Аннотация результатов, полученных в 2019 году
В 2019 году в рамках выполнения проекта были получены новые, актуальные результаты, раскрывающие механизмы регуляции обновления и репарации тканей человека. Мультипотентные стромальные клетки (МСК) являются необходимым компонентом, обусловливающим поддержание постоянного состава тканей в норме и его восстановление после повреждения. Однако, как механизмы их участия, так и факторы, регулирующие активность этих клеток, остаются мало изученными. В течение первого года выполнения работ по проекту мы исследовали механизмы регуляции дифференцировки МСК под действием гормонов и нейромедиаторов; вклад компонентов секретома МСК в регуляцию фиброза тканей; а также механизмы участия МСК в формировании ниши тканеспецифичных стволовых клеток и ее восстановлении после повреждения. В рамках исследования влияния гормонов на функциональную активность МСК Нами было показано, что кратковременное однократное добавление норадреналина подавляет адипогенную дифференцировку МСК-ЖТ что выражается в снижении экспрессии не только мастер-гена адипогенеза PPAR -гамма, но и маркера дифференцированных белых адипоцитов адипонектина. С помощью агонистов изоформ адренорецепторов и ингибиторов внутриклеточных сигнальных каскадов нам удалось установить, что подавляющее адипоцитарную дифференцировку влияние норадреналина опосредовано активацией бета-адренорецепторов и аденилатциклазы, поскольку агонист бета-адренорецепторов добутамин вызывал подавление адипоцитарной дифференцировки, а инкубация клеток с норадреналином в присутствии ингибитора аденилатциклазы SQ22536 отменяет подавляющее действие норадреналина. Необходимо отметить, что этот путь сигнализации также оказался вовлечен и в контроль дифференцировки МСК-ЖТ в бежевые адипоциты, поскольку мы наблюдали подавление экспрессии белка-разобщителя дыхательной цепи UCP1 в ответ на добутамин, а добавление норадреналина в присутствии ингибитора аденилатциклазы приводило к резкому увеличению экспрессии UCP-1. Ранее мы показали, что при действии на МСК норадреналина происходит гетерологическая сенситизация альфа1А-адренорецепторов, которая приводит к повышению чувствительности клеток к норадреналину. В МСК, подвергшихся гетерологической сенситизации, в ответ на повторное действие норадреналина происходит активация сигнальных каскадов альфа1-адренорецепторов в присутствии подавленного цАМФ-зависимого пути внутриклеточной сигнализации от бета-адренорецепторов. В связи с этим мы предположили, что повышение экспрессии UCP1 может происходить при двукратном действии на МСК норадреналина. Для этого мы обрабатывали МСК норадреналином либо однократно, либо двукратно в течение одного часа с интервалом в 6 часов, а затем направляли клетки в адипоцитарную дифференцировку в течение 7 дней. Оказалось, двукратная обработка клеток норадреналином существенно повышает уровень экспрессии UCP1, в отличие от однократной обработки, которая не изменяет его уровень экспрессии. Данный эффект воспроизводится, если сначала клетки обработать агонистом бета1 и бета2-адренорецепторов добутамином, а затем, через 6 часов – агонистом альфа1-адренорецепторов фенилэфрином. Эти данные указывают на то, что фенилэфрин действует только при подавлении бета-адренорецепторов. Таким образом, стимуляция альфа1-адренорецепторов на фоне подавленной активности цАМФ-зависимого сигнального каскада приводит к переключению дифференцировочной активности МСК в сторону бежевых адипоцитов. С помощью разработанной нами методики длительного отслеживания индивидуальных клеток в культуре, нам удалось показать, что клетки, отвечающие на норадреналин повышением концентрации Ca2+ в цитоплазме, не способны к накоплению крупных липидных капель, свидетельствующих о дифференцировке этих клеток в белые адипоциты. При этом, ответившие на норадреналин клетки могли накапливать мелкие жировые капли, что может быть признаком формирования бежевых адипоцитов. Таким образом, мы показали новый механизм регуляции направления дифференцировки МСК в сторону бежевых адипоцитов. Наши результаты указывают на функциональную гетерогенность МСК и необходимость использования для изучения таких популяций подходов, позволяющих регистрировать события в индивидуальных клетках. В проекте впервые продемонстрирована гетерогенность МСК в отношении чувствительности к инсулину. Так, с помощью проточной цитофлуориметрии мы обнаружили, что лишь 2,1% МСК-ЖТ несут на своей поверхности рецептор к инсулину. Однако большинство (86,8%) клеток содержит этот рецептор во внутриклеточных депо. Эти результаты позволяют предположить, что несмотря на принципиальное наличие инсулинового рецептора для регуляции жировой ткани, в большинстве культивируемых МСК-ЖТ, лишь небольшой процент клеток является постоянно чувствительным к инсулину. Чтобы проверить данное предположение, мы простимулировали клетки 100нМ инсулина в течение 15 минут и проанализировали в МСК появление активной формы внутриклеточного эффектора инсулинового сигнального каскада – протеинкиназы Akt. Мы обнаружили, что в ответ на стимуляцию клеток инсулином в культуре появляются единичные клетки, в ядрах которых видны гранулы, специфично окрашиваемые антителами против фосфо-Akt. В рамках проекта впервые был изучен ответ МСК-ЖТ и остеобластов на ПТГ с помощью регистрации повышения концентрации внутриклеточного Са2+ в одиночных клетках. Было выявлено 5 вариантов ответов клеток на ПТГ, включая постепенное нарастание концентрации Са2+ в цитоплазме, однократные «всплески» и осцилляции кальция. Наши данные позволили впервые объяснить феномен «двухфазного кальциевого ответа» на ПТГ. Полученные в рамках этого проекта результаты свидетельствуют о том, что каждой клетке присущ 1 вариант ответа, а