Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Роль молекулярных шаперонов в прогрессии опухоли достаточно полно отражена в современной научной литературе и одним из основных мотивов публикаций является влияние шаперонов, в частности БТШ70, на реакцию раковых клеток на терапевтические средства. В большинстве опухолевых клеток уровень БТШ70 повышен, причем не только внутриклеточного белка, но и шаперона, вынесенного на поверхность раковой клетки. Существует много инструментов для определения количеств БТШ70, но большинство из них не способны измерить весь пул или отдельные формы молекул шаперона. В своей работе мы сконструировали тест-систему, позволяющую определить полное количество БТШ70 в клетках и в межклеточном пространстве. В разработке находятся тесты для выявления доли только активного шаперона и того, который находится на поверхности и опухолевых клеток. Эти инструменты после их испытаний и патентования могут служить в качестве дополнительных тестов для определения того или иного типа терапевтического вмешательства, включая иммунотерапию. Следует еще раз подчеркнуть, что ввиду повышенных количеств БТШ70 в раковых клетках эффективность химиотерапии снижается, и поэтому исследователи приходят к выводу о том, что увеличить ее можно за счет снижения уровня шаперона в клетке, то есть применения ингибитора синтеза БТШ70. Один из таких ингибиторов был найден нами и представляет собой соединение из группы карденолидов, получившее рабочее название CL-43. Как мы ранее показали, применение CL-43 в сочетании с известными противоопухолевыми препаратами, этопозидом и цисплатином, значительно повышает их активность по отношению к опухолям разного происхождения. В работе над данным проектом мы с помощью литературных и биоинформатических данных разработали еще одну комбинацию, включающую указанный ингибитор экспрессии БТШ70 и активатор фермента каспаза 3, который запускает программу апоптоза в раковых клетках. Комбинация была испытана на клетках карциномы трех разных типов и, как показывают данные, обладает синергетическим эффектом. Иными словами, торможение роста опухолевой популяции и доля погибающих вследствие применения комбинации клеток значительно выше, чем действие препаратов по отдельности или их суммарный эффект.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Основная цель проекта состоит в применении ингибиторов молекулярных шаперонов и, соответственно, клеточного протеостаза, в качестве средств адъювантной противоопухолевой терапии. В ходе создания проекта мы опирались на данные многих групп, в том числе и нашей, о том, что клетки со сниженной активностью шаперон Hsp70 более чувствительны к применяемым в онкологической клинике лекарствам. Поэтому важной задачей этапа было сконструировать модельные системы, позволяющие провести массовый анализ эффективности комбинаций c лекарствами 1-ой линии. Такие системы были созданы, и сейчас в нашем распоряжении имеются линии клеток карциномы легкого с нокдауном HSF1, фактора контролирующего синтез всех белков теплового шока, включая основные шапероны Hsp70 и Hsp90, и с нокдауном Hsp70. Как мы и предполагали, клетки полученных сублиний отличаются сниженными ростовыми характеристиками, и, главное, оказались более чувствительными к действию базового противоопухолевого лекарства, цисплатина, и инициатора апоптоза РАС-1. Таким образом, разработанная платформа может служить двум задачам предстоящих исследований, (1) быть контролем для подбора комбинаций типа ингибитор шаперонов – лекарство 1-ой линии и (2) стать основой для анализа изменений в физиологии раковой клетки, утратившей систему защиты, основанную на шапероне Hsp70. Еще одно достижение этапа 2020г. состоит в реализации нашего стремления к получению клинических образцов опухолей. Работа длилась на протяжении почти всего этапа, и в итоге мы получили 4 линии клеток опухоли кишечника с разными клиническими оценками туморогенности. Проведенный анализ с помощью комплекса методов, включая вестерн блоттинг и специально разработанные тест-системы ИФА, позволили нам определить количество продуцируемых этими клетками Hsp70. В ходе данного анализа выяснилось, что уровень Hsp70 очень высок, что, во-первых, подтверждает данные большинства групп, и, во-вторых, указывает на возможность использования клеток в качестве моделей опухоли определенного типа с разной туморогенностью. Мы рассчитываем использовать полученные линии на дальнейших этапах выполнения