КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер 16-16-00007

НазваниеПолногеномный поиск ассоциаций и моделирование генных сетей селекционно значимых признаков у нута (Cicer arietinum L.)

РуководительНуждин Сергей Викторович, Кандидат биологических наук

Организация финансирования, регион федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования "Санкт-Петербургский политехнический университет Петра Великого", г Санкт-Петербург

Период выполнения при поддержке РНФ

2019 г. - 2020 г.

Конкурс Конкурс на продление сроков выполнения проектов, поддержанных грантами Российского научного фонда по приоритетному направлению деятельности Российского научного фонда «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований по приоритетным тематическим направлениям исследований» (11).

Область знания, основной код классификатора 06 - Сельскохозяйственные науки, 06-104 - Агробиотехнологии

Ключевые словаНут, коллекция ВИР, генетическое разнообразие, староместные сорта, центры происхождения, полногеномный поиск ассоциаций, моделирование, генные сети, геномная селекция.

Код ГРНТИ68.03.03

СтатусУспешно завершен

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Для увеличения производства нута в РФ необходимо создание новых высоко адаптивных сортов, селекционное улучшение которых должно быть направлено прежде всего на скороспелость, засухоустойчивость, продуктивность, устойчивость к болезням (аскохитозу). Однако, по нашим данным, окультуривание и последующая селeкция привели к стократному снижению генетического разнообразия в современных сортах нута (von Wettberg et al., 2018). В результате утраты разнообразия селекционеры лишились традиционного ресурса, используемого при создании новых сортов. В этой перспективе актуальной является задача масштабной мобилизации генетической изменчивости, присутствующей в генотипах диких видов и староместных сортов для улучшения сельскохозяйственных культур (Plekhanova et al., 2017, Sokolkova et al., отправлена в журнал). В течение текущего периода финансирования мы охарактеризовали генетическую изменчивость в диких популяциях нута Cicer reticulatum (von Wettberg et al. 2018), и определили какая ее часть былa потерянa в первичных и вторичных центрах окультуривания в его производном виде C. arietinum (Plekhanova et al. 2017, Shin et al. 2019). Мы картировали много QTL (локусов количественных признаков), ответственных за фенотипическое разнообразие у староместных форм C. arietinum (Plekhanova et al. 2017; Sokolkova et al., отправлена в журнал) и за различия между C. arietinum и C. reticulatum (Shin et al. 2019; Zubair et al., подготовлена к отправке в журнал). Однако вопрос о том, какова генетическая основа этих различий остается открытым. Одним из источников фенотипического разнообразия в староместных сортах могут быть новые мутации. Другим источником разнообразия могут быть эпимутации, т. е. наследуемые изменения в состоянии метилирования ДНК и/или модификации хроматина. У растений, в отличие от животных, эпигенетические изменения, такие, как метилирование ДНК, могут сохраняться и передаваться через гаметогенез и быть стабильными на протяжении многих поколений. Эпигенетические аллели влияют на многие фенотипические признаки, такие как время цветения, архитектура растения и др. Таким образом, эпигенетическое разнообразие становиться новым источником фенотипической вариабельности, важной для улучшения адаптации культур к изменяющимся условиям, а также, обеспечения урожайности и качества. Для выработки стратегий селекции требуется выявление стабильных и наследуемых эпигенетических вариантов. Сопровождают ли специфические эпигенетические изменения процесс окультуривания растений? Пока мы не имеем четкого ответа на этот важный вопрос, потенциально значимый для селекции растений. В этом проекте мы предлагаем охарактеризовать вариабельность одного из типов эпигенетических изменений ‒ метилирования ДНК у диких видов нута, а также его культурных и староместных сортов, чтобы в конечном итоге разработать новые пути селекции нута посредством эпигенетической инженерии. Время цветения является ключевым фактором в географическом распространении как диких видов нута, так и его культурных сортов. Это важный агрономический признак, поскольку он определяет, когда происходит переход от вегетативного роста к репродукции. Во многих крупных районах производства нута сезон, благоприятный для его выращивания чрезвычайно короткий, и засуха или морозы начинаются раньше, чем наступает созревание. Таким образом, идентификация районов генома и казуальных вариантов, контролирующих цветение и ответственных за адаптацию нута к условиям среды произрастания, была бы крайне желательна, чтобы свести к минимуму риск производства этой сельскохозяйственной культуры. Мы идентифицировали несколько QTL, ассоциированных с временем цветения в популяции образцов диких видов (Singh et al., подготовлена к подаче в журнал), и показали, что следы адаптации к условиям произрастания в центрах первичного и вторичного биоразнообразия сохраняются в геномах этих растений в виде специфической «памяти», вследствие чего разные комбинации аллелей в ассоциированных со временем цветения QTL по разному реагируют на изменение климатических условий в районах фенотипирования (Kozlov et al., 2018; Козлов и др., 2019). Недавно в нескольких работах было показано, что механизмы, лежащие в основе «преадаптации» у растений имеют эпигенетическую природу (Slotkin, 2016), поэтому с большой долей вероятности можно предположить, что фенотипическая вариация по времени цветения в наших данных обусловлена эпимутациями. В этом проекте мы предлагаем проверить эту гипотезу. Mы также предлагаем впервые исследовать роль метилома в регуляции экспрессии времени цветения у дикого и культурного нута и выяснить, является ли генетическая или эпигенетическая изменчивость наиболее вероятной причиной обнаруженных ассоциаций. Другим важным агрономическим признаком является образование клубеньков. C. reticulatum эффективно вступает в симбиоз с клубеньковыми ризобиями и фиксирует молекулярный азот из вoздуха, в то время как у C. arietinum, хотя и формируется большое количество клубеньков, они не способны эффективно фиксировать азот. Следствием этого является необходимость удобрять посевы нута, и низкая ценность нута для севооборота. У люцерны Medicago truncatula (близкого родственника нута) в тканях, из которых формируется клубенёк, происходит массированное перепрограммирование экспрессии сотен нодулоспецифиных генов в результате деметилирования ДНК (Satge et al., 2016). Выключение гена деметилирования ведёт к формированию недоразвитых и нефункциональных клубеньков. Их внешний вид похож на таковой у C. arietinum, поэтому мы предполагаем, что нарушенное метилирование/деметилирование в клубеньках может быть причиной неэффективной нодуляции у культурного нута. В течение текущего периода финансирования проекта были найдены два QTL, связанные с эффективностью нодуляции (Shin et al., отправлена в журнал). Интересно, что внутри этих QTL присутствуют 3 гена метилтрансфераз, разный уровень экспрессии которых может быть причиной различий в уровне метилирования ДНК и эффективности нодуляции у культурного и дикого нута. Мы проверим это предположение путем анализа уровня метилирования ДНК в клубеньках, сформированных на диких и культурных растениях, и путем сравнения уровней экспрессии генов-кандидатов, связанных с метилированием/деметилированием, из ассоциированных с нодуляцией QTL. Необходимость удобрения полей нута вносит ограничения в выращивание этой культуры. Мы предлагаем интрогрессировать эффективные гены нодуляции C. reticulatum в C. arietinum, используя селекцию, что должно привести к снижению потребности нута в удобрениях.