наблюдаемая ранее двухфазность является результатом содержания в пробе клеток, гетерогенных в отношении ответа на ПТГ. При анализе влияния ПТГ на функциональную активность МСК мы обнаружили, что кратковременное добавление этого гормона перед индукцией остеогенной дифференцировки стимулирует дифференцировку МСК в остеоциты, однако подавляет дифференцировку уже коммитированных в этом направлении остеобластов. Мы обнаружили, что добавление селективного ингибитора фосфолипазы C U73122 не оказывает влияния на проостеогенный эффект ПТГ на МСК, в то время как селективный ингибитор аденилатциклазы SQ22536 практически полностью снимал проостеогенное действие ПТГ. Эти данные свидетельствуют о том, что стимулирующее влияние ПТГ на остеогенную дифференцировку МСК реализуется через активацию сигнальной оси Gs/аденилатциклаза/протеинкиназа А. Используя иммуноферментный анализ содержания регулятора остеокластов, RANKL, в кондиционированной среде МСК, мы обнаружили, что ПТГ значительно снижает секрецию этого фактора. Данный эффект, в отличие от действия ПТГ на дифференцировку МСК в остеоциты, не зависел от активации сигнальной оси Gs/аденилатциклаза/протеинкиназа А. В проекте впервые были получены оригинальные данные относительно продукции МСК ключевых секретируемых компонентов, опосредующих способность этих клеток регулировать развитие фиброза. Так, нами был проведен анализ про- и антифиброзных медиаторов, входящих в секретом МСК, включая регуляторные микроРНК, секретируемые клетками преимущественно в составе внеклеточных везикул, а также исследованы изменения секретома МСК, происходящие под действием профиброгенных стимулов. Для оценки тканеспецифичности противофиброзных свойств МСК мы сравнивали содержание профиброгенных (FGF2, SPARC) и антифиброзных (HGF) медиаторов в секретоме эМСК и МСКЖТ методом ИФА. Предполагалось, что секретом эМСК будет обладать более выраженными антифиброзными свойствами, поскольку эндометрий способен регенерировать без образования рубца после различного рода повреждений. Полученные результаты свидетельствуют о наличии тканеспецифичных особенностей состава секретома МСК из разных тканей. Вопреки нашим предположениям оказалось, что секретом МСКЖТ, содержит больше антифиброзных и меньше профиброгенных медиаторов, чем секретом эМСК. Эти данные указывают на необходимость анализ не только белковых факторов, но и других медиаторов, продуцируемых МСК, включая микроРНК. Для исследования изменения секреторной активности МСК в условиях, стимулирующих фиброз нами была разработана модель профиброгенного микроокружения, состоящая в культивировании МСК на внеклеточном матриксе, продуцированном фибробластами человека, которые растили в высокой плотности в составе клеточных пластов с добавлением TGFb и аскорбиновой кислоты для повышения эффективности отложения профибротического пфВКМ. Смоделированные таким образом профиброгенные условия приводили к дифференцировке дермальных фибробластов в миофибробласты, а также появлению в популяции МСК клеток с миофибробластным фенотипом. Моделирование профиброзного микроокружения с помощью культивирования МСК на пфВКМ и в присутствии TGFb приводило к наибольшему повышению экспрессии генов коллагена I типа, EDA-FN и aSMA в клетках. Анализ содержания микроРНК, связанных с фиброзом, с помощью таргетного ПЦР анализа показал, что под воздействием профиброгенных стимулов в МСК более чем в 1,5 раза повышается 49 миРНК, а также на 50% и более снижается экспрессия 3 микроРНК . У них было выявлено с помощью биоинформатического анализа 22104 мишени, 9795 из них уникальные. Кластеризация мишеней показала, что значительная их часть связана с продукцией и ремоделированием ВКМ, морфогенезом, регуляцией внутриклеточных сигнальных путей, вовлеченных в эпителиально-мезенхимальный переход, дифференцировкой клеток, клеточного цикла, а также катаболическими процессами в клетках. В целом, полученные результаты позволяют предположить высокую степень гетерогенности МСК в отношении ответа на профиброгенные стимулы, что указывает на необходимость анализа этих изменений на уровне одиночных клеток, запланированного на следующем этапе проекта. На основании полученных данных можно также предположить, что профиль миРНК, секретируемых МСК в составе внеклеточных везикул, значительно изменяется в профиброгенных условиях и может определять участие этих клеток в регуляции фиброза, однако это требует экспериментального подтверждения, которое будет проведено на следующем этапе работы. Учитывая важную роль растворимых секретируемых МСК факторов в реализации антифибротических эффектов этих клеток, мы проанализировали изменение содержания нескольких ключевых про- и антифиброзных белковых медиаторов в кондиционированной среде МСК, культивированных в различных условиях. Было показано, что под воздействием профиброгенных стимулов секреторный профиль МСК скоординировано меняется: клетки меньше секретируют HGF, для которого показано антифибротическое действие, а уровень секреции одного из важнейших секреторных регуляторов TGFb-сигнальных путей и фиброза белка SPARC и представителя секретируемых компонентов фибротического ВКМ белка фибулина-2 существенно повышается. При этом продукция клетками таких факторов, как FGF2, IL-8 IL-10 практически не менялась. В проекте первые установлен механизм регуляции пластичности с участием GPI-заякоренного рецептора урокиназы (uPAR). Мы установили, что нокаут гена uPAR методом CRISPR/Cas9 в клетках нейробластомы приводит к изменению профиля экспресии микроРНК, включая miR-34c-5p, miR-141-3р, miR-28a-5p, miR-291-3p и miR-295-5p. Используя биоинформатический анализ мишеней обнаруженных микроРНК, мы выявили кластеры генов-кандидатов, ответственных за ЭМП (Snai1, Zeb2), индукцию