Аннотация результатов, полученных в 2019 году
В 2019 году проведен мониторинг основных вирусов, поражающих растения персика и абрикоса (Plum pox Potyvirus, PPV; Prunus necrotic ringspot Ilarvirus, PNRSV; Prune dwarf Ilarvirus, PDV; мозаики яблони, Apple mosaic Ilarvirus, ApMV) в коллекционных насаждениях косточковых плодовых культур НБС-ННЦ. В результате визуального обследования цветков, листьев, плодов и общего состояния деревьев, были выявлены внешне бессимптомные растения персика и абрикоса. Экспериментальный вирусологический анализ методами ИФА и ОТ-ПЦР показал отсутствие вирусной инфекции в образцах персика сортов Герман Титов, Карнавальный, Кардинал, Лакомый, Мечта, Никитский Подарок, Персей, Прогресс, Тюльпан, Clyde Wilson, Jerseyglo и гибридной формы КАТ 92-2210, а также в образцах абрикоса сортов Ананасный Украинский, Боярин, Зоркий, Искорка Тавриды, Кеч-Пшар, Красный Вымпел, Крокус, Крымский Амур, Крымский Медунец, Мелитопольский Нарядный, Память Костиной, Профессор Смыков, Увертюра, Херсонский 23, Юпитер, Bergeron, Harcot, Harlayne, Harris, Henderson, Stark Early Orange и гибридных форм К-60-4/9, P-72-128, K-713-98, 130, 432, 8-86, 84-951, 93-119, 97-6, 97-10, 97-11, 97-17, 93-121 и 93-122. Сорта персика, Никитский Подарок, Персей, Прогресс, Clyde Wilson, Jerseyglo и гибридной формы КАТ 92-2210; сорта абрикоса Зоркий, Крымский Амур, Крымский Медунец, Harcot, Harlayne, Harris, Henderson, Stark Early Orange были включены в скрещивания для получения толерантных гибридных форм. В результате обследований, предпринятых в 2019 году, обнаружено 13 новых изолятов PPV на персике (изоляты Ph, 35ph), абрикосе (Ki, AU), сливе (Co1) и алыче (MN, Lad, Spa, MM, N1, AL-2, BAL, Lav). Все новые изоляты принадлежали к штамму D. Продемонстрированы результаты филогенетического анализа 3'-концевой последовательности геномов этих изолятов (участок (Cter)NIb-CP-3'-NCR длиной 1264 нуклеотида). Они показывают, что большинство новых изолятов группируются с крымскими изолятами, охарактеризованными ранее, и с двумя венгерскими изолятами Soscut1 и Szigetcsept1. Изоляты MN, Lad и Spa с дикорастущей алычи образуют отдельную кладу в общей группе с изолятами Niksic из бывшей Югославии. Изоляты Ki и MN входят в гетерогенных кластер, представленный изолятами из различных регионов Европейской России, Кореи (F%-1) и Словакии (BIII/2). Близкое родство изолятов BAL/K11 и MN/Ki, обнаруженных на дикорастущей алыче и персике или абрикосе, соответственно, указывает на то, что дикорастущая алыча, по-видимому, является резерватом PPV, с которой вирус может распространяться тлей в коллекционные насаждения персика и абрикоса. Таким образом, результаты обследования указывают на необходимость предварительного тестирования PPV и других вирусов косточковых в растениях, отбираемых для селекционных, биотехнологических и физиолого-биохимических исследований. Определяемые вирусы шарки сливы (Plum pox Potyvirus), некротической кольцевой пятнистости (Prunus necrotic ringspot Ilarvirus), вирус карликовости (Prunus dwarf Ilarvirus) были обнаружены с помощью ИФА в образцах сортов персика Ambergold, Baby Gold-7, Carolum, Dixired, Loadel, Summerglo, Крымский Шедевр, Подарок Невесте, Пушистый Ранний и гибридной формы ДБ 97-120. В других образцах персика вирусы не обнаружены. Анализ отдельных образцов с помощью ОТ-ПЦР со штаммспецифичными праймерами показал, что все изоляты относятся к штамму D. Следует отметить, что ни один из 6 детектируемых вирусов не был обнаружен в образцах абрикоса. Этот результат показывает, что, по-видимому, PPV был перенесен на отдельные растения этих сортов тлями, а не при вегетативном размножении зараженных растений. Изучена поражаемость вирусными патогенами и физиологическая реакция сортов абрикоса и персика на биотический стресс в полевых условиях. В ходе маршрутных обследований коллекционных насаждениий персика выявлены сорта и гибридные формы с внешними признаками возможного поражения вирусной инфекцией. На листовых пластинках пораженных растений наблюдали узкие расплывчатые полосы в виде узора, реже – кольца светло-желтой или желтой окраски, которые хорошо просматривались на свету, также отмечали морщинистость листьев. Листовые пластинки пораженных растений имели ряд структурных различий по сравнению с бессимптомными. Снижение толщины листа на 5-8% отмечено у сорта Summerglo и формы ДБ 97-120; снижение коэффициента палисадности – у сорта Summerglo и формы ДБ 97-120, в губчатой ткани межклеточное пространство становится больше. У большей части инфицированных листьев, вне зависимости от сортовой принадлежности, разрушение хлоропластов начинается в слоях мезофилла, прилегающих к покровным тканям, и далее