Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Ионные каналы или ионотропные рецепторы рассматриваются как перспективные мишени для создания селективных лекарственных препаратов нового поколения. Выяснение механизмов их функционирования в норме и при патологии остается одной из актуальных задач медицинской химии, решение которой невозможно без изучения соединений различной природы, способных специфически взаимодействовать с этими рецепторами. Целью данного проекта является исследование механизма взаимодействия TRPV1 рецептора с первым и единственным на сегодняшний день поровым пептидным блокатором – HCRG21, недавно обнаруженным авторами проекта в актинии Heteractis crispa, методом просвечивающей крио-электронной микроскопии. В рамках работы на первом этапе выполнения проекта были получены функциональные рекомбинантные аналоги пептидов актинии Heteractis crispa, HCRG21 и АРНС1. В результате изучения анальгетического действия пептидов в тесте «горячая пластина», показано, что полный блокатор HCRG21, несмотря на более высокое значение 50% эффективной концентрации ингибирования TRPV1, обладает равной анальгетической способностью с модулятором TRPV1, APHC1, при внутримышечном введении мышам и сохраняет ее в течение 13 часов наблюдения. Анальгетический эффект APHC1 в дозе 0,1 мг/кг развивается очень быстро, за 5 минут, но длится менее 3 часов. Результаты исследования объективно отражают потенциал пептидов как хороших анальгетиков. С учётом разности измеренных ранее констант в экспериментах in vitro, результаты на животной модели частично подтверждают предположение, сделанное на основе результатов электрофизиологических измерений, что при практически полном блокировании ионного канала TRPV1 можно достичь более длительного анальгетического эффекта. В свою очередь более низкое значение ЕC50 обусловливает быстрое развитие анальгетического эффекта. В итоге оба пептида удачно дополняют друг друга, и их комбинация в одном анальгетическом препарате, вероятно, приведёт к очень быстрой и продолжительной анальгезии. Разработана система рекомбинантной продукции TRPV1 в эукариотических клетках. Получена плазмидная конструкция pcDNA4TO/rTRPV1-FLAG-6His, содержащая полноразмерный ген TRPV1 канала крысы, имеющего на С-конце фланкирующую последовательность FLAG-6His для выделения канала из клеточной массы. Канал rTRPV1-FLAG-6His был экспрессирован в системе T-REx. Ответ клеточной линии, экспрессирующей rTRPV1-FLAG-6His, на добавление агониста TRPV1, капсаицина, был сравним с ответом стабильной линии, экспрессирующей rTRPV1. Для выделения канала была проведена наработка клеточной массы (250-300 млн клеток). Однако, уровень экспрессии TRPV1 в клетках СНО, согласно Вестерн-блот анализу с помощью антител на His-tag, оказался очень низким. В рамках следующего этапа проекта будут продолжены работы по оптимизации условий экспрессии TRPV1. Разработана и оптимизирована методика получения рекомбинантного TRPV1. Белок выделяли с помощью метало-аффинной хроматографии на смоле Ni-sepharose FastFlow (GE). Осуществлен подбор мембраномоделирующей среды для стабилизации, очистки и структурных исследований TRPV1 на основе мицелл детергентов. Для встраивания TRPV1 в нанодиски использовали аполипопротеин MSP2N2 и POPC с последующим удалением детергента, инициацией сборки нанодисков и очисткой TRPV1/ND на анти-FLAG аффинной смоле. Были подобраны условия для исследования структуры TRPV1 методами крио-ПЭМ (с использованием ОИ). Полученные препараты TRPV1 в мицеллах детергента DDM и липид-белковых нанодисках были исследованы с помощью просвечивающей электронной микроскопии с негативным контрастированием. Предварительные результаты негативного контрастирования продемонстрировали гетерогенность исследуемых препаратов. Проведена витрификация образцов TRPV1 в мицеллах DDM для последующего анализа с использованием просвечивающего электронного микроскопа Титан Криос 60-300. Были проведены начальные этапы обработки данных и осуществлена предварительная реконструкция структуры. В результате витрификации были получены характерные изображения участков аморфного льда на сетках Quantifoil R1.2/1.3 с зафиксированным в них препаратом TRPV1/нанодиски. Предварительные данные свидетельствуют о малой концентрации объекта исследования в слое аморфного льда. Наблюдались агрегаты и одиночные частицы с диаметрами менее 10 нм. В результате проведения автоматизированного набора экспериментальных данных было получено 848 стеков изображений, из которых 770 стеков были отобраны для дальнейшего анализа. Коррекция дрейфа, оценка параметров функции передачи контраста (CTF), а также выбор одиночных проекций частиц на изображениях были произведены при помощи программного пакета Warp. В