апоптоза (Bcl6, р21), пролиферацию (Atf1), адгезию и миграцию клеток (CD93, αv интегрин), а также участвующих в биогенезе экзосом (TSPAN2, TSPAN11, Rab11b, Rab21). Полученные нами результаты впервые свидетельствуют о том, что урокиназная система не только стимулирует пролиферацию самих опухолевых клеток и опосредует их метастазирование, но также может влиять на опухолевую строму за счет регуляции секреции экзосом и входящих в их состав микроРНК. В рамках выполнения проекта нами выявлена способность МСК восстанавливать сперматогенез на модели двустороннего абдоминального крипторхизма и предложен принципиально новый подход для направленной модуляции ниши ССК и восстановления фертильности, основанный на применении секретома МСК. Впервые в прямом сравнительном эксперименте нами показано, что при локальном введении как секретом МСК, так и сами МСК демонстрируют схожие эффекты на восстановление сперматогенеза. Согласно полученным результатам, секретом МСК обладает комплексным действием на нишу ССК, стимулируя ее восстановление после повреждения. Эффекты секретома МСК могут быть объяснены влиянием непосредственно на клетки сперматогенного эпителия, однако учитывая выявленную динамику восстановления сперматогенеза, наиболее вероятным представляется реализация действия компонентов секретома на уровне поддерживающих клеток ниши ССК – клеток Лейдига и клеток Сертоли, восстановление количества и функций которых, в свою очередь, приводит к регенерации ниши. Полученные результаты расширяют понимание возможных механизмов участия МСК в восстановлении ниш стволовых клеток, а также служат основой для создания бесклеточных препаратов на основе секретома МСК для лечения мужского бесплодия. С помощью биоинформатического анализа нами было впервые установлено, что в сперматогенной нише могут быть выделены клетки, обогащенные генами, представленными в МСК, которые по составу транскриптома наиболее близки к кластерам, обогащенными генами, характерными для клеток Лейдига и отличаются от кластеров, в которых представлены гены сперматогенного эпителия. Однако выделение МСК из ткани яичек в культуру с помощью характеристики по известным «универсальным» поверхностным маркерам представляется сложной задачей, поскольку они экспрессируются в субпопуляциях клеток, обогащенных как клетками Лейдига, так и клетками из внутриканальцевой зоны. Полученные результаты позволили существенно расширить наши представления о механизмах и процессах, определяющих чувствительность стволовых клеток к гормонам и нейромедиаторам; о роли МСК в формировании фиброза и регуляции ниши сперматогониальной стволовой клетки. Эти данные в будущем позволят разработать новые подходы к диагностике и лечению социально значимых заболеваний.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
В 2020 году в рамках выполнения проекта получены новые, актуальные результаты, раскрывающие механизмы регуляции обновления и репарации тканей человека, в частности, относительно участия мультипотентных стромальных клеток (МСК) в поддержании постоянного состава тканей в норме и его восстановлении после повреждения. Полученные на первом этапе проекта результаты позволили предположить высокую степень гетерогенности МСК в отношении ответа на действие различных гормонов и профиброгенных стимулов, а также индукции адипогенной дифференцировки. Для того чтобы выявить механизмы, обусловливающие такую гетерогенность, в 2020 году мы проанализировали наличие фенотипически и функционально отличающихся клеточных субпопуляций с помощью оценки транскриптома единичных клеток (scRNAseq) с помощью платформы 10х Genomics (США). Мы впервые обнаружили, что при индукции адипогенной дифференцировки, а также при культивировании в профиброгенных условиях, происходит разделение популяции МСК на несколько функционально различных субпопуляций. Анализ дифференциальной экспрессии генов в выявленных субпопуляциях показал, в частности, переключение экспрессии изоформ аденилат-циклаз при адипогенной дифференцировке. До адипогенной дифференцировки одной из основных форм аденилат-циклазы в МСК является изоформа ADCY7, то есть, аденилат-циклаза, ингибируемая кальцием. При этом, после 4 дней дифференцировки происходит полное исчезновение данной изоформы из клеток. Одновременно с этим в клетках происходит накопление другой изоформы аденилат-циклазы ADCY1 – чьей отличительной чертой, наоборот, является активация под действием ионов кальция при участии кальмодулина. Учитывая определяющее значение активности аденилат-циклазы и cAMP в активации ранних генов адипогенеза, данное изменение позволяет предположить ранее не описанное участие кальциевых сигналов в регуляции адипогенной дифференцировки. С помощью введения в МСК генетически-кодируемого биосенсора PKA-Spark мы впервые получили результаты относительно гетерогенности этих клеток в отношении ответа на гормоны посредством РКА/сАМР-зависимой внутриклеточной сигнализации. При этом была оценена не только доля отвечающих на тот или иной гормон клеток в популяции, но и установлена временная динамика наблюдаемых клеточных ответов. Это позволило существенно расширить существующие представления о молекулярных механизмах ответа клеток на гормональные стимулы. Данные о гетерогенности МСК в отношении РКА/сАМР-зависимой внутриклеточной сигнализации хорошо согласуются с результатами оценки распределения мРНК изоформ аденилат-циклаз, полученными с помощью scRNAseq. С помощью scRNAseq мы также установили, что в профибротических условиях происходит разделение клеток на 2 две субпопуляции, различающиеся по экспрессии гладкомышечного актина (aSMA). Согласно проведенному анализу дифференциальной экспрессии, в aSMA+ клетках повышено содержание мРНК белков, участвующих в сократительной