распространяется по всему мезофиллу; некрозы начинаются в палисадной хлоренхиме. В цитоплазме клеток существенно увеличивается количество кристаллических включений (друзы оксалата кальция). Существенное увеличение (в 1,4 раза) количества устьиц отмечали у пораженных генотипов Loadel, ДБ 97-120 и Summerglo. Нами проведен анализ некоторых показателей водного режима (общая оводненность тканей листа, реальный водный дефицит), а также оценка пигментного комплекса диагностированных растений персика в условно засушливых условиях вегетационного периода 2019 года. Максимальное напряжение гидротермического стресса наблюдали в первой половине августа. Средняя температура воздуха за август составила 24,9°С, что превысило на 2,3°С норму. Продолжительность солнечного сияния за месяц составила 317 часов при норме 312. Отсутствие осадков на фоне атмосферной засухи привело к снижению продуктивной влаги в 50 см слое почвы до минимальных значений. В третьей декаде августа погода обуславливалась нахождением Крыма в южной периферии антициклона.. Максимальная температура воздуха днем достигала 36,8°С. Относительная влажность при этом опускалась ниже 30% (в течение двух суток). Незначительные осадки выпали в начале третьей декады и в сумме составили 0,8 мм (8% от нормы). На основании изучения различных параметров водного режима листьев персика, нами установлено, что амплитуда изменения содержания воды в листе, водного дефицита и водоудерживающая способность тканей листовых пластинок различались в зависимости от конкретного генотипа, поражения вирусной инфекцией и метеоусловий периода исследований. В первой декаде августа общее содержание воды в тканях листьев составило 56-68%. Снижение оводненности тканей в связи с поражениями вирусной инфекцией обнаружены у сорта Loadel (на 7% по сравнению со здоровыми растениями) и формы ДБ 97-120 (на 6%). По параметру реального водного дефицита в этот период существенных различий у пораженных и непораженных растений не отмечено: водный дефицит развивался от 3-9% (здоровые растения сортов Clyde Wilson, Jerseyglo, Никитский Подарок; пораженные растения сортов Carolum, Loadel и Summerglo) до 11-16% (здоровые растения сорта Персей, пораженная форма ДБ 97-120). При этом у здоровых и больных растений отмечена различная водоудерживающая способность тканей листа. Полученные данные свидетельствуют о высоком уровне засухоустойчивости у исследуемых сортов и гибридных форм персика. Кроме того, первичные данные позволяют предположить, что у пораженных вирусными инфекциями растений снижается устойчивость к водному и высокотемпературному стрессу, однако не приводит к летальным или сублетальным изменениям в водном режиме. Осуществлен анализ содержания биологически активных веществ – флавоноидов, хлорофиллов и антоцианов как в контрольных точках, так и при различной водоотдаче. Наблюдения показали, что продукционный процесс довольно стабилен, ассимиляция углекислоты существенно снижалась только у пораженных растений сортов Loadel, Summerglo и Baby Gold-7. При завядании количество хлорофилла уменьшалось через 8 часов. Данный показатель довольно чувствителен относительно степени поражаемости: относительное количество хлорофилла у непораженных деревьев сорта Loadel – 38,5 мкг/см2, у больных – 33,0 мкг/см2; у сорта Summerglo – 43,20 и 36,21 соответственно. Индукция флуоресценции хлорофилла свидетельствует о деструктивных процессах в компонентах фотосистемы-2 у пораженных генотипов Loadel и ДБ 97-120. Максимальное количество флавоноидов в первой декаде августа было определено у сортов Персей, Loadel, Summerglo, и гибридных форм ДБ 97-120 и КАТ 92-2210; при обезвоживании их количество увеличивалось. В пик засухи (третья декада августа) количество флавоноидов не достигало 2 отн.ед. поглощения, у пораженных деревьев оно было выше, чем у здоровых. Относительное содержание антоцианов находилось в пределах 0,15-0,23 ед. и достоверно не изменялось в связи с поражениями или сроками завядания. Из генофонда косточковых плодовых культур выделены сорта и формы персика и абрикоса по устойчивости и толерантности к основным вирусам и проведено их изучение по комплексу биологически ценных признаков: урожайности, товарному качеству плодов, адаптивности к абиотическим и биотическим стрессорам полевыми и лабораторными методами оценки. Среди изучаемых генотипов абрикоса наиболее поздним началом цветения (28-29.03) отличаются растения сорта Harcot и гибридной формы 97-11. По продолжительности цветения на одни сутки превышали контроль три генотипа: Harlayne, 93-119 и 97-6. Отличной и хорошей закладкой генеративных почек выделялись растения сорта Harris и трех форм 97-6, 97-11 и 97-17. Ранним созреванием плодов (24.06) характеризуется форма 97-11, более поздним (16.07) – сорт Harlayne, остальные генотипы занимают промежуточное между ними положение. Высокой урожайностью деревьев, на уровне контрольного сорта и выше, выделены сорт Harlayne и гибридные формы 97-6, 97-11 и 97-17. Высокой устойчивостью к монилиозу в полевых условиях (поражение на 1 балл и ниже) отличились сорта Harlayne, Harcot и формы 93-121, 93-122, 97-6, 97-17, 432; к клястероспориозу (поражение на 1,3-1,8 балла) – Henderson, Harlayne, Stark Early Orange, 93-122, 97-10, 97-17, 432. По устойчивости к обоим патогенам выделены: ‘Harlayne’, ‘93-122’, ‘97-17’ и ‘432’. По комплексу признаков (высокой закладке генеративных органов, урожайности и полевой устойчивости к наиболее вредоносным патогенам) выделены сорт Harlayne и формы 97-6 и 97-17. Представлена помологическая характеристика изучаемых сортов и форм. По комплексу помологических параметров (размеру, нарядной окраске и вкусу плода) выделены формы 97-6 и 97-11. Растения отличаются поздним цветением, высокой регулярной урожайностью (11 кг с дерева), высокой устойчивостью к монилиозу и клястероспориозу, удовлетворительной засухоустойчивостью. Были проведены фенологические наблюдения за сортами и формами персика, включенными в гибридизацию. По типу цветка сорта и формы относятся к двум эколого-географическим группам. С колокольчатыми цветками отмечено 7 сортов и форм: Baby Gold-7, ДБ 97-120, Loadel, Summerglo, Carolum, Персей, Никитский Подарок, которые принадлежат к иранской группе. С розовидными цветками выявлено 2 сорта Clyde Wilson, Jerseyglo и форма КАТ 92-2210, которые относятся к северокитайской эколого-географической группе. У большинства сортов и форм сроки цветения были средние, и степень цветения была хорошей – на 4-5 баллов. По высокой урожайности (31,2-36,7 кг/дер., 207,5-244,1 ц/га) выделено 3 сорта: Baby Gold-7, Loadel и Summerglo. Помологическое описание сортов и форм показало, что по крупноплодности (160 – 240 г) отличались сорта Jerseyglo, Summerglo, Carolum и формы ДБ 97-120, КАТ 92-2210. С отличным внешним видом плодов (4,5-4,7 балла) отмечено 3 сорта: Clyde Wilson, Summerglo и Персей. Наилучшими вкусовыми качествами плодов (4,6-4,7 балла) отличались 8 образцов: Baby Gold-7, ДБ 97-120, Clyde Wilson, Loadel, Summerglo, Carolum, Персей, Никитский Подарок. По общей высокой оценке плодов выделено 5 сортов: Baby Gold-7, Clyde Wilson, Summerglo, Персей, Никитский Подарок. С целью оценки устойчивости растений к биотическим факторам среды у опытных сортов и форм изучена поражаемость основными грибными болезнями – курчавостью листьев и мучнистой росой. С низкой поражаемостью курчавостью листьев (1 балл) было отмечено 6 сортов и форм: Baby Gold-7, ДБ 97-120, Jerseyglo, Loadel, Персей, Никитский Подарок; мучнистой росой (2 балла) – 4 образца: ‘Clyde Wilson’, ‘КАТ 92-2210’, ‘Loadel’, ‘Никитский Подарок’. Сорта и формы персика и абрикоса изучены методами SSR-анализа на выявление маркеров устойчивости к основным вирусам. Поведен анализ аллельного полиморфизма микросателлитных локусов, ассоциированных с главным локусом устойчивости к шарке, который был выявлен у абрикоса и картирован на первой группе сцепления (LG1). Растительным материалом для исследования послужили сорта абрикоса из коллекционных насаждений косточковых плодовых культур НБС, включая сорта, известные как доноры указанного локуса устойчивости, а также ряд гибридных форм, полученных в результате выполнения селекционной программы на устойчивость абрикоса к вирусу шарки сливы (Plum pox Potyvirus). Одной из родительских форм указанных гибридов послужил устойчивый сорт Stark Early Orange (SEO). Был выполнен анализ полиморфизма целевых SSR-локусов для персика [Prunus persica (L.) Batsch]. Были использованы ДНК-маркеры PGS1-252, aprigm18, pchcms4, Gol061, картированные в области локализации QTL PPVR-1 на первой хромосоме у абрикоса. Приведены примеры электрофоретического разделения продуктов амплификации, полученных для использованных в работе микросателлитных ДНК-маркеров. Наличие двух пиков/двух фрагментов одного цвета на электрофореграмме (маркер aprigm18 у сорта абрикоса SEO, маркер PGS1-252 у сорта абрикоса Harcot, маркер pchcms4 у гибрида абрикоса 93-122) свидетельствует о гетерозиготности микросателлитных локусов, присутствие только одного фрагмента (маркер pchcms4 у сорта персика Ambergold) о гомозиготности. Приведены размеры амплифицированных фрагментов по целевым локусам. Два значения размера продукта амплификации соответствует гетерозиготности. По ДНК-маркеру Gol061, для персика не было выявлено амплификации, что обусловлено отсутствием сайтов отжига для данной праймерной пары и, соответственно, отсутствием