результате дрейф на изображениях, использованных для анализа, составил менее 2Å на одно изображение в стеке; пространственное разрешение изображений (оцененное по CTF) составило ~3,5Å. В виду невозможности однозначного определения проекций частиц TRPV1/нанодиски, осуществлялось выделение всех наблюдаемых частиц с размерами порядка 10 нм. В результате 295433 проекций одиночных частиц были выделены из исходных изображений после пре-процессинга и экспортированы в программный пакет CryoSPARC. Размер экспортированных изображений одиночных частиц составил 200 пикселей х 200 пикселей, что соответствует 22,1 нм х 22,1 нм. В результате двухмерной классификации проекций для дальнейшего анализа были выбраны 50464 частиц. Результаты анализа выявили наличие частиц со средним размером 6-8 нм. Таким образом, предварительные данные свидетельствуют о крайне малой концентрации объекта исследования в слое аморфного льда. Для определения структуры TRPV1 с высоким пространственным разрешением необходима дальнейшая оптимизация условий его подготовки и очистки, а также витрификации образца. Результаты работы были представлены на IX Российском симпозиуме «Белки и пептиды», который проходил в рамках II Объединенного научного форума 1-6 октября 2019, Сочи–Дагомыс: Лейченко Е. В., "Изучение разнообразия и поиск фармакологических мишеней пептидов Кунитц-типа морских анемон", (устный доклад). Подготовлена и отправлена в редакцию журнала Доклады АН статья: О.В. Синцова, В.А. Паликов, Ю.А. Паликова, А.А. Климович, И.Н. Гладких, Я.А. Андреев, М.М. Монастырная, Э.П. Козловская, И.А. Дьяченко, С.А. Козлов, Е.В. Лейченко «Пептидный блокатор ионного канала TRPV1 проявляет длительный анальгетический эффект в модели тепловой стимуляции».

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Ионные каналы или ионотропные рецепторы рассматриваются как перспективные мишени для создания селективных лекарственных препаратов нового поколения. Выяснение механизмов их функционирования в норме и при патологии остается одной из актуальных задач медицинской химии, решение которой невозможно без изучения соединений различной природы, способных специфически взаимодействовать с этими рецепторами. Целью данного проекта является исследование анальгетического действия пептидного блокатора TRPV1 канала HCRG21, обнаруженного в морской анемоне Heteractis crispa, и изучение взаимодействия этого пептида с каналом методом просвечивающей крио-электронной микроскопии. В отчетном году в рамках проекта получены следующие основные результаты: - наработаны рекомбинантные аналоги пептидов HCRG21 и АРНС1 количествах 14 и 8 мг, соответственно, и подтверждена их функциональная активность; - установлено, что HCRG21 обладает выраженным цитопротективным действием: он способен повышать жизнеспособность нейрональных клеток, обработанных 6-OHDA (in vitro модель болезни Паркинсона), не оказывая цитотоксического эффекта в концентрации до 10 мкМ, снижая при этом продукцию АФК в этих клетках на 87% относительно контроля. Полученные результаты подтверждают, что TRPV1 является молекулярной мишенью для лечения нарушений, связанных не только с болью, но и с нейродегенерацией; - изучен анальгетический эффект HCRG21 при в/м введении в дозе 0,1 мг/кг на модели боли, вызванной капсаицином, в формалиновый тесте, в тесте термической гиперальгезии, индуцированной введением полного адьюванта Фрейнда, и на модели боли и воспаления, вызванного введением каррагинана. Показано, что анальгетический эффект пептида превосходит эффект ибупрофена, широко применяемого на практике анальгетического и противовоспалительного препарата. Полученные результаты подтверждают возможность использования пептида как анальгетика для купирования болевых синдромов различной этиологии; - осуществлен поиск природных мутантов HCRG21 в комбинаторной библиотеке пептидов Кунитц-типа морской анемоны H. crispa методом глубокого секвенирования ампликонов. В результате анализа выведенных аминокислотных последовательностей, было идентифицировано 96 изоформ пептидов, обладающих высокой гомологией (от 85% до 92%) с HCRG21; - получены рекомбинантные аналоги пептида HCRG21 с заменами S5L, R1G и R48Н. Показано, что пептиды с заменами S5L и R1G в концентрации 10 мкМ при совместной аппликации с капсаицином ингибируют индуцированный агонистом ток на 40-50%, тогда как HCRG21 R48Н не оказывает влияния на возникающие в системе токи. Этот факт определяет Arg48 как важный для проявления активности аминокислотный остаток. Показано, что замена S5L приводит к новой функции – блокированию потенциал-зависимых калиевых каналов. В отличие от HCRG21, пептид с заменой S5L в концентрации 10 мкМ блокировал токи Kv1.1, Kv1.2 и Kv1.3 на 33%, 11% и 14% соответственно. Значение