Ожидаемые результаты
Дикие формы нута являются важным источником генетической изменчивости и могут быть использованы для улучшения современных сортов. Однако между дикими и культурными формами нута существует большая разница по фенологии цветения: культурные сорта нута C.arietinum реагируют на фотопериод, не требуют яровизации и высеваются весной, в то время как дикие виды ‒ растения длинного дня, нуждаются в яровизации, прорастают осенью, зацветают весной и созревают летом. Для мобилизации потенциала диких видов в селекции на раннее цветение необходимо выяснить генетические механизмы, ответственные за такие различия. Мы впервые изучим роль метилома в модуляции экспрессии генов времени цветения у дикого и культурного нута и выясним, лежат ли основе дифференциальной экспрессии некоторых генов сети времени цветения различия в уровне их метилирования. Вопрос о роли эпигенетических изменений в процесс окультуривания растений остается открытым. В этом проекте мы предлагаем охарактеризовать вариабельность одного из типов эпигенетических изменений ‒ метилирования ДНК у диких видов нута и его культурных и староместных сортов. Важным вопросом для понимания роли эпиразнообразия в ответе генотипа на селекцию и окультуривание является вопрос о наследуемости эписостояний. Наследуемая природа ДНК‒метилирования в сайтах CG была установлена путем повторного секвенирования одного и того же гомозиготного генома с интервалом в несколько поколений. Однако остается неизвестным, будут ли эпиаллели одинаково устойчивы, если они не находятся в контексте одного и того же генома, но имеют сложное происхождение, включая результат скрещивания диких и культурных разновидностей нута. Используя растения рекомбинантных инбредных линий от таких скрещиваний мы проследим, как наследуются участки генома от разных родителей и ответим на этот вопрос. Мы также ответим на вопрос о том, является ли генетическая или эпигенетическая изменчивость наиболее вероятной причиной обнаруженных нами QTL, и, тем самым, откроем новые пути селекции нута посредством эпигенетической инженерии. Мы также попытаемся понять на механистическом уровне, является ли нарушение метилирования/деметилирования ДНК причиной неэффективного бобово-ризобиального взаимодействия у культурного нута и проверим гипотезу о том, что уровень экспрессии генов метилирования в QTL нодуляции может быть ответственен за различия по этому признаку. Наконец, мы начнем работу по интрогрессии эффективных генов нодуляции C. reticulatum в C. arietinum, используя селекцию, что должно привести к снижению потребности нута в удобрениях Полученные перспективные линии будут переданы селекционерам для создания новых сортов, эффективно усваивающих азот.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Аннотация результатов, полученных в 2019 году
На территории Кубанской опытной станции ВИР были собраны листья 309 генотипов нута: 3 диких образцов C. reticulatum, 3 культурных сортов, 3 староместных сортов и 288 генотипов потомства F4 от скрещивания диких генотипов с одним из культурных сортов. Чистая геномная ДНК была выделена из всех генотипов. По своим характеристикам ДНК пригодна для дальнейшего приготовления библиотек бисульфитной конверсии и секвенирования по технологии Illumina. ДНК, выделенная из 21 генотипа ‒ 3 диких образцов C. reticulatum, 3 культурных сортов, 3 староместных сортов, а также из 12 рекомбинантов F3 была использована для приготовления библиотек для полногеномного бисульфитного секвенирования на основе тагментации (TWGBS), и в настоящее время проводится секвенирование этих библиотек. В Краснодарском крае (45° 18ˈ с.ш. и 40° 52ˈ в.