кросс-воспроизводимости. В целом, по использованным в работе ДНК-маркерам, при генотипировании персика был выявлен низкий уровень полиморфизма. При этом взаимосвязи между размером SSR-аллели и наличием устойчивости к вирусу шарки сливы выявлено не было. Видно, что у устойчивых и толерантных сортов аллельный набор зачастую идентичен таковому у восприимчивых сортов. Это может говорить как об отсутствии взаимосвязи маркер/локус, так и о наличии других детерминант устойчивости к шарке сливы у вида Prunus persica, локализованных на других позициях в геноме к вирусу. Рассматривая результаты генотипирования сортов и гибридов абрикоса, необходимо отметить тот факт, что у устойчивых к вирусу шарки сливы сортов SEO, Harcot, Harlayne, а также у ряда гибридных образцов, включая устойчивый к шарке гибрид 97-10, который был получен в комбинации скрещивания с использованием толерантного сорта SEO, идентифицируются идентичные аллели по использованным ДНК-маркерам. Таким образом можно выделить три основных гаплотипа, выявленных по целевым маркерам, которые идентифицируются у устойчивых сортов: I) Сорт SEO, гибриды 97-10, 93-121: PGS1-252 (74:104), aprigm18 (191:217), pchcms4 (235:237), Gol061 (282). Данный гаплотип также выявлен у формы 97-11. II) Сорт Harcot: PGS1-252 (76:104), aprigm18 (191:217), pchcms4 (229), Gol061 (282); III) Сорт Harlayne: PGS1-252 (74:104), aprigm18 (201:208), pchcms4 (235), Gol061 (282:286). Рассматривая детально SSR-профили всех изученных сортов и сортов SEO, Harcot и Harlayne, можно сделать вывод о том, что аллели, выявленные у данных сортов, встречаются у широкого перечня образцов из изученной выборки, включая восприимчивые. Это может быть обусловлено наличием генетической дистанции между PPVR локусом и данными маркерами, так как все использованные на данный момент SSR-маркеры, являются фланкирующими данный локус. В дальнейшем в работу планируется вовлечь некоторые дополнительные ДНК-маркеры локуса PPVR, включая косегрегирующие с ним. Представлена дендрограмма, полученная по результатам SSR-генотипирования по четырем использованным в работе ДНК-маркерам. Необходимо отметить, что сорта абрикоса Kioto и Юпитер определены в аутгруппу по отношению к другим сортам, а также тот факт, что сорт Harcot является более устойчивым по отношению к сортам Harlayne и SEO. Задачей исследования является не только ДНК-маркерная идентификация целевого локуса у анализируемых сортов, но также и изучение степени их генетического родства на основе данных о полиморфизме региона локализации PPVR. В связи с этим необходимо выполнение анализа не только SSR-локусов, косегрегирующих с ним, но также и расположенных на определенной генетической дистанции от него, но известных как наиболее сцепленные с ним. Это даст возможность оценить уровень генетического полиморфизма в данном локусе и дополнить информацию о степени информативности тех или иных ДНК-маркеров при выполнении скрининга коллекций генофонда на предмет наличия указанной генетической детерминанты устойчивости. Начато формирование признаковой коллекции персика и абрикоса из сортов – источников, доноров устойчивости и толерантности к вирусным патогенам. На основе проводимых исследований осуществляется подготовка паспортов на сорта персика и абрикоса, толерантных к основным вирусным патогенам. Проведена гибридизация с включением в скрещивания сортов персика и абрикоса, устойчивых и толерантных к вирусным патогенам и получены гибридные семена. Предварительно изучена жизнеспособность пыльцы сортов абрикоса Stark Early Orangе и Пионерский путем проращивания ее на растворах 15 и 20% сахарозы. Лучшие показатели (4,1% – у сорта Пионерский и 2,8% – у сорта Stark Early Orangе) отмечены в варианте с 20% раствором сахарозы. С целью создания ранних сортов, толерантных к вирусу шарки сливы, была проведена гибридизация: Зоркий х Stark Early Orange и P-72-128 х Пионерский, опылено 478 цветков и собрано 35 гибридных плодов, которые переданы в лабораторию биотехнологии и вирусологии растений, также в эту лабораторию переданы плоды, полученные от свободного опыления толерантных сортов: Крымский Медунец, Harcot, Stark Early Orange, Harlayne, Крымский Амур. Выделено 55 семян из плодов от свободного опыления толерантных к вирусу шарки сливы сортов и форм, созданных с их участием: Harlayne, 93-119, 93-122, 97-17 и 432. У персика проведена гибридизация в девяти комбинациях скрещиваний с использованием в качестве материнских родителей трех высококачественных сортов и форм селекции Никитского ботанического сада: Персей, ДБ 97-120 и КАТ 92-2210, а также шести интродуцированных сортов (из США – Baby Gold-7, Clyde Wilson, Jerseyglo, Summerglo; из Испании – Carolum; из