активности, а также белков внеклеточного матрикса (различные типы коллагенов, фибронектин), ингибиторов протеаз (PAI-1), белка, связывающего подобный инсулину фактор роста (insulin like growth factor binding protein 3, IGFBP3) и основного фактора роста фибробластов (FGF2). Интересно, что в этой субпопуляции также значимо повышена экспрессия станиокальцина (STC2), который секретируется МСК в ответ на профибротические стимулы и способен подавлять фиброгенез. В aSMA—субпопуляции клеток повышена экспрессия генов специфических белков внеклеточного матрикса (dermatopontin, fibulin 1) и факторов, участвующих в его ремоделировании (матриксные металлопротеиназы, урокиназа), фактора роста, полученного из пигментного эпителия (PEDF), а также белков, участвующих в секреции внеклеточных везикул. Таким образом, в 2020 году проведен субпопуляционный анализ МСК, построенный на основании данных секвенирования транскриптома одиночных клеток. Выделение и анализ клеточных субпопуляций, различающихся по ответам на индукцию адипоцитарной дифференцировки либо профибротические сигналы, будут проведены на следующих этапах проекта. Особенностью ответа МСК на гормоны, в частности, норадреналин, является развитие гетерологической сенситизации. В 2020 году с помощью разработанной нами методики наблюдения за адипогенной дифференцировкой на уровне одиночных клеток, мы впервые обнаружили, что большинство клеток, отвечающих на норадреналин повышением уровня внутриклеточного кальция, не накапливают ни адипонектин, ключевой маркер белых адипоцитов, ни UCP1, маркер бежевых адипоцитов. При этом происходит гормон-зависимое повышение содержания UCP1 в клетках, не отвечающих на норадреналин повышением концентрации внутриклеточного кальция. Таким образом, мы установили, что, несмотря на то, что повторная обработка МСК норадреналином (условия гетерологической сенситизации) стимулирует дифференцировку этих клеток в сторону бежевых адипоцитов, клетки, отвечающие на норадреналин повышением уровня внутриклеточного кальция, не приобретают фенотип «бежевых» адипоцитов. Мы предполагаем, что в ответ на норадреналин клетки, подвергающиеся гетерологической сенситизации, индуцируют бежевую дифференцировку в других клетках популяции МСК, причем такое действие зависит от секреторной активности отвечающих на норадреналин клеток. Мы также показали, что гетерологическая сенситизация приводит к усилению гликолитической активности и максимальной емкости гликолиза в МСК дифференцирующихся в адипоцитарном направлении, что хорошо соотносится с наблюдением о том, что гетерологическая сенситизация способствует дифференцировке МСК в «бежевые» адипоциты. С помощью иммуноферментного анализа мы установили, что гетерологическая сенситизация в дифференцирующихся МСК приводит к снижению продукции таких адипокинов как лептин и адипонектин в 1,5 раза. В 2020 году нами проведен углубленный анализ секретома МСК с целью выявления ключевых медиаторов, определяющих их участие в регуляции процессов фиброза. С помощью протеомного анализа отдельных фракций секретома мы установили, что исследованные фракции имеют специфичный состав. На основе полученных данных можно предположить, какие белки опосредуют антифибротические свойства фракций внеклеточных везикул и растворимых белков секретома МСК человека. В дальнейшей работе планируется верифицировать антифибротическое действие выявленных молекул. Добавление фракций секретома в виде растворимых факторов или внеклеточных везикул вызывало уменьшение встраивания аSMA в стресс-фибриллы на модели дифференцировки фибробластов в миофибробласты. С использованием таргетного ПЦР анализа мы показали, что при воздействии профиброгенных стимулов в секретируемых МСК внеклеточных везикулах происходят специфические изменения содержания фиброз-ассоциированных микроРНК. Под воздействием профиброгенных стимулов МСК секретируют внеклеточные везикулы, в которых более чем в 1,5 раза повышается представленность 30 миРНК и снижается представленность 10 миРНК. Биоинформатический анализ мишеней дифференциально экспрессирующихся миРНК показал, что значительная их часть входит в кластеры генов внутриклеточных сигнальных путей, вовлеченных в эпителиально-мезенхимальный переход, дифференцировку клеток, регуляцию клеточного цикла, адгезии клеток, процессинга белков в эндоплазматическом ретикулуме и эндоцитоза. В 2020 году мы также получили данные относительно механизмов заживления без рубца на модели циклического обновления эндометрия. Мы установили, что МСК эндометрия не обладают устойчивостью к воздействию фиброгенного стимула в виде TGF-b1. Однако степень со-локализации коллагена I и ED-A фибронектина в культурах МСК эндометрия была выше, чем в МСК дермы и жировой ткани и указывает на существование тканеспецифичных отличий организации внеклеточного матрикса МСК эндометрия. Мы показали, что при заживлении эндометрия образуются растворимые факторы, препятствующие переходу МСК в миофибробласты. В 2020 году с помощью разработанной нами модели ниши стромального типа, основанной на способности МСК к спонтанному формированию многослойных клеточных пластов. Для таких пластов характерна выраженная анизотропия с разделением на очаги высокой и низкой плотности клеток. С помощью иммунохимического окрашивания и иммуноблоттинга мы установили, что для таких пластов характерно увеличение синтеза ED-A фибронектина, который играет важную роль в поддержании окружения в нише, формируемой при участии МСК. Это сопровождалось активацией FAK-сигнальной системы и уменьшением активности сигнальной системы Yap-TaZ в силу более механически мягкого окружения для клеток. Проведенный нами мультиплексный ИФА показал, что МСК в составе клеточного пласта значительно усиливают свою секреторную функцию по сравнению с монослоем, причем это касалось всех исследованных нами белков – начиная от фоллистатина, опосредующего стабилизацию стволовых клеток в нише и заканчивая факторами мобилизации стволовых клеток (PDGF-BB, G-CSF). При этом данные ИФА были нормированы не на общий уровень белка, а на содержание ДНК, т.