=19742 https://www.poisknews.ru/wp-content/uploads/2019/06/POISK_25_20190621.pdf https://www.poisknews.ru/wp-content/uploads/2019/06/POISK_23-24_20190607.pdf

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Настоящий проект посвящен поиску метастаз-инициирующих (МИ) и нишеобразующих (НО) клеток рака молочной железы (НО), характеристике их молекулярного портрета и опухолеобразующих способностей на моделях in vitro и in vivo и разработке технологии для предсказания риска гематогенного метастазирования и алгоритма персонифицированного лечения с целью профилактики метастатической болезни. На втором году проекта решены следующие задачи: 1. Разработана медицинская технология персонифицированного предсказания высокого и низкого риска развития гематогенных метастазов у больных раком молочной железы на основании оценки МИ и НО ЦОК. 2. Описан генетический и транскрипционный портрет МИ и НО ЦОК. Результаты секвенирования единичных ЦОК показали, что МИ-ЦОК и НО-ЦОК представляют собой группы, объединяющие несколько клеток, близких по варианту экспрессии маркеров эпителиальности, стволовости и признакам ЕМТ. В качестве МИ-ЦОК рассмотрены CD45-GP9-EpCAM+CD44-CD24-VIM+ клетки (n=2 кл), CD45-GP9-KRT8+CD44-CD24-VIM+ клетки (n=5 кл) и CD45-GP9-KRT18+CD44-CD24-VIM+ клетки (n=1 кл). В качестве НО-ЦОК рассмотрены CD45-GP9-Epcam-KRT18+CD44+CD24-VIM+ клетки (n=3 кл) и CD45-GP9-Epcam-KRT8+CD44+CD24-VIM+ клетки (n=2 кл). Все ЦОК обеих групп были трижды негативными по экспрессии генов ESR1, PGR и ERBB2. Каждый из фенотипов группы МИ-ЦОК, одним из ключевых признаков, которых было отсутствие экспрессии генов CD44 и CD24, действительно не обладали признаками стволовости, поскольку не экспрессировали гены PROM1 (CD133) и ALDH1A1. НО-ЦОК, несмотря на наличие признаков стволовости по экспрессии генов CD44/CD24, также как и МИ-ЦОК, не экспрессировали другие гены стволовости (PROM1 и ALDH1A1). Эта особенность обеих метастаз-ассоциированных ЦОК отличала их от ЦОК группы сравнения, в которой обнаруживались дважды позитивные по признакам стволовости клетки (CD44+CD24-ALDH1A1+). Следует отметить, что практически все ЦОК проявляли признаки, по которым их следует отнести к вариантам гибридного фенотипа ЕМТ. В соответствии с данными литературы, отношение экспрессии MAPK14 и MAPK1 является признаком покоя диссеминированных клеток опухоли или их активации. По этим признакам МИ-ЦОК отличались как от НО-ЦОК, так и от ЦОК группы сравнения. Только в этой группе обнаружена ЦОК в состоянии покоя, а статус остальных клеток, судя по отсутствию экспрессии этих генов, является неопределенным. В отличие от МИ-ЦОК, среди НО-ЦОК и ЦОК группы сравнения значительная часть клеток находятся в состоянии активации. В качестве других возможных метастаз-инициирующих ЦОК были рассмотрены атипичные опухолевые клетки с фенотипом CD45+EpCAM+, которые по данным предыдущих экспериментальных исследований описаны как клетки с повышенным метастатическим потенциалом. Количество нарушений в кодирующих областях (экзом) в атипичных CD45+EpCAM+ ЦОК варьировало от 62 до 92. Среди генов, несинонимичные нарушения которых были обнаружены в CD45+EpCAM+ клетках, большая часть кодирует белки, вовлеченные в связывание РНК (LBR, KTN1, SRP14 и др.) и взаимодействие с промоторами (RREB1, UBTF, THRAP3), а также составляющие семейство рецепторов “смерти” или фактора некроза опухолей (TNFRSF1A и TNFRSF1B). В атипичных ЦОК при сравнении с CD45+EpCAM- лейкоцитами было обнаружено 229 гипер- и 209 гипоэкспрессирующихся транскриптов (p<0,05). По функциональной принадлежности дифференциально-экспрессирующиеся гены относились к группе протеиновых киназ (KCNQ1, GSK3B, PRKAR1B и PRKAR2B), сумоилированию (PIAS3, HDAC7, PIAS4, RANBP2), кальций-зависимой активности фосфолипазы A2 (PLA2G4A и PLA2G12A) и др. Среди биологических процессов в CD45+EpCAM+ ЦОК были выражены работа TOLL-подобных рецепторов, позитивная регуляция сумоилирования белков и апоптоз. Среди сигнальных путей в CD45+EpCAM+ ЦОК были выражены NF-kappa B и MAPK сигналинги, транскрипционная дерегуляция при раке и различные сигналинги, связанные с конкретным типом опухоли (рак щитовидной железы, базалиомы). 