Венгрии – Loadel). В качестве отцовских родителей использовали районированные в РФ сорта персика селекции НБС Никитский Подарок и Персей. Для проверки жизнеспособности пыльцу отцовского сорта Никитский Подарок проращивали в 15% и 20% растворе сахарозы, а также измеряли диаметр пыльцевого зерна и длину пыльцевой трубки. В 15% растворе проросло большее количество пыльцы (13,9%), чем в 20% (11,6%). В 15% растворе сахарозы диаметр пыльцевого зерна составил 45,0 мкм, а длина пыльцевой трубки – 318,8 мкм, что свидетельствует об удовлетворительной жизнеспособности пыльцы. В процессе проведенных опытов отмечено, что пыльцевые зерна персика имеют треугольную (три поры) или овальную формы (две поры). В результате исследований всего было опылено 5855 цветков, после первой ревизии (1 декада мая) образовалось 2925 завязей (50,0%), после второй ревизии (опадение июньской завязи, 2 декада июня) сформировалось 774 плода (13,2%). 199 семян высеяны в селекционные парники. Введены в культуру in vitro гибридные незрелые и зрелые зародыши персика (пяти комбинаций скрещивания сортов: Clyde Wilson, Jerseyglo, Персей, Прогресс и гибридной формы КАТ 92-2210 с сортом Никитский Подарок) и абрикоса (‘Крымский Амур’ × ‘Harcot’, ‘Крымский Амур’ × ‘Henderson’, ‘Крымский Амур’ × ‘Stark Early Orange’, ‘Крымский Медунец’ × ‘Harcot’, ‘Крымский Медунец’ × ‘Stark Early Orange’, ‘Henderson’ × ‘Harlayne’, ‘Зоркий’ × ‘Stark Early Orange’ и зародыши от свободного опыления сортов Крымский Амур, Крымский Медунец, Harcot, Harlayne и Stark Early Orange). Гибридные зародыши абрикоса комбинации скрещивания ‘Р-72-128’ × ‘Пионерский’ были введены in vitro с целью получения раннеспелых толерантных форм. В основном для изучаемых гибридных зародышей абрикоса период холодовой предобработки составил 1,5-2 мес, а у некоторых комбинаций скрещивания – 3-4 недели (‘Крымский Амур’ × ‘Harcot’ и ‘Henderson’ × ‘Harlayne’). Лучшие результаты для зрелых зародышей абрикоса получены на безгормональной среде Монье, дополненной 2,5% сахарозы, 0,9% агара и 400,0 мг/л гидролизата казеина. При культивировании зародышей абрикоса на средах Монье и МС, содержащих кинетин в концентрации 0,2 мг/л, ГК3 – 0,15 мг/л, L-глутамин – 1,0 мг/л, гидролизат казеина – 400,0 мг/л, наблюдали различные пути реализации их морфогенетического потенциала. Из гибридных зародышей абрикоса сортов Крымский Амур × Harcot, Крымский Амур × Henderson, Крымский Амур × Stark Early Orange, Крымский Медунец × Harcot, Крымский Медунец × Stark Early Orange, Henderson × Harlayne, Зоркий × Stark Early Orange и от свободного опыления сортов Harcot, Harlayne, Крымский Амур, Крымский Медунец и Stark Early Orange полноценные проростки развивались спустя 1,5-2 мес культивирования на модифицированной питательной среде Монье. Установлено, что более высоким регенерационным потенциалом обладали гибридные зародыши ‘Крымский Амур’ × ‘Harcot’, ‘Henderson’ × ‘Harlayne’ и от свободного опыления сортов Крымский Амур и Stark Early Orange, у которых через 2 месяца культивирования количество полученных проростков составило 94,8%, 86,2%, 78,4% и 77,5%, соответственно. Проростки с некрозом апикальной части помещали на питательные среды MS и QL для индукции развития адвентивных почек из базальной части, что позволило сохранить и размножить полученные гибридные формы. Лучшие результаты развития проростков были отмечены в комбинациях скрещивания сортов Крымский Амур × Harcot, Р-72-128 × Пионерский, Крымский Амур × Henderson и гибридной формы 93-121. При культивировании in vitro зародышей персика исследуемых комбинаций скрещивания наблюдали различные пути реализации морфогенетического потенциала. Так, зародыши длиной 0,1-0,7 см на безгормональных средах Монье и МС не развивались или развивались слабо, формируя единичные тонкие проростки с неразвитыми корнями. Индукция побего- и корнеобразования происходила на средах, дополненных 0,4 мг/л кинетина и 0,15 мг/л ГК3. При этом частота регенерации проростков не превышала 15,0%. Полноценные проростки были получены на безгормональной среде Монье с 400,0 мг/л гидролизата казеина, в комбинациях скрещивания ‘Персей’ × ‘Никитский Подарок’, ‘Прогресс’ × ‘Персей’ и гибридной формы ‘КАТ 92-2210’ × ‘Никитский Подарок’ (94,4, 96,4 и 98,6%, соответственно). У зрелых гибридных зародышей персика изучаемых комбинаций скрещивания в основном наблюдали образование полноценных проростков. Однако в комбинациях скрещивания персика ‘Jerseyglo’ × ‘Nikitskiy Podarok’ (53%) и ‘Clyde Wilson’ × ‘Nikitskiy Podarok’ у формирующихся проростков отмечали некроз апикальной части (28% и 32%, соответственно). Декапитированные проростки этих комбинаций скрещивания помещали на питательные среды MS и B5 