Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Материалом для работы послужили пробы поверхностных вод и донных осадков Японского моря, полученных в 2018 и 2019 годах в ходе экспедиционных работ ФГБУН «Тихоокеанский океанологический институт им. В.И. Ильичева» ДВО РАН и Дальневосточного федерального университета на НИС «Академик М.А. Лаврентьев» (рейсы № 81 и № 88), а также в ходе береговых экспедиций. Исследования проводились на 50 станциях в трех районах: в северной части Японского моря (между 43°25' и 44°36' с.ш. и между 136°32' и 137°51' в.д.), в заливе Петра Великого (между 42°16' и 43°09' с.ш. и между 130°56' и 133°02' в.д.), в западной части Японского моря (между 36°42' и 42°13' с.ш. и между 130°12' и 131°13' в.д.). Выделение бактерий, способных к биодеградации нефтеуглеводородов, проводили по известной методике (Патент РФ № 2520084). Пробы воды и донных осадков из накопительных культур высевали на агаризованную минеральную среду Ворошиловой-Диановой с добавлением 2,5% флотского мазута и инкубировали в течение 14 суток при температурах 5°С и 22°С. Полученные чистые культуры идентифицировали на основе анализа их гена 16S рРНК. Полученные в ходе работы нуклеотидные последовательности были внесены в базу данных GenBank NCBI. В ходе исследования 50 станций в Японском море с 42 из них были получены накопительные культуры нефтеуглеводородокисляющих (НУО) микроорганизмов. Со всех точек отбора в общей сложности удалось выделить и идентифицировать до вида 137 штаммов бактерий: 49 из донных осадков и 88 из поверхностных вод. Изучение таксономического положения полученных культур показало, что они относятся к бактериям типов Actinobacteria, Firmicutes и Proteobacteria. Подавляющее большинство нашей коллекции относилось к группе наиболее распространенных в водной и почвенной среде НУО микроорганизмов. Однако, нам также удалось выделить 12 штаммов тех видов бактерий, для которых НУО активность обнаружена впервые в рамках данной работы. К ним относились 5 видов типа Firmicutes (Gracilibacillus massiliensis, Thalassobacillus sp., Virgibacillus dokdonensis, Chryseomicrobium amylolyticum и Jeotgalibacillus marinus), 4 вида бактерий типа Actinobacteria (Okibacterium sp., Lechevalieria flava, Patulibacter sp. и Patulibacter minatonensis) и 3 вида типа Proteobacteria (Moraxella osloensis, Idiomarina maritima и Idiomarina piscisalsi). На следующем этапе работы была изучена способность всех выделенных штаммов расти на средах с нефтью и нефтепродуктами при температурах 22°С и 5°С. Результаты работы показали, что при 22°С на средах с представленными субстратами росли все штаммы исследуемых бактерий. При температуре 5°С на средах с дизелем и мазутом росли 17 штаммов бактерий, а на среде с нефтью - только 12 штаммов. Поскольку все штаммы, проявившие окислительную способность при температуре 5°С, хорошо росли и при более высокой температуре, то их следует отнести к психротрофам, а не к истинным психрофилам. Стоит отметить, что психротрофные НУО штаммы бактерий были выделены, преимущественно, из донных осадков, причем с разных глубин (от 67 до 3656 м). Исключением стали 3 штамма, выделенные из поверхностных вод порта Находка, акватории Японского моря с хроническим загрязнением нефтепродуктами. Психротолерантные микроорганизмы были представлены как известными НУО бактериями, так и теми, для которых НУО активность описана впервые (Thalassobacillus sp., Idiomarina piscisalsi, Patulibacter minatonensis и Okibacterium sp.). Информационные ресурсы в сети Интернет, посвященные проекту: https://indicator.ru/earth-science/biologi-issleduyut-kak-bakterii-yaponskogo-morya-spravlyayutsya-s-zagryazneniem-nefteproduktami-04-08-2019.htm https://www.dvfu.ru/science/the-r-d-results/current-projects-rscf/19-74-00028/