3. Идентифицированы генетические нарушения и экспрессионные особенности в популяциях ЦОК, связанных с гематогенным метастазированием. Только в атипичных CD45+EpCAM+ ЦОК (по сравнению с CD45-EpCAM+ клетками) были обнаружены мутации в генах SRSF4, CDK5RAP2 и APOBR. Из них только для гена SRSF4 ранее была показана связь с пролиферацией и инвазией клеток молочной железы. Тем не менее, анализ функциональной значимости показал, что как мутация в гене SRSF4, так и нарушения в CDK5RAP2 и APOBR нейтральны в плане возможного влияния на активность кодируемых белков. Более того, согласно базе данных ExAC, частота обнаруженных генетических вариантов высокая (>0.6). Среди ТО10 генов, гиперэкспрессирующихся в атипичных CD45+EpCAM+ ЦОК, обнаружены ген фермента биосинтеза изопреноидов FDPS, ген, кодирующий ингибитор тирозинкиназы BTK IBTK, ген цинковой металлопептидазы ZMPSTE24 и др., среди гипоэкспрессирующихся – ген IREB2, кодирующий регулятор деградации мРНК, ген каспазы CASP4, ген RNH1, кодирующий ингибитор рибонуклеазы, и др. Только среди ТОП10 гипоэкспрессирующихся генов были найдены гены (PLCD1 и CASP4), вовлеченные, согласно литературным данным, в метастазирование злокачественных новообразований. Среди биологических процессов, выраженных в CD45+EpCAM+ клетках, была активность TOLL-подобных рецепторов. Согласно литературным данным, TOLL-подобные рецепторы ассоциированы с метастазированием опухолевых клеток. Среди сигнальных путей, выраженных в CD45+EpCAM+ клетках, были NF-kappa B и MAPK сигналинг. По данным литературы NF-kappa B сигналинг ассоциирован с воспалением и эпителиально-мезенхимальным переходом, критически важным для метастазирования злокачественных новообразований. Более того, сигнальный путь NF-kappa B непосредственно связан с мезенхимальным фенотипом ЦОК при РМЖ. Другой сигнальный путь, MAPK, также связан с метастазированием различных опухолей. Таким образом, высокий метастатический потенциал атипичных CD45+EpCAM+ клеток не предопределяется генетическими нарушениями, а связан с экспрессией определенных генов, кодирующих хорошо известные регуляторы метастазирования. 4. Проведена на экспрессионном уровне (мРНК и белки) характеристика молекулярно-генетического подтипа МИ и НО ЦОК. МИ-ЦОК и НО-ЦОК характеризуются выраженной интра- и межперсональной гетерогенностью по экспрессии маркеров, характеризующих молекулярно-генетический подтип РМЖ. Варианты фенотипов МИ-ЦОК и НО-ЦОК с экспрессией маркеров, характеризующих молекулярно-генетический подтип, не различаются между случаями с люминальным А и люминальным Б типами первичной опухоли. Сочетания фенотипов ЦОК как среди МИ-ЦОК, так и НО-ЦОК, свидетельствуют о заметном изменении рецепторного фенотипа в сравнении с молекулярно-генетическим подтипом первичной опухоли. Наиболее ярко это проявляется появлением трижды негативных МИ-ЦОК и НО-ЦОК при люминальных формах первичных карцином, и появлением рецептор-положительных ЦОК при первичном трижды негативном типе РМЖ. Обнаружение феномена конверсии молекулярного фенотипа МИ-ЦОК и НО-ЦОК относительно молекулярно-генетический подтипа первичной опухоли должно быть положено в основу оптимизации химиотерапии, направленной на ЦОК. МИ-ЦОК и НО-ЦОК различаются между собой по проявлениям межперсональной гетерогенности. Среди МИ-ЦОК характерно наличие случаев с присутствием только трижды негативных ЦОК. Уточнение фенотипических