для индукции развития адвентивных почек и микропобегов. Использование ОТ-ПЦР и ИФА при анализе на вирусы культивируемых проростков из полученных зародышей персика комбинаций скрещивания ‘Baby Gold-7’ (7/10) × ‘Никитский Подарок’, ‘ДБ 97-120’ (13/2) × ‘Никитский Подарок’, ‘ДБ 97-120’ (13/1) × ‘Никитский Подарок’, ‘Loadel’ (2/28) × ‘Никитский Подарок’, ‘Summerglo’ (7/26) × ‘Никитский Подарок’, ‘Carolum’ (8/36) × ‘Никитский Подарок’, ‘Никитский Подарок’ (2/31), св. оп., ‘Прогресс’ × ‘Персей’ показало отсутствие вирусов PPV, PNRSV, PDV, ApMV. Проведены исследования по оценке основных физиологических параметров проростков персика ex vitro: фотосинтетическая активность на основании измерений инфукции флуоресценции хлорофилла, оценка пигментного комплекса (хлорофилла, флаванола и антоцианов), рассмортен индикатор азотного балланса. Наиболее продуктивно используют ресурс света в ассимиляционных процессах ex vitro проростки комбинаций скрещивания: ‘ДБ 97-120’ (13/2) × ‘Никитский Подарок’, ‘Прогресс’ × ‘Персей’, ‘Loadel’ (11/14) × ‘Никитский Подарок’, ‘Summerglo’ (7/26) × ‘Никитский Подарок’ и ‘Персей’ (7/37) × ‘Никитский Подарок’ (от 0,68 до 0,71 отн. ед. фл.). Данные проведенного анализа коррелируют с содержанием фотосинтетического пигмента – хлорофиллов. Количество хлорофилла составило от 14,6 до 35,6 мг/см2. Значительное повышение относительного содержания флаванолов и антоцианов установлено у проростков ‘ДБ 97-120’ (13/1) × ‘Никитский Подарок’, ‘Summerglo’ (2/39) × ‘Никитский Подарок’, ‘Loadel’ (11/14) × ‘Никитский Подарок’, ‘Никитский Подарок’ (2/31), св. оп. Это может быть связано со стрессовым состоянием данных растеньиц, а также работой окислительно-восстановительной системы клеток при адаптации к условиям ex vitro. Массовое содержание азота в листьях меньше у растеньиц с активным ростом, ассимиляционные процессы которых нацелены на быстрое распределение азота и углерода. Полученные результаты в 2019 г. раскрывают возможности создания толерантных к вирусной инфекции гибридных форм абрикоса и персика в условиях in vitro с участием в скрещивании толерантных сортов, что подтверждает перспективность и необходимость продолжения исследований в данном направлении.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
В 2020 году было продолжено обследование коллекционных насаждений косточковых культур ФГБУН «НБС-ННЦ» на наличие особо опасных вирусов: вирус шарки сливы (Plum pox Potyvirus, PPV), вирус некротической кольцевой пятнистости (Prunus necrotic ringspot Ilarvirus, PNRSV) и вирус карликовости сливы (Prune dwarf Ilarvirus, PDV) В коллекционных насаждениях персика (Prunus persica), абрикоса (P. armeniaca), сливы (P. domestica) и на дикорастущей алыче (P. cerasifera) обнаружено 19 новых изолятов PPV. Последовательности (Cter)NIb-CP-3’-NCR новых изолятов были депонированы в GenBank. Выявлено, что большинство изолятов принадлежит к штамму D; найдено также по одному изоляту штаммов Rec и М. Секвенированы 3'-концевые последовательности генома новых изолятов, включающие ген белка оболочки (БО) и примыкающие последовательности гена NIb и 3’-нетранслируемого региона. При филогенетическом анализе этих последовательностей изоляты PPV-D распределялись в несколько кластеров или клад. Средний уровень дивергенции между последовательностями крымских изолятов PPV-D составил 2,0%. Сравнительно высокий уровень генетической изменчивости указывает на давнюю интродукцию предков нынешних изолятов PPV-D в НБС. Изолят Н23, выявленный в коллекции абрикоса, принадлежал к штамму М. Это первая находка PPV-M в Крыму. Изолят AL-Ch (штамм Rec) обнаружен на дикорастущей алыче. В БО изолята К87 (штамм D) обнаружена мутация К59Т, которая препятствует его распознаванию PPV-D-специфичными моноклональными антителами 4DG5. В БО Al-Ch и охарактеризованных ранее изолятов K28 и Kisl-1pl (штамм Rec) обнаружены аминокислотные замены в позиции 68, которые не влияли на распознавание этих изолятов моноклональными антителами AL. По-видимому, позиция 68 находится за пределами PPV-M/Rec-специфичного эпитопа. Результаты работы показывают, что, по всей вероятности, PPV проник в НБС с зараженным материалом косточковых культур в результате нескольких независимых интродукций из различных регионов мира и распространился по насаждениям насекомыми-переносчиками. Для оценки генофонда косточковых плодовых культур определяющим является как фенотип, так и генотип. В 2020 г. продолжено изучение отобранных ранее на основании литературных данных и наших исследований сорта абрикоса толерантные к вирусу шарки сливы: Stark Early Orange (SEO), Harcot, Harris, Henderson, Harlayne и гибридные формы, полученные на их основе: 93-119 Henderson × Harlayne, 