д.) на КОС ВИР в 2019 г. проведено полевое фенотипирование 288 гибридов F4 культурного нута с дикими видами. Изучение проводилось 12 фенологическим, морфологическим и агрономическим признакам. Образцы сгруппированы в 20 групп, в пределах каждой из которых были гибриды, имеющие одного и того же дикого родителя. Группы содержали от 5 до 17 образцов. Показана изменчивость признаков у всех гибридов и отличительные особенности каждой группы. Выявлено значительное варьирование признаков, как в пределах образцов, так и в пределах групп образцов. Эта изменчивость особенно характерна для признаков структуры урожайности (высота растения, масса 1000 семян, масса семян с делянки, высота прикрепления нижнего боба и др.). Морфологические признаки – окраска цветков и семян, форма куста у гибридов не отличались от таковых у диких форм. Проведен сравнительный анализ транскриптомов бутонов, листьев до зацветания и листьев после зацветания у трех генотипов культурного нута C. arietinum, нечувствительного к фотопериоду мутанта ICCV96029 и четырех генотипов дикого нута C. reticulatum и C. echinospermum, выращенных при яровизации и без нее. Анализ транскрипционного ответа культурного нута на яровизацию показал, что наиболее сильно экспрессия генов различается в листьях после зацветания и что в транскрипционный ответ на яровизацию вовлечены гены сигнальных путей, связанных с ответом на абиотический стресс, и в частности на холод. Главный вклад в различие транскриптомов листьев до зацветания у диких и культурных видов, по всей видимости, вносят сигнальные пути биосинтеза вторичных метаболитов и их транспорта. Наиболее значимая разница транскриптомов бутонов и листьев после зацветания у диких видов и культурных сортов нута связана с канонической и неканоническими функциями фактора элонгации EF-1 alpha ‒ туннелированием аминоацил‒тРНК синтетазы, взаимодействием с цитоскелетом и участвием в апоптозе. Другие различия в транскриптомах листьев после зацветания у диких видов и культурных сортов, по‒видимому, также опосредованы процессами деградации белков. Нечувствительность к фотопериоду генотипа ICCV96029 обусловлена несколькими мутациями, из которых одна ‒ делеция в гене Caelf3a на 5 хромосоме, который ортологичeн гену elf3 Arabidopsis thaliana, кодирующему транскрипционный фактор, участвующий в сигнальном пути циркадного ритма (Ridge et al., 2017). Природа других мутаций в этом генотипе неизвестна. Мы показали, что различие транскриптомов у мутанта ICCV96029 с одной стороны и культурных образцов или C.echinospermum с другой, по всей видимости, имеет эпигенетическую природу. На основании выполненного анализа сформирован список образцов для анализа метилирования ДНК . На данном этапе Проекта мы провели предварительный эксперимент по подготовке клубеньков нута к флуоресцентному окрашиванию мРНК in situ современным методом гибридизационной цепной реакции (Hybridization Chain Reaction, HCR) для выявления пространственной экспрессии генов, ответственных за метилирование/деметилирование у дикого и культурного нута. Особенности клеточной стенки растений и зрелых клубеньков потребовали модификации метода HCR на этапе предварительной подготовки тканей, к примеру, инфильтрация тканей на этапе фиксации, дегидратации и инфильтрации парафином проводилась в вакуумном эксикаторе. Мы опробовали два метода фиксации, подготовили срезы и окрасили их гистологическими красителями, чтобы оценить, насколько данная технология позволяет сохранить морфологию клубенька. Результаты показали, что морфология клубеньков хорошо сохранилась, и на изображениях видны зоны меристемы, инфицирования/дифференцировки и фиксации азота. Таким образом, разработанную методологию можно использовать для получения срезов клубеньков и дальнейшего окрашивания методом HCR in situ.