вариантов МИ-ЦОК и НО-ЦОК по их способности экспрессировать маркеры, определяющие молекулярно-генетический подтип опухолевых клеток РМЖ, позволит при выполнении запланированных этапов гранта и завершении проспективного исследования определить фенотипы МИ-ЦОК и НО-ЦОК, ответственных за развитие гематогенных метастазов. Помимо вышеуказанных работ и полученных результатов, в рамках настоящего проекта 30 ноября - 4 декабря 2020 г. проведена II научно-практическая онлайн школа “Секвенирование единичных клеток” (http://www.tnimc.ru/conferences/scs2020/). На школе были представлены лекции 16 ведущих специалистов в области клеточного анализа и секвенирования из Томского НИМЦ, МГУ им. М.В. Ломоносова, Университета ИТМО, Института Цитологии РАН, ООО "Интеллиджей Лабс", Институт иммунологии ФМБА России, Никитинского ботанического сада – ННЦ РАН, University of Copenhagen (Дания), Indian Institute of Science (Индия), ErasmusMC (Нидерланды) и Institut de Recherche en Cancérologie de Montpellier (Франция). В качестве слушателей приняли участие 51 участник. Школа состояла из трёх частей: 1. Три параллельных экспериментальных практикума по работе с единичными клетками и подготовке из них кДНК-библиотек с целью последующего анализа генной экспрессии; 2. Мини-конференция «Опыт секвенирования единичных клеток»; 3. Биоинформатический анализ данных секвенирования единичных клеток (лекции и практикум). Работа школы посвящена новой для РФ научной тематике секвенирования единичных клеток и широко освещена в СМИ разного уровня, включая министерский. В 2020 году было обеспечено софинансирование проекта в денежной форме в объеме 4000 тыс.руб. В качестве софинансирования использованы средства по договору НИОКР, заключенному с партнерами и предусматривающему выполнение работ по тематике проекта. В рамках п.2.3.27 Соглашения в 2020 году заключен трудовой договор с третьим молодым ученым, избранным по конкурсу. В отчетном году результаты работы были доложены на 11 научных конференциях различного уровня. По результатам работы опубликовано 19 научных публикаций, из них 9 – в журналах уровня Q1 Освещение результатов в средствах массовой информации: 1. http://www.tnimc.ru/novosti/nii-onkologii/uchenye-nii-onkologii-prinyali-uchastie-v-vi-peterburgskom-mezhdunarodnom-onkologicheskom-forume-bel/?sphrase_id=43498&clear_cache=Y 2. http://www.tnimc.ru/novosti/nii-onkologii/litsa-nashey-nauki-evgeniya-kaygorodova/ 3. http://www.tnimc.ru/novosti/nii-onkologii/unikalnaya-dlya-rossii-nauchno-prakticheskaya-shkola-po-sekvenirovaniyu-edinichnykh-kletok-vnov-proy/ 4. http://www.tnimc.ru/novosti/nii-onkologii/v-tomske-prokhodit-unikalnaya-dlya-rossii-nauchno-prakticheskaya-shkola-sekvenirovanie-edinichnykh-k/ 5. https://genetics-info.ru/events/unikalnaya-dlya-rossii-nauchno-prakticheskaya-shkola-po-sekvenirovaniyu-edinichnykh-kletok-vnov-proy/ 6. https://www.youtube.com/watch?v=W5Xuo5mJSrQ 7. https://tomsk.bezformata.com/listnews/tomske-proshla-shkola-po-sekvenirovaniyu/89515526/ 8. https://www.minobrnauki.gov.ru/press-center/news/?ELEMENT_ID=26105 9. http://www.tnimc.ru/novosti/nii-onkologii/v-tomske-proshla-shkola-po-sekvenirovaniyu-edinichnykh-kletok/ 10. http://www.sib-science.info/ru/news/unikalnaya-dlya-rossii-nauchno-prakticheskaya-27112020 11. http://www.sib-science.info/ru/news/v-tomske-proshla-shkola-po-sekvenirovaniyu-09122020