93-121 Henderson × Harlayne, 93-122 Henderson × Harlayne, 432 Крымский Амур × Henderson, 97-6 Олимп × SEO, 97-10 Олимп × SEO, 97-11 Олимп × SEO и 97-17 Олимп × SEO. Представлены фенологические показатели и результаты учета урожайности, полевой устойчивости абрикоса к засухе и наиболее вредоносным патогенам изучаемых сортов и форм. Вместе с тем представлена помологическая характеристика изучаемых сортов и форм, включающие данные по биохимии плодов. По комплексу помологических параметров (размеру, нарядной окраске и вкусу плода) отобраны формы 97-10 и 97-11. Подготовлены паспорта на сорта и формы абрикоса, проявляющие признаки толерантности к вирусу шарки сливы. В 2020 г. проведены фенологические наблюдения за сортами и формами персика, включенными в гибридизацию. По типу цветка сорта и формы были отнесены к двум эколого-географическим группам. У большинства сортов и форм сроки цветения были средние и степень цветения была хорошей на 4 - 5 баллов. По высокой урожайности (28,0 – 32,4 кг/дер., 186,2 –215,5 ц/га ) выделено 4 сорта и формы : Baby Gold 7, ДБ 97-120, Loadel, Summerglo. Помологическое описание сортов и форм показало, что по крупноплодности (152 – 187 г) отличались 3 сорта: Clyde Wilson, Jerseyglo, Summerglo. Наилучшими вкусовыми качествами плодов (4,5 - 4,7 балла) отличались пять образцов: Baby Gold 7, Clyde Wilson, Loadel, Summerglo, Персей, Никитский Подарок. По общей высокой оценке плодов (4,5-4,6 балла) выделено 4 сорта: Baby Gold 7, Clyde Wilson, Summerglo, Carolum, Персей. Вместе с тем изучена поражаемость основными грибными болезнями – курчавостью листьев и мучнистой росой. Проведена паспортизация девяти сортов и форм персика: Clyde Wilson, Baby Gold 7, Carolum, Jerseyglo, Loadel, Summerglo, КАТ 92-2210, Персей, Никитский Подарок. Осуществлен анализ полиморфизма SSR-локусов, ассоциированных с областью локализации локуса, детерминирующего устойчивость к вирусу шарки сливы у абрикоса и персика. В работе использовали ДНК-маркеры PGS1.21 и PGS1.24, PGS1.252, aprigm18, pchcms4, Gol061, картированные в области локализации QTL PPVR-1 на первой хромосоме у абрикоса. При этом наиболее тесно-сцепленными с данным локусом являются маркеры PGS1.21 и PGS1.24. В связи с высоким уровнем кросс воспроизводимости SSR ДНК-маркеров между видами рода Prunus, в целях экспериментальной проверки перспективности использования указанных ДНК-маркеров для оценки генетического разнообразия вида P. persica и идентификации устойчивых к вирусу шарки сливы образцов, выполнили генотипирование ряда образцов персика, обладающих разной степенью устойчивости к данному вирусу. Наличие двух пиков/двух фрагментов одного цвета на электрофореграмме (маркер aprigm18 у сорта абрикоса SEO, маркер PGS1-252 у сорта абрикоса Harcot, маркер pchcms4 у гибрида абрикоса 93-122) позволило нам говорить о гетерозиготности микросателлитных локусов, присутствие только одного фрагмента (маркер pchcms4 у сорта персика Амберголд) – о гомозиготности. Представлены ДНК-фингерпринты изученных сортов и гибридов персика и абрикоса, полученные в результате генотипирования. Два значения размера продукта амплификации соответствует гетерозиготности. По ДНК-маркеру Gol061, для персика не было выявлено амплификации, что обусловлено отсутствием сайтов отжига для данной праймерной пары и, соответственно, отсутствием кросс-воспроизводимости. В целом, по использованным в работе ДНК-маркерам, при генотипировании был выявлен низкий уровень полиморфизма. При этом взаимосвязи между размером SSR-аллели и наличием устойчивости к вирусу шарки сливы выявлено не было. Аллельный набор зачастую идентичен независимо от степени устойчивости сортов. Это говорить об отсутствии взаимосвязи маркер/устойчивость к вирусу шарки сливы, и о наличии других детерминант устойчивости к вирусу шарки сливы у вида Prunus persica, локализованных на других позициях в геноме. Приведены результаты генотипирования сортов и гибридов абрикоса, а также частота встречаемости аллелей, а также показатели, отражающие уровень полиморфизма маркеров. Рассматривая частоты встречаемости аллелей SSR-маркеров, использованных в работе показано, что наиболее равномерным распределением данной величины для выявленных аллелей обладает маркер aprigm18, по которому было выявлено наибольшее количество аллелей. Так, маркерам с наибольшим уровнем полиморфизма относятся маркеры PGS 1.252 (8 аллелей) и aprigm18 (12 аллелей). Наименее полиморфен оказался маркер Gol061. Видно также, что количество эффективных аллелей и информационный индекс Шеннона у маркера aprigm18 также наиболее высокий. Это соотносится с равномерным распределением частот встречаемости для его аллелей. У абрикоса по результатам генотипирования