IC50 для Kv1.1 составило 15600 ± 0,24 нМ. Таким образом, единичная точечная мутация, S5L, изменяет специфичность пептида HCRG21 от канала семейства TRP к семейству Kv; - разработаны системы рекомбинантной продукции TRPV1 крысы, позволяющие получать полноразмерный рекомбинантный канал в клетках млекопитающих (CHO) и насекомых (Sf9). Получен укороченный вариант гена TRPV1, так называемый минимальный функциональный канал, содержащий, в отличие от опубликованной конструкции (Liao et al, Nature, 2013), фрагмент 604–626, образующий поровую петлю - вероятный сайт связывания HCRG21; - для стабилизации TRPV1 в растворе получен аполипопротеин MSP2N2 в количествах, достаточных для проведения всех запланированных в проекте работ. Рекомбинантный MSP2N2 образовывал липид-белковые нанодиски на основе POPC при соотношении MSP2N2/POPC : 1/150, что подтверждает возможность использования полученного белка для структурных исследований rTRPV1. - подобраны условия экспрессии и получены функционально активные рекомбинантные препараты полноразмерного rTRPV1, а также образцы TRPV1 в составе липид-белковых нанодисков (ЛБН) и амфиполах. - подобраны условия для исследования структуры TRPV1 в ЛБН и амфиполах методами крио-ПЭМ. В результате обработки данных крио-ПЭМ для образца TRPV1, выделенного из клеток Sf9 и встроенного в амфипол А8-35, были получены классовые суммы 194005 частиц, 7244 из которых схожи по морфологии с ожидаемыми проекционными изображениями TRPV1. Диаметр частиц составил 13-14 нм. Трехмерная реконструкция образца TRPV1 в амфиполе с учетом симметрии С4 соответствовала ожидаемой структуре полноразмерного рецептора TRPV1. В результате обработки данных крио-ПЭМ для образца TRPV1, выделенного из клеток СНО и встроенного в амфипол А8-35, были получены классовые суммы для первого (33904 частицы) и второго (10113 частиц) этапов двумерной классификации. Классовые суммы, содержащие 972 проекционных изображения частиц, схожих по морфологии с ожидаемыми проекционными изображениями TRPV1, были отобраны для трехмерной реконструкции. Полученная с учетом симметрии С4 карта плотности рассеивающего потенциала, пространственное разрешение которой составило 13 Å, соответствовала структуре полноразмерного рецептора TRPV1.

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
Создание лекарственных препаратов нового поколения для предупреждения развития патологических состояний организма, связанных с развитием хронического болевого синдрома, выяснение закономерностей возникновения и протекания данных расстройств, а также разработка подходов, позволяющих целенаправленно применять новые лекарственные препараты, являются одной из важнейших задач в рамках приоритетного направления развития науки, технологий и техники в Российской Федерации – Науки о жизни. В рамках данного проекта проводится структурно-функциональное исследование порового блокатора TRPV1 канала, пептида морской анемоны HCRG21, обладающего высоким биомедицинским потенциалом. В отчетном году в рамках 3 этапа проекта получены следующие основные результаты: - методом глубокого секвенирования ампликонов установлены последовательности 154 изоформ пептидов Кунитц-типа, гомологов HCRG21. Выявлены консервативные и вариабильные участки пептидов, проведен сравнительный анализ наиболее близких гомологов HCRG21, обнаружены основные аминокислотные замены, проведен филогенетический анализ последовательностей; - получены рекомбинантные пептиды HCRG21 и АРНС1, а также пептиды HCRG21 с заменами S5L, T14S, T14D, P31A и R48H в количестве от 3 до 10 мг каждого; - обнаружено, что все полученные пептиды ингибируют трипсин. Константы ингибирования трипсина для аналогов HCRG21 с заменами T14S, T14D и P31A составили 0,43, 0,56 и 0,26 мкМ соответственно; - показано, что пептиды с заменами P31A и S5L в концентрации 6 мкМ вызывают достоверное ингибирование активности TRPV1 канала, вызванное действием 1 мкМ капсаицина в культуре клеток CHO, стабильно экспрессирующей TRPV1 канал. Обнаружено, что пептиды с заменами T14S и T14D также ингибируют ответ на активацию TRPV1 канала, но в меньшей степени, тогда как замена R48H приводит к полной потере пептидом активности в отношении TRPV1 канала; - изучена эффективность мутантных пептидов HCRG21 с заменами S5L, T14S, T14D, P31A и R48H в модели боли, вызванной капсаицином при внутримышечном введении мышам. Установлено, что пептиды с заменами P31A и T14S в дозе 1 мг/кг оказывают обезболивающий действие, которое превосходит действие HCRG21 в показателе увеличения латентного времени начала первой реакции животного на индукцию боли. Показано, что замена T14D приводит к ослаблению анальгетического эффекта, тогда как замены S5L и R48H приводят практически к полной отмене