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Настоящий проект посвящен поиску метастаз-инициирующих (МИ) и нишеобразующих (НО) клеток рака молочной железы (НО), характеристике их молекулярного портрета и опухолеобразующих способностей на моделях in vitro и in vivo и разработке технологии для предсказания риска гематогенного метастазирования и алгоритма персонифицированного лечения с целью профилактики метастатической болезни. На третьем году проекта решены следующие задачи: 1. Сопоставлены наличие в МИ-ЦОК и НО-ЦОК с различными проявлениями стволовоподобных признаков и ЭМП, и выявлением в них маркеров жизнеспособности и апоптоза. В МИ-ЦОК с фенотипом CD45-EpCam+CD44-CD24-N-cadh+ и НО-ЦОК с фенотипом CD45-EpCam-CD44+CD24-N-cadh+ дополнительно исследована экспрессия СК7, ALDH1, CD133, 7-AAD и Annexin. Все 8 фенотипов изучаемых ЦОК по сочетанию экспрессии N-cadherin и эпителиальных маркеров имели гибридный фенотип ЭМП. Только среди МИ-ЦОК имелся фенотип без стволовых свойств. В этих клетках отсутствовали признаки апоптоза и гибели. В остальных фенотипах ЦОК экспрессировались в разном сочетании маркеры стволовости (CD133, ALDH и CD44+CD24-). Во всех фенотипах МИ-ЦОК и НО-ЦОК отсутствовали признаки гибели (экспрессии 7-AAD). Наличие признаков апоптоза не зависело от отсутствия или сочетания разного количества признаков стволовости. В наиболее часто встречавшихся фенотипах ЦОК (от 16% до 33%, один среди МИ и три среди НО) в 2% клеток присутствовали признаки апоптоза. Пациентки различались по наличию и сочетанию среди ЦОК МИ и НО клеток. В 33% случаев у пациенток среди выявленных ЦОК отсутствовали ЦОК обеих групп. У 19% обнаруживались только МИ ЦОК. У 31% -только НО ЦОК и среди них в 39% ЦОК были признаки апоптоза и у 17% выявлялись обе группы ЦОК. В проспективном наблюдении можно ожидать, что вероятность развития гематогенных метастазов будет сопряжена с их принадлежностью к одной из четырех по сочетанию МИ-ЦОК и НО-ЦОК и с долей метастаз-ассоциированных ЦОК с признаками апоптоза. 2. Оценена способность к пролиферации МИ и НО клеток карцином молочной железы при 2D и 3D культивировании. Среди ЦОК обнаруживались как пролиферирующие, так и не пролиферирующие клетки обеих групп. Причем частота встречаемости пролиферирующих МИ-ЦОК тип была в 2,7 меньше (р=0,0001), а НО-ЦОК в 2 раза меньше (р=0,0001), чем не пролиферирующих. Общей закономерностью явилась низкая пролиферативная активность рассматриваемых МИ и НО клеток в 2D и 3D культурах, как и в первичной опухоли. Однако, наблюдались различия пролиферативной активности типа МИ и НО опухолевых клеток. Частота обнаружения пролиферирующих клеток типа МИ возрастает в маммосферах, в то время как, наоборот, пролиферирующие НО клетки опухоли обнаруживаются реже в 3D культурах. 3. Проведена оценка участия МИ и НО клеток опухоли в формировании маммосфер в 3D культурах, с учетом их стволовых признаков и пролиферативной активности. Клеточный состав маммосфер был гетерогенным. Обнаруживались как МИ, так и НО клетки опухоли, включая клетки со стволовыми свойствами. Независимо от варианта экспрессии одного или нескольких маркеров стволовости, в маммосферах чаще встречаются стволовые не пролиферирующие МИ и НО клетки опухоли. 4. Определяли способность МИ и НО к миграции и инвазивному росту на моделях in vitro. Показано, что как МИ, так и НО клетки опухоли, демонстрируя гибридный фенотип ЭМП, независимо от наличия или отсутствия стволовых свойств, выявляемых посредством определения коэкспрессии трех маркеров стволовости, обладают миграционной и инвазивной способностью. 5. Исследованы проявления свойств стволовых клеток и наличие признаков ЭМП в МИ и НО клетках опухоли. Коэкспрессия EpCam и/или СК7/8 с N-cadherin в обеих популяциях клеток опухоли, ассоциированных с гематогенным метастазированием, свидетельствует о наличии у них гибридного фенотипа ЭМП. МИ клетки, которые характеризовались отсутствием экспрессии CD44, обладали другими признаками стволовости по экспрессии и коэкспрессии маркеров CD133 и ALDH1. Присутствовали и клетки без любых признаков стволовости. В НО клетках наряду с экспрессией CD44 также наблюдались все варианты коэкспрессии CD133 и ALDH1. Описанные фенотипические признаки МИ и НО клеток наблюдались в первичных опухолях и обнаруживались как при 2D, так и при 3D культивировании. 