е. с учетом более высокой плотности клеток в составе клеточного пласта по сравнению с монослоем МСК. Мы также показали, что формирование очагов высокой плотности привело к повышению эффективности остео- и хондрогенной дифференцировок МСК, которые в эмбриогенезе и при регенерации зависят от степени агрегации клеток и плотности контактов между ними. Используя метод лазерной микродиссекции, мы разделили участки клеточного пласта высокой и низкой плотности и проанализировали их транскриптом. Нами впервые было показано, что в зонах пласта высокой плотности значимо повышена экспрессия генов, связанных с Rho-ГТФазными сигнальными путями, для которых известна роль в конденсации мезенхимных клеток и самоорганизации стромальных клеток, а также способность регулировать ответ клеток на механические факторы окружения. На данном этапе проекта был получен децеллюляризованный внеклеточный матрикс (дВКМ) из пласта МСК и охарактеризованы его структура и состав основных белков ВКМ. Иммуноцитохимический анализ позволил продемонстрировать сохранение укладки основных белков ВКМ – фибронектина, ламинина и коллагена I типа после децеллюляризации, а также выявили везикуло-подобные структуры в его составе. Мы обнаружили, что дВКМ, продуцируемый МСК, способен ускорять индуцированную дифференцировку клеток во всех канонических направлениях уже на ранних сроках индукции (4 день) по сравнению с пластиком и покрытиями на основе отдельных рекомбинантных белков ВКМ - фибронектина, ламинина и коллагена I типа. При мультипараметрическом иммуногистохимическом анализе срезов яичек в норме и при повреждении мы показали, что в нише сперматогониальной стволовой клетки в интерстиции как в норме, так и при повреждении выявляются CD73+ клетки, часть которых также экспрессирует маркеры клеток Лейдига (LHR). Таким образом, согласно полученным результатам, МСК в семенниках могут быть локализованы в интерстициальном компартменте, периваскулярно и вместе с клетками Лейдига. Нам удалось выделить из интерстиция яичка клетки, похожие по свойствам на МСК, охарактеризовать их фенотип и функциональную активность. Для получения стабильно делящейся на длительном промежутке времени клеточной линии выделенные из семенников МСК иммортализовали с помощью введения гена теломеразы. Полученные клетки не экспрессируют маркеры клеток Лейдига LHR и CYP11A1, но экспрессируют маркер клеток Сертоли Sox9. Подавляющее большинство клеток выделенной популяции экспрессирует поверхностные маркеры МСК, включая CD90, CD73 и PDGFRb, а также способны дифференцироваться в остео-, хондро- и адипо-направлениях. Таким образом, в отчетном году было установлено участие МСК в регуляции ниши сперматогониальных стволовых клеток. Были выделены и охарактеризованы МСК из тканей семенников крыс. На модели полученных культур клеток семенников на последующих этапах проекта будут исследованы особенности их взаимодействия в тканях яичка, что позволит установить механизмы взаимного влияния клеток микроокружения, включая МСК и сами стволовые клетки в нише.

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
В 2021 году в рамках выполнения проекта нами исследованы механизмы участия мультипотентных стромальных клеток (МСК) в поддержании состава тканей в норме и его восстановлении после повреждения. На предыдущих этапах выполнения проекта с помощью анализа транскриптома одиночных клеток мы выявили субпопуляции МСК, отличающиеся друг друга функциональной активностью. В частности, мы показали, что при культивировании в профибротических условиях только часть МСК дифференцируется в миофибробласты, экспрессирующие αSMA. Динамика изменений транскриптома в остальных клетках указывает на другие направления дифференцировки и сохранение αSMA- субпопуляции МСК с пока не исследованными свойствами. В 2021 году мы провели более подробный анализ субпопуляций МСК, по-разному отвечающих на профибротические стимулы. Так, в результате биоинформатического анализа нами был создан список дифференциально экспрессирующихся генов, кодирующих мембранные белки, из которого нами был выбран PDGFRα, как потенциальный маркер αSMA- субпопуляции МСК, не отвечающих дифференцировкой в миофибробласты на профибротические стимулы. С помощью окрашивания клеток антителами против PDGFRα и флуоресцентно-активируемой сортировки клеток в потоке мы выделили PDGFRα+ и PDGFRα- субпопуляции МСК и сравнили их способность к контракции коллагенового диска, а также экспрессию в них маркерных белков миофибробластов, αSMA и коллагена I типа. Мы подтвердили, что PDGFRα+ МСК обладают сниженной сократительной способностью и содержат меньше αSMA и коллагена I. Поскольку существенная роль в регуляции дифференцировки клеток принадлежит регуляторным РНК, мы разработали комплексный подход, позволяющий выявить некодирующие РНК, присущие различным субпопуляциям МСК. Во-первых, мы проанализировали представленность подкласса пре-микроРНК (pre-miRNA), а также длинных некодирующих РНК (lncRNA) в транскриптомах одиночных МСК с помощью модификации работы алгоритма Cell Ranger. Во-вторых, мы применили «обратный поиск» дифференциально экспрессирующихся микроРНК, состоящий в анализе мРНК-мишеней, различающихся по экспрессии в разных субпопуляциях МСК. С помощью пакета Seurat нами были получены перечни мРНК, преимущественно обнаруженных либо в про-, либо в антифибротических кластерах. С помощью сервиса mirnet.ca были получены списки микроРНК, для