Публикации

1. Соколкова А.Б., ЧангП., Карраскила-Гарсия Н., Нуждина Н., Кук Д., Нуждин С.В., Самсонова М.Г. Следы экологической адаптации в геномах староместных сортов нута Биофизика, - (год публикации - 2020)

2. Шин М.Г., Булынцев С.В., Чанг П.Л., Корбу Л.Б., Караскуилла-Гарсия Н., Вишянкова М.А., Самсонова М.Г., Кук Д.Р., Нуждин С.В. Multi-trait analysis of domestication genes in Cicer arietinum – Cicer reticulatum hybrids with a multidimensional approach: Modeling wide crosses for crop improvement Plant Science, Plant Sci. 2019 Aug;285:122-131 (год публикации - 2019) https://doi.org/10.1016/j.plantsci.2019.04.018

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Выполнено полногеномное бисульфитное секвенирование с покрытием 20X геномов 3 диких, 3 староместных и 3 культурных генотипов, а также гибридов от скершивание викого генотипа на культурный сорт. Одновременно, поскольку идентификация сайтов метилирования происходит путем сравнения конвертированного сиквенса с исходной геномной ДНК, все геномы, использованные для бисульфитной конверсии, были ре‒секвенированы в покрытием 10X. Разработан алгоритм «раскрашивания» генома гибрида в соответствии с происхождением его частей от родительских генотипов . С использование техники анализ би‒плотов выполнена оценка стабильности и адаптивности генотипов, что может помочь селекционерам в отборе наиболее перспективных для возделывания староместных сортов нута из коллекции банка семян ВИР. Для более объективной оценки фенотипических признаков в 2017 году на полях Кубанской опытной станции ВИР был осуществлен посев 407 староместных образцов нута, фенотипированных там же в 2016 г. Проведенный GWAS анализ выявил три ОНП на хромосомах 2, 7 и 8, соответственно, значимо ассоциированных с фенотипическим признаком число дней до зацветания на Кубани в 2017 г. Найденные ОНП попадают в районы генома, ранее идентифицированные в GWAS анализе по результатам фенотипирования на Кубанской опытной станции ВИР в 2016 г. Используя программу ByPass, мы показали, что районы генома, ассоциированные с признаками синдрома одомашнивания нута находятся на 1, 5, 6, 7 и 8 хромосомах. На основе транскриптомов, полученных для разных тканей и генотипов культурного и дикого нута, выращенного при яровизации и без нее, проанализирована дифференциальная экспрессия генов, вовлеченных в процесс зацветания. Было детально рассмотрено влияние яровизации на экспрессию генов цветения культурного нута. Для генотипов культурного нута C arietinum мы обнаружили во всех рассмотренных тканях (листьях до зацветания, листьях после зацветания и бутонах) при яровизации повышение экспрессии генов FT, важнейших позитивных регуляторов цветения. Однако мы выявили изменение экспрессии очень небольшого числа генов-мишеней FT, а в некоторых тканях дифференциальная экспрессия генов-мишеней FT вообще не была обнаружена. Возможно, этим обусловлено то, что яровизация не оказывает существенного влияния на время цветения культурного нута. Интересно, что в листьях до зацветания у мутанта ICCV96029 с ранним временем цветения дифференциально экспрессируются гены фотопериода/циркадных ритмов, чего не наблюдается у других сортов C. arietinum. Это ставит под сомнение предположение, что ранняя индукция генов FT у мутанта не связана с изменениями функции генов циркадных ритмов. Мы провели анализ дифференциальной экспрессии генов цветения между генотипами культурного и дикого нута. Различия между генотипами культурного нута, в отличие от генотипов диких видов, крайне тканеспецифичны. Селекция культурного нута исторически проводилась на чувствительность к фотопериоду. Однако, мутант ICCV96029 считается нечувствительным к фотопериоду. Сравнение генов цветения в различных тканях всех генотипов культурного нута с диким нутом C. reticulatum и C. echinospermum показывает повышенный уровень экспрессии генов фотопериода/циркадных ритмов в листьях до зацветания у культурного нута. Это позволяет предположить, что раннее включение генов фотопериода по сравнению с дикими генотипами свойственно как для культурного нута C. arietinum, так и для мутанта ICCV96029. Была разработана новая динамическая модель времени цветения образцов дикого нута с автоматически определенной аналитическим видом функциональной зависимости, обладающая высокой точностью. Результаты подтверждили влияние географического места происхождения на фенологию нута и одновременно разнообразие поведения групп, происходящих из близко расположенных мест. Растения высокогорных районов адаптированы к более низким температурам и длинному дню, чем собранные на меньших высотах. Время до цветения сокращено в построенных прогнозах на 2020–2080 годы и при изменении климата, некоторые группы имеют четкие траектории. Путем введения регрессионных функций модель сведена к зависимости от минимальной температуры и длины дня. Результаты численного исследования упрощенной модели показали наличие областей параметров, обеспечивающих рост готовности к цветению, но не достигающихся в экспериментальных данных. Такие области параметров могут быть задействованы в условиях потепления климата. Фенотипическое разнообразие дикого нута можно использовать в программах селекции для получения сортов с желаемым временем цветения.