6. Туморогенные свойства МИ и НО опухолевых клеток проявились при гетеротопической ксенотрансплантации бестимусным мышам. Отмечен рост ксенографтов с разной динамикой увеличения их объема. Во всех случаях использование проточной цитометрии для исследования взвеси опухолевых клеток удаленных ксенографтов выявило наличие МИ-ОК и НО-ОК. 7. Эффективность ксенотрансплантации подтверждена не только развитием опухоли в месте инокуляции, но и метастазированием. В трех случаях в макроскопически не измененных паховых лимфатических узлах обнаружены лимфогенные метастазы. Наиболее ярко метастаз-инициирующие свойства МИ опухолевых клеток проявилась при гематогенном метастазировании. Количество МИ клеток с фенотипом CD45-EpCam+CK7/8+CD44-CD24-N-cadh+ увеличилось с 2,53 кл/мл в первичной опухоли до 27,42 кл/мл в гематогенном метастазе, количество CD45-EpCam+CK7/8-CD44-CD24-N-cadh+ с 1,44 кл/мл до 27,39 кл/мл в гематогенном метастазе. Суммарное количество этих двух фенотипов МИ клеток возросло в метастазе в 14 раз. Клетки обоих фенотипов не имели признаков стволовости по трем исследуемым маркерам этого состояния. 8. Гистологическое строение ксенографтов характеризовалось резким преобладанием соединительнотканной стромы над опухолевой паренхимой. Последняя представлена гнездами и железистоподобными структурами, которые сформированы клетками с умеренным полиморфизмом, экспрессирующими полицитокератины (клон АЕ1/АЕ3) – маркер клеток эпителиальной природы. Наличие лимфогенных метастазов подтверждено обнаружением гнезд опухолевых клеток, подобных ксенографту, расположенных среди лимфоидной ткани. В отличие от ксенографтов и лимфогенных метастазов, гематогенный метастаз, в котором, как отмечено выше, 54% опухолевых элементов представлены МИ клетками, имел морфологию низко дифференцированной диффузной карциномы с резким преобладанием паренхимы над стромой. 9. В гетерогенной популяции опухолевых клеток ксенографтов всегда присутствовали МИ и НО клетки. Среди МИ клеток с базовым фенотипом CD45-EpCam+CK7/8+/-CD44-CD24-N-cadh+ встречались как фенотип без стволовых признаков, так и все варианты экспрессии маркеров стволовости CD133 и ALDH1. НО были представлены в ксенографте клетками с базовым фенотипом CD45-EpCam-CK7/8+CD44+CD24-N-cadh+, в которых наблюдались все варианты коэкспрессии CD44, CD133 и ALDH (дважды и трижды позитивные стволовые клетки). МИ и НО клетки опухоли имели гибридный фенотип ЭМП. 10. Обнаружены специфические особенности мутационного ландшафта метастаз-инициирующих и нише-образующих ЦОК больных РМЖ. В частности, в метастаз-инициирующих клетках нарушения преимущественно встречались в генах, вовлеченных в фокальную адгезию, тогда как в нише-образующих клетках – в генах различных опухоль-ассоциированных сигнальных путей. 11. Увеличение выборки с 4 до 20 пациентов, позволило уточнить ранее обнаруженные транскрипционные признаки в МИ-ЦОК и НО-ЦОК. Были валидированы данные, о экспрессионном профиле метастаз-инициирующих и нишеобразующих клеток, полученные в 2020 году. В качестве метастаз-инициирующих рассмотрены клетки с фенотипом CD45-GP9-EPCAM+CD44-CD24-VIM+ (6 клеток), с фенотипом CD45-GP9-KRT8+CD44-CD24-VIM+ (12 клеток) и фенотипом CD45-GP9-KRT18+CD44-CD24-VIM+ (15 клеток). В качестве НО-ЦОК рассмотрены клетки с фенотипом CD45-GP9-Epcam-KRT18+CD44+CD24-VIM+ (3 клетки) и с фенотипом CD45-GP9-EPCAM-KRT8+CD44+CD24-VIM+ (4 клетки). Экспрессионные профили МИ-ЦОК и НО-ЦОК сравнивались с ЦОК, имеющими фенотип CD45-GP9-EPCAM+CD44+CD24-VIM+ (2 клетки), CD45-GP9-KRT8+CD44+CD24-VIM+ (4 клетки) и CD45-GP9-KRT18+CD44+CD24-VIM+ (4 клетки). Экспрессионный профиль