проекта и, возможно, заменить ими установленные линии с целью приближения к более клинически значимым клеточным мишеням. Идея «расшатывания» системы протеостаза опухолевой клетки для ее сенсибилизации получила свое воплощение во время написания нами обзора для журнала Cells; собранные в нем материалы позволяют предположить, что система шаперонов и механизм аутофагии связаны функционально и физически. Другими словами, действие каких-либо факторов на один из них вызывает реакцию (чаще в обратном направлении) другого. Мы провели несколько пилотных опытов и по предварительным данным ингибитор фактора транскрипции всех генов HSP, карденолид CL-43 в сочетании с ингибитором аутофагии хлорокином оказывает на клетки рака кишечника, полученных от пациентов, практически синергетический эффект. Мысль об подавлении активности Hsp70 нашла свое воплощение в работе, которая была предпринята с целью показать, насколько эффективны могут быть шаперонные ингибиторы в борьбе с реакцией раковых клеток на гипоксию. Имитируя гипоксию с помощью обработки клеток глиобластомы крысы С6 хлоридом кобальта, мы наблюдали при высоких его концентрациях денатурацию и агрегацию одного из ключевых ферментов гликолиза, глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (GAPDH), приводящих в результате к гибели клеток. До указанной концентрации клетки оставались жизнеспособными, как мы выяснили за счет того, что Hsp70 связывал поврежденные молекулы GAPDH и не давал им агрегировать. Чтобы шаперон высвободил GAPDH, мы использовали ингибитор Hsp70, производное колхицина АЕАС и показали, что вещество не только разрушает комплекс GAPDH-Hsp70, но и вызывает повышение уровня гибели клеток С6 в клеточной и животной моделях гипоксии. Наконец в 2020г. была завершена работа по анализу влияния клеток микроокружения на туморогенный потенциал опухолевых клеток. Согласно данным этого исследования клетки карциномы человека 3-ех линий, нормальные и с нокдауном Hsp70 продуцировали в среду разное количество Hsp70, который способен вызывать переход моноцитов ТНР-1 в фенотип макрофагов про-опухолевого фенотипа М2 типа. Открытием для нас стал тот факт, что после инкубации с моноцит-подобными клетками опухолевые клетки становились нечувствительными к противоопухолевой терапии.

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Целью настоящего проекта является разработка схем противоопухолевой терапии с применением ингибиторов клеточного протеостаза и проверка эффективности сочетанной терапии на животных моделях. В 2021 году мы продолжали поиск наиболее удачных комбинаций на клеточных моделях, используя для этой цели как клетки из коллекций, так и клетки, полученные от пациентов петербургских онкологических клиник. Работая с клетками в культуре необходимо помнить, что в опухоли in vivo опухолевые клетки не одиноки, они поддерживают свою жизнеспособность благодаря наличию микроокружения (МО), которое состоит из стромальных и иммунных клеток, белков, ростовых факторов, молекул РНК, везикулярных частиц, микроэлементов и других компонентов. Некоторые клетки МО, например, макрофаги, при контакте с опухолью утрачивают свой потенциал и становятся про-опухолевыми, и с функции защиты организма от опухолевой агрессии переключаются на предохранение раковых клеток. Ранее, в работе над этим грантом, мы показали, что контакт с моноцитами или моноцит-подобными клетками приводит к повышению резистентности опухолевых клеток к действию противоопухолевых препаратов. Результаты работы этого года убедили нас в том, что подобный эффект характерен для разных клеточных линий, в том числе для тех, которые, получены от онкологических пациентов, и резистентность обусловлена активацией HSF1 и повышенной экспрессией молекулярных шаперонов после контакта. Это говорит о том, что наши исследования, направленные на применение ингибиторов белков теплового шока в схемах противоопухолевой терапии, идут в правильном направлении. Опыты с применением клеток с генетически подавленным HSF1 или Hsp70 убедили нас в том, что понижение содержания этих белков в опухолевых клетках снижают резистентность последних к действию противоопухолевых препаратов, но нокдаун HSF1 вызывал более выраженный эффект, чем нокдаун Hsp70. Подтверждение этому предположению пришло из опытов с клетками карциномы легких А549, где для сочетанной терапии мы использовали выявленный нами ранее ингибитор HSF1 кардиналид CL-43 и ингибитор шаперонной активности Hsp70, JG98. Оба препарата усилили действие этопозида и оксалиплатина, но применение CL-43 выявило бОльшую эффективность. CL-43 оказался также эффективен в подавлении эпителиально-мезенхималного перехода клеток колоректального рака в условиях гипергликемии, которая характерна для больных диабетом, и считается фактором, стимулирующим метастазирование. В этом году мы также расширили список опухолевых клеток от пациентов, получив от коллег из НМИЦ онкологии им.