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Для 142 штаммов углеводородокисляющих бактерий, полученных из донных осадков и поверхностных вод Японского моря, была проведена работа по выявлению у них генов группы алкан-гидроксилаз (alk1, alk2, alk3, Rh alkB1), генов окисления нафталина (nahAc, nah, narAb, narAa, nagG, nahH, nahAc7), фенантрена (phn, pdo), катехола (xylE, C23O) и бифенила (bphA1). Установлено, что среди генов, регулирующих окисление алканов, чаще всего у бактерий встречался alk1 (72%), гораздо реже alk3 (38%). Ген alk2 был обнаружен только у бактерий, выделенных из глубоководных осадков северной части Японского моря, а ген Rh alkB1 - только у некоторых родококков, независимо от района получения изолятов. Из генов, ответственных за окисление полициклических ароматических углеводородов (ПАУ), у полученных нами бактерий чаще всего выявляли xylE (81%), кодирующий синтез диоксигеназы мета-расщепления катехола, одного из ключевых соединений метаболического пути окисления ПАУ. Остальные гены, ответственные за деградацию ПАУ, встречались гораздо реже (до 45%). Для количественной оценки углеводородокисляющей активности методом хромато-масс-спектрометрии были взяты 30 штаммов бактерий. Модельная смесь углеводородов была приготовлена на основе коммерчески доступного летнего дизельного топлива с добавлением химически чистого нафталина, антрацена и фенантрена. Анализ метаболической активности бактерий проводили на хромато-масс-спектрометре Shimadzu GCMS 2010 Ultra на 1, 3, 5, 7, 14, 21 и 28 сут для образцов, которые инкубировали при 22°С, и на 1, 7, 14, 28, 42, 56, 70 и 90 сут для образцов с психтрофами. Степень утилизации бактериями углеводородов выражали в процентах и оценивали по изменению концентрации компонентов модельной смеси углеводородов в процессе инкубации по отношению к исходным значениям. Установлено, что для исследуемых штаммов степень окисления всех углеводородов при температуре 22°С к окончанию эксперимента (28 сут) варьировала в пределах 49-88%. При температуре 5°С почти все психротрофные штаммы окислили большую часть исследуемых углеводородов к 28 сут наблюдения. На 90 сут эксперимента не было зафиксировано существенной разницы в степени утилизации углеводородов по сравнению с данными, полученными на 28 сут. К окончанию эксперимента убыль отдельных алканов составила 43-100%, а убыль ПАУ – 67-91%. Все исследуемые мезофильные и психротрофные бактерии проявили высокую окислительную способность в отношении разложения н-алканов (С9-С27), фитана, пристана и полициклических ароматических углеводородов. Однако, в первую очередь из алканов разложению подвергались углеводороды с длиной углеродной цепи 9-14 и 21-27 атомов. Из ПАУ лучше всего микроорганизмы разлагали нафталин и антрацен. Проведенный анализ показал, что у наиболее активных штаммов, разлагающих нефтяные углеводородов при 22°С (Pseudomonas sp. AE_8H, Acinetobacter sp. VL_204-3W) было обнаружено по 6-7 генов деструкции алканов и ПАУ. В то же время у самого активного психротрофного штамма Rhodococcus erythropolis AP_291 было выявлено всего 2 гена (Rh alkB1 и xylE). Подобные результаты не позволяют сделать однозначного вывода о связи количества выявленных функциональных генов с метаболической активностью бактерий, а также указывают на необходимость более детального изучения процесса окисления углеводородов в условиях низких температур. Кроме того, вероятно, дополнительно требуется изучение экспрессии соответствующих генов. Таким образом, из полученной нами коллекции углеводородокисляющих микроорганизмов наиболее перспективными для биоремедиации акваторий Японского моря являются 7 штаммов мезофильных бактерий (Pseudomonas sp. AE_8H, Acinetobacter sp. VL_204-3W, Paenibacillus polymyxa AP_212128, Acinetobacter marinus AE_2, Cobetia marina AE_2-4W, Enterobacter sp. NH_8-3K и Rhodococcus sp. AP_21102) и 2 штамма психротрофных бактерий (Rhodococcus erythropolis AP_291 и Pseudomonas sp. AP_27). Для скрининговых исследований, направленных на поиск углеводородокисляющих бактерий в Японском море, может быть использован подход выявления у микроорганизмов генов alk1 и xylE, как наиболее часто встречающихся генов среди микробиоты данного региона.