анальгетической активности пептида; - изучен анальгетический эффект HCRG21 в тесте «горячая пластина» при различных способах введения. Показано, что при внутривенном и подкожном введении в дозах 0,1 мг/кг HCRG21 проявляет достоверный пролонгированный анальгетический эффект (не менее 13 часов), тогда как при инраназальном введении в дозе 0,1 мг/кг достоверное анальгетическое действие наблюдается в первые два часа после введения; - исследован эффект HCRG21 в модели воспаления, индуцированного введением каррагинана. Показано, HCRG21 в дозах 0,1 и 1 мг/кг снижает болевой порог (вызванный как механическим, так и термическим стимулом) и предотвращает развитие воспалительной реакции. Впервые показано, что пептидный ингибитор TRPV1 значительно снижает уровень ФНО-α, что предполагает наличие обоих механизмов ингибирования индуцированной каррагинаном гипералгезии: снижение продукции ФНО-α в иммунных клетках и снижение нейрональной активности за счет ингибирования TRPV1. Показана более высокая эффективность HCRG21 по сравнению с индометацином через 24 часа при механической гипералгезии, что предполагает длительный противовоспалительный эффект пептида в дополнение к измеренному пролонгированному обезболивающему действию; - оптимизированы протоколы выделения и очистки TRPV1. Разработан вектор pFastBac1/rTRPV1-TwinStrepTag, позволяющий получать препарат белка путем высокоэффективной очистки c помощью сорбента Strep-Tactin Sepharose. Подобраны условия культивирования клеток sf9 с целью оптимизации выхода TRPV1. В результате был получен образец TRPV1 с чистотой выше, чем при очистке с помощью His-tag и в количествах, достаточных для встраивания в мембран-моделирующие среды и проведения структурных исследований; - получены образцы TRPV1 в составе амфипола A8-35 и в составе липид-белковых нанодисков MSP2N2. - на основании сравнительного анализа образцов TRPV1 с капсаицином и с токсинами HCRG21 и APHC3 в амфиполах и нанодисках методами электронной микроскопии с негативным контрастированием выявлено значительно лучшее разрешение образцов в нанодисках, нежели в амфиполах; - проведена предварительная 3Д реконструкция TRPV1 в составе липид-белковых нанодисков в отсутствие и в присутствии капсаицина. Обнаружены перестройки канала, происходящие под действием капсаицина.

Аннотация результатов, полученных в 2022 году
В рамках проекта проводится структурно-функциональное исследование первого порового пептидного блокатора TRPV1 канала, пептида HCRG21 и его аналогов, обладающих высоким биомедицинским потенциалом. При выполнении 4 этапа проекта получены следующие основные результаты: - методом сайт-направленного мутагенеза с последующей продукцией рекомбинантных плазмид в системе Escherichia coli получены аналоги HCRG21 с заменами в функционально важных сайтах по данным молекулярного моделирования и NGS: R1G, S5L, T14К, R18А, R18А/Е38G P31A и R48H; - показано, что замены R1G, R18А и R18А/Е38G, не изменяют анальгетический эффект HCRG21 при внутримышечном введении, в модели боли, вызванной капсаицином тогда как анальгетический эффект пептида с заменой Т14К, превосходит эффект HCRG21; - установлено, что замены Т14К, R1G, R18A и P31A не оказывают заметного влияния на проявление пептидом HCRG21 анальгетической активности, но полностью отменяют (кроме Т14К) противовоспалительную активность пептида при внутримышечном введении в модели боли и воспаления, индуцируемого аллилизотиоцианатом; тогда как пептиды с заменами S5L и R48H не проявляет какой-либо значимой ни противовоспалительной, ни анальгетической активности в данном тесте; - установлено, что пептид HCRG21 обладает выраженным анксиолитическим действием и умеренным стимулирующим эффектом на ЦНС при внутримышечном введении: стимулирует двигательную и ориентировочно-исследовательскую активность животных при отсутствии возбуждающего действия на ЦНС. Установлено, что анксиолитическое действие пептида превосходит по эффективности препарат сравнения “Афобазол” и более выражено при внутримышечном, чем при пероральном введении. Полученные результаты подтверждают участие TRPV1 в генезе тревожных расстройств и создают предпосылки для разработки новых эффективных противотревожных препаратов; - получены образцы рекомбинантного TRPV1 канала в составе липид-белковых нанодисков, в том числе в комплексах с капсаицином и пептидами HCRG21 и APHC3. Образование стабильных комплексов подтверждено методом дифференциальной сканирующей флуориметрии; - связывание APHC3 вблизи центральной поры TRPV1 канала подтверждено методом криоэлектронной микроскопии на основе полученных трехмерных реконструкций комплексов TRPV1 с APHC3 с разрешением 4,34 ангстрема с учетом симметрии С4 и с разрешением 7,3 ангстрема, без учета симметрии канала.