Н.Н.Петрова образцы клеток остеосарком, устойчивых к химиотерапии. Получив 3D культуры этих клеток, мы выяснили, что CL-43 усиливает действие оксалиплатина, размеры сфероидов были меньше, а количество мертвых клеток больше, чем при монотерапии. С помощью оборудования ОИ мы закончили исследование эффекта экзосом, содержащих Hsp70, на опухолевый рост клеток колоректального рака СТ-26, несущих генетическую конструкцию iRFP720-Luc. Мы выяснили, что в основе задержки опухолевого роста лежит активация противоопухолевого специфического иммунитета, основанного на активации CD8+ лимфоцитов, что подтверждалось тестами CTL с использованием фракции CD8+ лимфоцитов из животных-опухоленосителей и соответствующим изменением цитокинового профиля. Для того, чтобы сделать наши заключения более убедительными, мы повторили эксперимент с клетками СТ-26 и экзосомами, содержащими Hsp70, на иммунодефицитных мышах Balb/c nude, у которых дефектен именно CD8+ иммунитет, и не получили ни подавления опухолевого роста, ни изменения цитокинового профиля, и цитотоксическая сила лимфоцитов тотальной фракции не отличалась у лимфоцитов мышей из трех экспериментальных групп. В последние несколько лет мы связываем эффекты ингибиторов функции Hsp70 с тем, что эти малые молекулы способны нарушать связи шаперона с другими белками, также выполняющими цитопротекторную или про-опухолевую функцию. Поэтому в течение этапа 2021г в дополнение к описанным работам мы провели исследование действия полученного нами ранее ингибитора Hsp70, производного колхицина АЕАС, в опухолевых клетках, подвергаемых действию естественного стрессового фактора, гипоксии. Было установлено, при гипоксическом стрессе в клетках глиобластомы крысы С6 накапливаются агрегаты гликолитического фермента ГАФД, что в свою очередь ведет к гибели клеток. В этой ситуации повышение количества Hsp70 в клетках спасает их от гибели благодаря связыванию агрегатов ГАФД, а, главное, диссоцирующее комплекс Hsp70-ГАФД действие АЕАС приводило к снижению темпов роста опухоли в клеточной и животной моделях глиобластомы.

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
В течение отчетного этапа нам удалось получить результаты, из которых наиболее впечатляющим является вывод о том, что раковые клетки при инкубации с моноцитами-макрофагами приобретают более устойчивый к терапии фенотип. Иными словами, клетки микроокружения опухоли создают благоприятные условия для опухолевой прогрессии, и это явление было продемонстрировано в экспериментах на клетках рака кишечника, и частично подтверждено на клетках остеосаркомы, также полученных от онкологических больных. Существенным открытием стало повышение активности фактора реакции на протеотоксический стресс HSF1 и соответственное увеличение уровня шаперона Hsp70 в клетках рака кишечника вследствие их контакта с моноцитами-макрофагами. На основании этих данных, полученных с помощью высокотехнологичных методов, можно сделать вывод о том, что помимо таких эффектов, как синтез цитокинов, хемокинов и факторов, необходимых для выживания и прогрессии опухоли, клетки стромы могут, будучи даже в мизерных количествах, запускать в опухолевых клетках механизмы протеостаза, в частности через активацию синтеза БТШ70. Таким образом, была подтверждена релевантность шаперонных ингибиторов для терапии высокоустойчивых типов рака. На отчетном этапе мы также подвели итоги экспериментов по исследованию эффектов препарата CL-43 на клетки разного генеза и в различных моделях опухолевого роста. Надо отметить, что ингибитор в комбинации с этопозидом почти кратно снижал темпы опухолевого роста у мышей, что было подтверждено помимо прямых измерений данными прижизненного мониторинга опухолевой прогрессии с помощью оборудования ОИ прибора IVIS. В заключение необходимо отметить, что основная цель проекта, показать эффективность шаперонных ингибиторов в комбинаторрной противоопухолевой терапии достигнута, и в этой работе важную роль сыграло наше сотрудничество с ОИ ИБХ РАН.