которых эти гены являются мишенями. Для определения того, какие из найденных микроРНК могут влиять на статус клеточной популяции, мы установили, какие микроРНК встречаются одновременно в случаях, когда экспрессия некоторых генов повышена в кластерах с низкой экспрессией aSMA и снижена в кластерах с высокой экспрессией aSMA, и наоборот. Для этого был написан специальный код на языке Python. Обработанный список микроРНК был повторно проанализирован с помощью базы данных mirnet.ca для поиска таргетных генов для микроРНК. Далее проводился анализ представленности функциональных групп генов (GO enrichment analysis) с помощью веб-сервиса GProfiler, в качестве переменной для кластеризации использовался словарь биологических процессов (GO biological process). Из итогового списка были отобраны те микроРНК, которые имели хотя бы 80 мишеней. Была изучена представленность этих микроРНК в МСК, культивируемых в профибротическом микроокружении. Оказалось, что 5 микроРНК, экспрессия генов-мишеней которых различается в кластерах МСК, по-разному отвечающих на профибротические стимулы, представлены как в МСК, так и в их экзосомах: hsa-let-7b-5p, hsa-let-7a-5p, hsa-miR-22-3p, hsa-miR-27b-3p, hsa-miR-29a-3p. Мишенями этих микроРНК являются, в том числе, коллагены нескольких типов и, компоненты сигнального пути TGF-beta, что указывает на то, что они могут быть вовлечены в реализацию антифибротических эффектов αSMA- субпопуляции МСК в профибротическом микроокружении. Для того чтобы выявить субпопуляции, определяющие способность жировой ткани к самоподдержанию, мы сравнили популяционный состав МСК жировой ткани здорового донора и пациента с инсулинорезистентностью, т.е. состоянием, связанным с нарушением адипогенной дифференцировки. Системная кластеризация разделила массив на 11 субпопуляций. Функциональная характеризация этих субпопуляций при помощи String и g:Profiler показала что состояние инсулинорезистентности связано с существенным уменьшением субпопуляции клеток, которые экспрессируют гены, связанные с внутриклеточной сигнализацией, активированной PDGF, а также с продукцией внеклеточного матрикса. Напротив, у инсулинорезистентного донора возникают новые кластеры, включая субпопуляцию, отличающуюся высокой экспрессией генов, которые связаны с цитокиновой сигнализацией, регуляцией ответа на стресс и контролем программируемой гибели клеток; субпопуляцию, которая экспрессирует гены ассоциированные с регуляцией миграции клеток и роста кровеносных сосудов, а также группу клеток, которые экспрессируют гены ответа на стресс и гипоксию. Для того чтобы установить, что обусловливает различия ответов на паратиреоидный гормон (ПТГ) МСК из разных тканей, в 2021 году мы сопоставили состав субпопуляций в МСК жировой ткани из области живота и МСК жировой ткани, расположенной около колена, а также экспрессию рецептора ПТГ в этих клетках. Интеграция массивов данных методом реципрокного анализа главных компонент показала совпадение всех кластеров между двумя образцами, т.е. отсутствие субпопуляций, уникальных для того или иного образца жировой ткани. Таким образом, отличие сигнальных и функциональных ответов МСК на действие ПТГ не обусловлено присутствием в культуре клеток уникальных супопуляций. С помощью иммунофлуоресцентного анализа и проточной цитометрии мы показали, что большая часть МСК и надкостницы, и жировых тканей экспрессирует на своей поверхности рецептор ПТГ. Ингибиторы аденилатциклазы и фосфолипазы С приводили к изменению репертуара клеточных ответов на ПТГ в культурах, полученных из разных тканей. Мы показали, что в МСК ключевым сигнальным каскадом, ответственным за проостеогенное действие ПТГ, является сAMP-зависимое плавное повышение внутриклеточного уровня Са2+. Вызываемые фосфолипазой С Са2+ осцилляции, в свою очередь, опосредуют антиостеогенный эффект ПТГ на МСК. Эти данные позволили нам установить, что различия в ответах МСК из разных организменных депо на воздействие ПТГ обусловлены различиями организации сигнальных каскадов в них. В рамках исследования механизмов влияния секретома МСК на предотвращение повреждения и стимуляцию восстановления тканей, в 2021 году нами был охарактеризован состав фракций секретома МСК жировой ткани с использованием масс-спектрометрического анализа. Мы обнаружили в общей сложности более 600 белков, среди которых были белки, в три и более раз отличающиеся по представленности в исследуемых фракциях секретома МСК. Результаты масс-спектрометрического анализа были верифицированы методом вестерн-блоттинга и подтвердили результаты количественного сравнения отдельных белков между фракциями секретома МСК. В отработанных нами in vitro моделях наибольшим антифиброзным действием обладала фракция внеклеточных везикул (ВВ), а наименьшим – фракция кондиционированной среды (КС). Поэтому белки, содержание которых во фракции ВВ было выше, чем в КС, мы рассматривали как препятствующие фиброзу. Белки, содержание которых во фракции КС было выше, чем в ВВ, напротив, были рассмотрены как препятствующие антифиброзному влиянию МСК. На основании полученных данных мы выдвинули гипотезы механизмов, по которым белковые компоненты фракций секретома могут опосредовать антифиброзное действие МСК (в частности, препятствовать дифференцировке фибробластов в миофибробласты), в основном за счет модуляции провоспалительных сигнальных каскадов, либо влияния на сигнальный путь TGFbeta. В отчетном году мы показали, что 10-кратная концентрация секретома человеческого МСК и его комбинация с нейротрофическим фактором головного мозга (BDNF) обеспечивала лучшую выживаемость и неврологический исход крыс в течение 14 дней после внутримозгового кровоизлияния по сравнению с отрицательными (без лечения) и положительными (BDNF) контрольные группы. Мы обнаружили, что аллогенный секретом МСК крысы был более эффективным, чем ксеногенный секретом МСК человека на модели внутримозгового кровоизлияния у крыс: он уменьшал объем поражения и способствовал превосходной выживаемости и неврологическому исходу (10.3390/pharmaceutics13122031). В рамках исследования молекулярных механизмов влияния компонентов ниши стромального типа на коммитирование и дифференцировку МСК с помощью ингибиторного анализа мы обнаружили ключевую роль активности сигнального пути Rho/ROCK в формировании гетерогенности плотности в КП, которая связана с необходимостью активности ROCK для миграции и, в меньшей степени, пролиферации клеток. Проведен углубленный биоинформатический анализ паттерна дифференциальной экспрессии генов в МСК, формирующих гетерогенные условия ниши стромального типа. Обнаружены характерные черты сниженной активости транскрипционного фактора SREBP. Проведен ингибиторный анализ в условиях дифференцировки в направлениях в разной степени зависящих от наличия ниши стромального типа: хондрогенном и адипогенном. Установлена роль сигнального пути Rho/ROCK в определении судьбы клеток при их коммитировании и подготовке к дифференцировке в нише стромального типа. В частности, установлен механизм Rho/ROCK-зависимого подавления актвности ключевого для адипогенной дифференцировки транскрипционного фактора SREBP (10.3390/biomedicines9091192). Для выяснения молекулярных механизмов действия на МСК растворимых факторов, препятствующих фиброзу, мы провели скрининг состава и эффектов сыворотки менструального отделяемого на эти клетки. Мы также установили наиболее потенциально важные сигнальные пути, активируемые в стромальных клетках под действием сыворотки менструального отделяемого. Наиболее вероятным с точки зрения эффектов является активация сигнального пути STAT3 под влиянием провоспалительных цитокинов. Также на данном этапе завершено РНК-секвенирование транскриптома стромальных клеток эндометрия, культивированных в присутствии сыворотки менструального отделяемого или сыворотки периферической крови. В рамках исследования роли отдельных сигнальных молекул, секретируемых МСК, в регуляции сперматогенной ниши, в 2021 году мы показали, что секретом МСК стимулирует выработку тестостерона клетками Лейдига. На животной модели повреждения сперматогенной ниши с помощью введения доксорубицина мы обнаружили, что в течение 5 недель после разового введения секретома МСК не происходит полноценного восстановления морфологии семенных канальцев. В то же время отдельные животные, которым вводили секретом МСК, демонстрировали увеличение общей фракции сперматозоидов и подвижной фракции сперматозоидов. Удаление внеклеточных везикул и GDNF из секретома МСК не вносило существенного вклада в восстановление сперматогенеза. Однако, удаление VEGF из секретома МСК критически влияло на восстановление сперматогенеза. На данном этапе проекта было показано, что при повреждении сперматогенной ниши возникают множественные нарушения гематотестикулярного барьера (ГТБ), которые могут быть восстановлены в течение 3 месяцев после введения секретома МСК в поврежденные яички. Таким образом, результаты исследований, проводимых в рамках настоящего проекта, позволяют расширить существующие представления о роли мультипотентных стромальных клеток в поддержании состава тканей в норме и его восстановлении после повреждения.

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
На завершающем этапе проекта нами были получены результаты, позволившие установить механизмы участия МСК в поддержании состава тканей и их восстановлении после повреждения. Окончания симпатических нейронов являются необходимым компонентом микроокружения МСК, в то же время ряд патологических состояний, связанных с нарушением обновления состава тканей, сопровождается гиперактивацией симпатической нервной системы. Для того чтобы проанализировать влияние норадреналина на функциональную активность МСК, в данном проекте мы разработали модель симпатического овердрайва. Чтобы оценить влияние такого воздействия норадреналина на МСК мы использовали метод секвенирования РНК в одиночных клетках (10x Genomics, США). Мы обнаружили, что популяция МСК может быть разделена на 6 кластеров, различающихся по функциям, включая кластер пролиферирующих клеток, кластер клеток, активно продуцирующих внеклеточный матрикс, кластер клеток, отличающихся повышенной миграционной и сократительной активностью, а также кластеры клеток, отличающихся синтетической активностью. Воздействие норадреналина приводит к увеличению доли кластеров клеток с повышенной сократимостью, продуцирующих внеклеточный матрикс и синтетических. Мы впервые обнаружили, что увеличение количества клеток в перечисленных кластерах происходит благодаря переходу клеток в состояние, представляющее собой «точку ветвления». Из этого состояния МСК затем направляются в кластер пролиферирующих клеток, либо приобретают фенотип клеток, продуцирующих внеклеточный матрикс, либо - фенотип сократимых клеток. На модели сокращения коллагеновых дисков мы подтвердили, что воздействие норадреналина повышает сократительную активность МСК. Нами выявлен новый молекулярный механизм, по которому норадреналин может влиять на адипоцитарную дифференцировку МСК. На модели индукции побурения эпидидимальной жировой ткани мыши мы установили, что локальная симпатэктомия предотвращает формирование факультативного бурого жира, которое выражается в появлении очагов адипоцитов, содержащих мелкие жировые капли, и увеличении содержания белка UCP1. Таким образом, мы установили, что для дифференцировки МСК в сторону термогенных адипоцитов необходима последовательная активация бета3- и альфа1а- адренорецепторов. На данном