ЦОК подтвердил гибридный фенотип ЕМТ МИ-ЦОК и НО-ЦОК. В отличие от НО-ЦОК и клеток групп сравнения экспрессия генов MMP14 и ITGA2 свидетельствует о способности МИ-ЦОК к мезенхимному типу инвазивного роста. Оценка отношения экспрессии MAPK14 и MAPK1 подтвердила, что МИ-ЦОК скорее находятся в состоянии «покоя». Исследована частота экспрессии лиганда и рецептора TGF-β – индуктора процессов, обуславливающих метастазирование. В 10 из 26 МИ-ЦОК обнаружена экспрессия ген TGFB1 и его рецептора TGFBR2. Нами показано, что экспрессия TGF-β ассоциирована с чувствительностью люминальных типов РМЖ к терапии тамоксифеном. Из этого следует, что часть клона МИ опухолевых клеток может быть элиминирована посредством антигормональной терапии. Таким образом, метастатический потенциал МИ-ЦОК обусловлен гибридным фенотипом ЭМП, способностью к мезенхимальному типу инвазии и состоянием покоя, с которым у пациенток с РМЖ связывают развитие отсроченных гематогенных метастазов. 12. В рамках настоящего проекта 23- 27 августа 2021 г. проведена III научно-практическая школа “Секвенирование единичных клеток” (https://www.tnimc.ru/conferences/scs2021/). На школе были представлены лекции 20 ведущих специалистов в области клеточного анализа и секвенирования из Томского НИМЦ, МГУ им. М.В. Ломоносова, Университета ИТМО, Института биологии гена РАН, Казанского федерального университета, НМИЦ ДГОИ им. Дмитрия Рогачева, ННИИ ЭОиБМТ ПИМУ, Rockefeller University (США), Harvard Medical School (США), German Cancer Research Cente (Германия), Princeton University (США), I.R.C.C.S. Ospedale San Raffaele (Италия), Medical university of Vienna (Австрия), University of Freiburg (Германия), Karolinska Institute (Швеция) и 12 специалистов российских и зарубежных компаний (Skygen, Qiagen, BD Biosciences, Mission Bio, Биокоммерц, Eppendorf, Lacopa, Illumina, Биоген-Аналитика, Аламед, Хеликон, ГенЭра). В качестве слушателей приняли участие 41 участник в очном формате, 70 в формате онлайн, всего 99 молодых учёных в возрасте до 35 лет. 13. По результатам работы в отчетном году опубликовано 11 научных публикаций, из них 7 – в журналах уровня Q1 14. Всего найдено 90 цитирований публикаций членов научного коллектива в научных журналах, индексируемых в международной базе данных «Сеть науки» (Web of Science Core Collection) в отчетном году 15. Материалы были доложены на 18 научных конференциях за рубежом и в России. 16. Освещение результатов в средствах массовой информации: адреса сайтов https://www.minobrnauki.gov.ru/press-center/news/?ELEMENT_ID=35562 https://vk.com/tnimc?w=wall-167915299_11281 https://www.facebook.com/minobrnaukigov/photos/a.1810098689090577/3530443347056094 https://www.akm.ru/press/tomskie_uchenye_sozdayut_test_sistemu_dlya_lovli_tsirkuliruyushchikh_opukholevykh_kletok/ https://www.rscf.ru/news/presidential-program/test-sistema-dlya-lovli-opukholevykh-kletok/ http://www.sib-science.info/ru/news/tomskie-18062021 http://www.tnimc.ru/novosti/nii-onkologii/tomskie-uchenye-sozdayut-test-sistemu-dlya-lovli-tsirkuliruyushchikh-opukholevykh-kletok/ https://www.instagram.com/p/CQXTMtxnBrK/ http://www.tnimc.ru/novosti/nii-onkologii/rabota-v-komande-put-k-nauchnym-otkrytiyam/ https://www.tnimc.ru/novosti/nii-onkologii/izuchenie-otdelnykh-kletok-klyuch-k-ponimaniyu-mekhanizmov-razvitiya-razlichnykh-zabolevaniy/ https://www.tnimc.ru/novosti/nii-onkologii/analiz-edinichnykh-kletok-klyuch-k-ponimaniyu-kletochnykh-protsessov-i-mekhanizmov-razvitiya-zabolev/

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