Публикации

1. Агеев А.Ю., Айдоган А., Бишоп вон Уэттберг Э., Нуждвин С.В, Самсонова М.Г., Козлов К.Н. Simulation model for time to flowering with climatic and genetic inputs for wild chickpea Computers and Electronics in Agriculture, - (год публикации - 2021)

2. Агеев А.Ю., вон Уэттберг Э., Нуждин С.В., Самсонова М.Г., Козлов К.Н. Численное исследование модели времени цветения образцов дикого нута Биофизика, - (год публикации - 2021)

3. Агеев А.Ю., вон Уэттберг Э., Нуждин С.В., Самсонова М.Г., Козлов К.Н. Прогнозирование времени цветения диких сортов нута с учетом изменения климата Биофизика, - (год публикации - 2021)

4. Соколкова А.Б. ,Булынцев С.В, Чанг П., Карраскила-Гарсия Н., Кук Д., Веттберг Э., Вишнякова М.А.,Нуждин С.В.,Самсонова М.Г. Поиск агроостровков в геноме нута Биофизика, - (год публикации - 2021)

5. Соколкова А.Б., Булынцев С.В. Чанг П., Карраскила-Гарсия Н., Иголкна А.А., Нуждина Н.В., вон Уэттберг Э., Вишнякова М.А., Кук Д., Нуждин С.В.,Самсонова М.Г. Genomic Analysis of Vavilov’s Historic Chickpea Landraces Reveals Footprints of Environmental and Human Selection International Journal of Molecular Sciences, Int. J. Mol. Sci. 2020, 21, 3952 (год публикации - 2020) https://doi.org/10.3390/ijms21113952

6. Соколкова А.Б., Булынцев С.В. Чанг П., Карраскила-Гарсия Н., Кук Д., вон Уэттберг Э., Вишнякова М.А., Нуждин С.В.,Самсонова М.Г. Геномный анализ староместных сортов нута Биофизика, - (год публикации - 2021)

7. Соколкова А.Б., Карраскила-Гарсия Н., Кук Д.,Булынцев С.В., вон Уэттберг Э., Нуждин С.В. Чанг П., Вишнякова М.А.,Самсонова М.Г. Genomic analysis of Vavilov's historic chickpea landraces using GWAS, AMMI and GGE biplot analyses BIOINFORMATICS OF GENOME REGULATION AND STRUCTURE/SYSTEMS BIOLOGY (BGRS/SB-2020). The Twelfth International Multiconference. Abstracts, Institute of Cytology and Genetics, Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences; Novosibirsk State University. – Novosibirsk: ICG SB RAS, 2020. – 683 pp. (год публикации - 2020) https://doi.org/10.18699/BGRS/SB-2020-221

Возможность практического использования результатов
Полученные результаты можно использовать в селекции для получения новых адаптивных сортов