этапе нами расшифрованы механизмы внутриклеточной сигнализации, опосредующие влияние паратиреоидного гормона (ПТГ) на остеогенную дифференцировку МСК. С помощью анализа повышения концентрации Ca2+ в цитоплазме одиночных клеток мы установили, что переключение путей внутриклеточной сигнализации, активированных ПТГ может происходить в одних и тех же клетках. Так, МСК, ответившие на ПТГ цАМФ-зависимым плавным приростом кальция, при повторном добавлении гормона в присутствии ингибитора цАМФ-зависимой протеинкиназы (ПКА) демонстрировали кальциевые осцилляции. Переключение пути внутриклеточной сигнализации определяет выбор МСК между про- и антиостеогенным ответом на ПТГ. Так, активация кальциевых осцилляций в ответ на ПТГ сопряжена с подавлением остеогенной дифференцировки МСК как надкостницы, так и жировой ткани. При воздействии ПТГ в МСК происходит изменение экспрессии генов аденилатциклазы 3, аденилатциклазы 6 и аденилатциклазы 8, что позволяет рассматривать указанные белки, как потенциальные медиаторы эффекта ПТГ на дифференцировку МСК. Анализ транскриптома одиночных клеток показал, что при воздействии ПТГ на МСК подкожной жировой ткани увеличивается доля клеток с повышенной экспрессией генов клеточной адгезии. В МСК как надкостницы, так и жировой ткани под действием ПТГ возрастает экспрессия проостеогенного транскрипционного фактора TCF7. ПТГ также вызывает в МСК жировой ткани повышение экспрессии гена проостеогенного транскрипционного фактора DLX2, сопряженное с одновременным подавлением экспрессии антиостеогенного гена TWIST2. В МСК надкостницы ПТГ подавляет экспрессию гена костного сиалопротеина IBSP. Эти данные указывают на то, что ПТГ ингибирует остеогенную дифференцировку МСК надкостницы, подавляя конечные этапы этого процесса. Выявленные различия в экспрессии генов белков остеогенеза могут обусловливать противоположное действие ПТГ на остеогенную дифференцировку МСК надкостницы и подкожной жировой ткани. В отчетном периоде нами разработана индуцибельная система экспрессии Cre-VP64/lox71 для контролируемой экспрессии нескольких генов, включая факторы роста и редактор генома CRISPR/Cas9. Данная система обеспечила высокий уровень экспрессии целевых генов после индукции в сочетании с низким базальным уровнем экспрессии. На заключительном этапе были проведены работы по уточнению фенотипа и функциональных свойств МСК, по-разному отвечающих на профибротические стимулы и разделенных по экспрессии PDGFRa. Установлено, что МСК, экспрессирующие PDGFRa, отличаются подавленной сократительной активностью. Инвазивная способность PDGFRa+ клеток также снижена по сравнению с PDGFRa-. Таким образом, мы впервые описали субпопуляции МСК человека с транскрипционным профилем, определяющим их участие в регуляции процессов фиброза. С помощью масс-спектрометрии нами проведен протеомный анализ фракций секретома МСК. Мы обнаружили, что отдельные фракции секретома, препятствующие развитию фиброза, которые содержат внеклеточные везикулы (ВВ) либо растворимые факторы (РФ), обогащены белками, взаимодействующими с сигнальными путями TGFβ1, Notch и Wnt а также IGF. Эти белки регулируют дифференцировку фибробластов и, следовательно, могут опосредовать антифибротическое действие фракций ВВ и РФ секретома МСК. Вместе с тем, не разделенная на фракции кондиционированная среда МСК (КС) обогащена относительно отдельных фракций ВВ и РФ белками, которые способны активировать провоспалительный транскрипционный фактор NF-kB. Эти белки могут препятствовать действию других компонентов и таким образом нивелировать антифибротическомй эффект секретома МСК. Кроме того, на модели фиброза in vivo мы обнаружили, что антифиброзный эффект МСК может зависеть от экспрессии рецептора урокиназы. Для того чтобы выявить механизмы, препятствующие формированию фиброза, мы сравнили ответ МСК эндометрия (эМСК) и дермы (дМСК) на растворимые факторы сыворотки менструального отделяемого (СМО) и периферической крови (СПК). Секвенирование библиотек кДНК, построенных на образцах мРНК этих клеток, показало, что в ответ на факторы СМО в МСК происходит активация путей внутриклеточной сигнализации интерлейкинов-10, 4 и 13 а также активация экспрессии рецепторов хемокинов и продукция матриксных металлопротеиназ. Таким образом, компоненты СМО подавляют воспалительный ответ МСК, а также способствуют миграции этих клеток. Анализ тканеспецифичных особенностей эМСК позволил выявить 25 генов, экспрессия которых значительно возрастала в эМСК под действием факторы СМО, но не изменялась или понижалась в дМСК. Среди них были обнаружены гены BMP6, AMTN и EFNA1, кодирующие лиганды, значимые для морфогенеза. Изучение их вклада в механизмы восстановления эндометрия может стать основой для последующего выбора терапевтических мишеней и создания нового класса препаратов, обладающих противофиброзным действием. Мы показали, что после индукции повреждения сперматогенеза с помощью доксорубицина способность секретома стромальных клеток стимулировать секрецию тестостерона клетками Лейдига снижается. Мы обнаружили тканеспецифичность этих эффектов, так, ответ клеток Лейдига мыши на действие секретома МСК жировой ткани мыши ниже, чем на действие секретома стромальных клеток яичка мыши. На модели повреждения сперматогенной ниши у трансгенных мышей с ВДКН показано нормальное гистологическое строение сперматогенной ниши. Однако масса семенников и придатков у таких животных была снижена, а показатели спермограммы – нарушены. Полученные результаты позволили существенно расширить наши представления о механизмах и процессах, определяющих чувствительность МСК к гормонам и нейромедиаторам; о роли этих клеток в формировании ниши сперматогониальной стволовой клетки и регуляции развития фиброза тканей.