В 2022 году для подтверждения потенций популяций ЦОК, ассоциированных с гематогенным метастазированием, к формированию метастазов и возможности выявления новых метастаз-ассоциированных популяций клеток были проведены исследования на ортотопической модели ксенотрансплантата. В первичной опухоли были выявлены клетки с фенотипом, ассоциированным с метастазированием, доля которых в ксенографте достоверно возрастала по сравнению с первичной опухолью. Несмотря на то, что доля таких клеток не доминировала в клеточном составе ксенографта, подтвердились ранее сделанные наблюдения, об участии этих клеток в развитии опухоли. Наряду с этим обнаружено, что другая метастаз-ассоциированная популяция (МА), выявленная среди ЦОК (МИ/НО-ЦОК) (метастаз-инициирующие/нишеобразующие) продемонстрировала высокую способность к адаптации в условиях ксенотрансплантации. Этот результат демонстрирует не только высокую адаптивность этих клеток к условиям трансплантации, но и их появление в ксенотрансплантате de novo за счет пластичности других опухолевых клеток. Именно эти качества новых МА-клеток обуславливают их высокую степень ассоциированности с метастазированием. Следует подчеркнуть фенотипические признаки этих клеток, а именно сочетание отсутствия экспрессии как mEpCAM, так и icEpCAM при наличии признаков эпителиальности (panCK) с наличием признаков стволовости по экспрессии ALDH. При этом клетки не демонстрировали поздних проявлений EMT и не пролиферировали. Разработана новая медицинская технология, для определения риска развития гематогенных метастазов у больных раком молочной железы с помощью оценки метастаз-инициирующих и метастаз-инициирующих/нишеобразующих циркулирующих опухолевых клеток. Создана тест-система, предназначенная для выявления и определения в крови количества циркулирующих опухолевых клеток (ЦОК), ассоциированных с гематогенным метастазированием, у больных раком молочной железы. Если в венозной крови пациента до оперативного лечения детектируются метастаз-инициирующие и метастаз-инициирующие/нишеобразующие циркулирующие опухолевые клетки в количестве выше порогового значения, то у такого пациента прогнозируется высокий риск развития гематогенных метастазов. Разработан прототип тест-системы, позволяющей детектировать в крови пациента популяции ЦОК, ассоциированных с гематогенным метастазированием, методом проточной цитофлуориметрии Медицинская технология предназначена для врачей-онкологов. Она утверждена на заседании Ученого Совета Томского НИМЦ. Рекомендуемый уровень использования: лечебно-профилактические учреждения онкологического профиля. Для формирования индивидуального портрета лекарственной чувствительности/резистентности патогенетически значимых популяций опухолевых клеток для дальнейшей персонифицированной мультиадресной терапии пациентов было проведено глубокое РНК-секвенирование с длинными прочтениями для одновременной детекции нарушений геномного и транскриптомного профилей. Для решения поставленной задачи из периферической крови больных РМЖ методом FACS сортинга были выделены МИ/НО-ЦОК и лейкоциты, используемые в качестве объекта сравнения при исследовании мутационного ландшафта опухолевых клеток, ассоциированных с гематогенным метастазированием. Популяция опухолевых клеток с фенотипом идентичным МИ-ЦОК (МИ-ОК) была выделена из первичной опухоли. С помощью полнотранскриптомного профилирования было проведено исследование геномных и транскрипционных особенностей МИ/НО клеток крови и МИ клеток опухоли), ассоциированных с гематогенным метастазированием (6 пациенток). Проведенный анализ мутационных и экспрессионных особенностей двух типов метастаз-ассоциированных клеток МИ-ЦОК и МИ/НО-ЦОК позволил установить выраженные различия данных типов клеток по спектру чувствительности/резистентности к препаратам, используемым в лекарственном лечении рака молочной железы. Общая мутационная нагрузка МА-клеток значительно превышает таковую в общем пуле, включая как мутации, дифференциально обнаруживаемые в МА клетках, так и количество дифференциально экспрессируемых генов. МИ/НО-ЦОК отличала значительная мутационная нагрузка (в среднем 172 мутации), в то время как в МИ-ЦОК обнаруживалось в среднем 67 мутаций, а в оставшемся пуле опухолевых клеток - 66. При выборе алгоритма наиболее эффективного воздействия на МИ-ЦОК и МИ/НО-ЦОК следует ориентироваться на характер дифференциальных мутационных и экспрессионных признаков чувствительности/резистентности этих клеток и молекулярно-биологический подтип совокупности ЦОК. Особенностью МИ клеток является чувствительность к тамоксифену независимо от молекулярно-биологического подтипа РМЖ. Полученные данные позволили обосновать и создать прототип тест-системы предназначенной для определения чувствительности/резистентности к химио-, таргетной терапии популяций МИ клеток и МИ/НО клеток, ассоциированных с гематогенным метастазированием за счет выявления у данных клеток мутаций и определения экспрессии таргетных генов (панель маркёров) у пациентов с раком молочной железы. Разработан прототип новой медицинской технологии и впоследствии услуги, в основе которой лежит предсказание эффективности противоопухолевого лечения и назначения мультиадресной молекулярно-ориентированной терапии с помощью оценки генетических нарушений в МИ и МИ/НО клетках опухоли. Если в венозной крови пациента до оперативного лечения детектируются МИ и МИ/НО циркулирующие опухолевые клетки в количестве выше порогового значения, рекомендуется оценка мутационного профиля определенной группы генов. Полученные данные легли в основу создания новых медицинских технологий создания алгоритма назначения мультиадресной молекулярно-ориентированной терапии. Технология мультиадресной молекулярно-ориентированной химио- и таргетной терапии больных раком молочной железы базируется на клинических рекомендациях RUSSCO (Тюляндин С. А. и соавт. Практические рекомендации RUSSCO #3s2, 2022 (том 12). 155–197) по лекарственному лечению инвазивного рака молочной железы с модификацией в соответствии с определяемым тест-системой №1 риском гематогенного метастазирования и в соответствии с определяемой тест-системой №2 чувствительностью/резистентностью каждой из популяций ЦОК, ассоциированных с гематогенным метастазированием. Таким образом, в рамках проекта впервые созданы специализированные тест-системы для детекции циркулирующих опухолевых клеток, ответственных за развитие гематогенных метастазов, и определения в них чувствительности/резистентности к химио- и таргетной терапии РМЖ. Впервые сформирован инновационный подход для стратификации пациентов на группы с высокой и низкой вероятностью развития гематогенных метастазов на основании детекции циркулирующих метастаз-инициирующих и метастаз-инициирующих/нишеобразующих клеток, ассоциированных с отдаленным метастазированием, и их специфических мишеней. Впервые предложена технология мультиадресной молекулярно-ориентированной химио- и таргетной терапии, основным назначением которой является выбор оптимальной терапии для первоначального воздействия на МА ЦОК, а также диссеминированные в органах опухолевые клетки, которые включают в себя и МА клетки. В августе 2022 г. проведена III научно-практическая школа “Секвенирование единичных клеток” (https://www.tnimc.ru/conferences/scs2021/). Полученные результаты были представлены на 13 международных и Российских конференциях, освещались в СМИ разного уровня. Подана заявка на патент. Зарегистрирован Ноу-Хау. Опубликовано 13 публикаций, из них 5 - достоинства Q1 https://www.tnimc.ru/novosti/nii-onkologii/v-tomske-proydet-iv-nauchno-prakticheskaya-shkola-analiz-otdelnykh-kletok-/?sphrase_id=400209 https://www.tnimc.ru/novosti/nii-onkologii/iv-nauchno-prakticheskaya-shkola-analiz-otdelnykh-kletok-startuet-v-ponedelnik-22-avgusta/?sphrase_id=400209