у устойчивых сортов-доноров локуса PPVR-1 можно выделить три основных гаплотипа, выявленных по SSR- маркерам, фланкирующим локус: I) Сорт SEO, гибриды 97-10, 93-121: PGS1-252 (74:104), aprigm18 (191:217), pchcms4 (235:237), Gol061 (282). Данный гаплотип также выявлен у сорта Казачок; II) Сорт Harcot: PGS1-252 (76:104), aprigm18 (191:217), pchcms4 (229), Gol061 (282); III) Сорт Harlayne: PGS1-252 (74:104), aprigm18 (201:208), pchcms4 (235), Gol061 (282:286). По тесносцепленным маркерам PGS 1.21 и PGS 1.24 выявлены следующие гаплотипы: SEO: PGS1.21 (187:233), PGS1.24(111:113); Harcot: PGS1.21 (187:233), PGS1.24 (109:111); Harlayne: PGS1.21(187:233), PGS1.24(109:111). По результатам SSR-генотипирования представлена дендрограмма, которая имеет сложную структуру. Сорта и гибридные формы, являющиеся устойчивыми или имеющие известные сорта-доноры локуса PPVR-1 в качестве родительских форм и несущие аллели от сортов-доноров, объединены в группу (выделена овалом). Наряду с ними, в эту группу вошел также сорт Профессор Смыков. Сорт Найденыш, который не вошел в данную группу, имеет значительные аллельные различия по маркерам aprigm18, pchcms4 и Gol061. Таким образом, на основании полученных данных перспективной является выполнение аналогичной работы на расширенной выборке образцов абрикоса, включая сорта и гибриды, обладающие устойчивостью к PPV и/или имеющие в родословной сорта – известные доноры локуса PPVR-1. Учитывая тот факт, что сорта Сенатор, Найденыш, Альдебар, Казачок и гибриды 97-10, 93-121, 93-122 по многолетним данным оценки на естественном инфекционном фоне, имеют устойчивость к PPV и несут селекционно-ценные аллели по маркерам, сцепленным с локусом PPVR-1, их использование в селекции на устойчивость к данному фитопатогену является перспективным. С целью создания ранних сортов с толерантностью к вирусу шарки сливы была проведена гибридизация. У абрикоса в скрещивание были включены шесть перспективных сортов селекции ФГБУН «НБС-ННЦ» и пять интродуцированных сортов, а также перспективные формы (97-6, 97-10, 97-11, 97-17, 93-119), полученные с участием толерантных к вирусу шарки сливы сортов абрикоса: Stark Early Orang, Harlayne и Henderson. Лучшие показатели прорастания пыльцы (66,8% – ‘Bergarouge’ и 15,6% – ‘Stark Early Orangе’) отмечены в варианте с раствором 15% сахарозы. В комбинациях скрещиваний персика в качестве материнских родителей были использованы четыре интродуцированных сорта (страна происхождения США): Clyde Wilson, Jerseyglo, Summerglo, Loadel. В качестве отцовского родителя был использован районированный в РФ сорт персика селекции НБС Никитский Подарок, который проявил повышенную устойчивость к вирусу шарка сливы и был включен в гибридизацию, как сорт – источник данного признака. При проверки жизнеспособности пыльцы отцовского сорта Никитский Подарок отмечено, что в 15% растворе проросло большее количество пыльцы (37,3%). Изолированные гибридные зародыши абрикоса, полученные в результате межсортовых скрещиваний ‘Альдебар × Чудо’ (1 зародыш); ‘Зоркий × Stark Early Orange’ (21 зародыш); ‘Искорка Тавриды × Да-Хуан_Хоу’ (1 зародыш); ‘Казачок × Боярин’ (2 зародыша); ‘Крымский Медунец × Harcot’ (6 зародышей); ‘Крымский Медунец × Stark Early Orange’ (11 зародышей); ‘Олис × Bergarouge’ (32 зародыша); ‘Память о Друге × Harcot’ (23 зародыша); ‘Сенатор × Магистр’ (37 зародышей) и 2 зародыша (из одного семени) от межвидового скрещивания сорта P. armeniaca ‘Искорка Тавриды’ с видом P. mume. Для изучаемых гибридных зародышей период холодовой предобработки составил 1,5-2 мес. Лучшие результаты для зрелых зародышей абрикоса были получены нами на безгормональной среде Монье, дополненной 2,5% сахарозы, 0,9% агара и 400,0 мг/л гидролизата казеина. Гибридные зародыши абрикоса ‘Зоркий × Stark Early Orange’, ‘Крымский Медунец × Stark Early Orange’, ‘Память о Друге × Harcot’, помещенные на среду Монье, активно прорастали и начинали формировать полноценные проростки через 45-60 сут. При этом частота регенерации проростков у гибридных форм варьировала от 70-95%. У форм ‘Крымский Медунец × Stark Early Orange’ и ‘Олис × Bergarouge’ побеги декапитировали, разделяли на сегменты с узлом и помещали на питательные среды MS и QL с регуляторами роста растений для индукции развития дополнительных почек и побегов, что позволило сохранить ценный гибридный материал и размножить полученные формы. Активная регенерация микропобегов у двух гибридных форм абрикоса происходила на модифицированной питательной среде QL, содержащей 1,0 мг/л БАП и 0,1 мг/л НУК, на которой спустя 6 недель культивирования микропобеги достигали длины 1,5-2,5 см. Выявлено, что высоким регенерационным потенциалом обладали микропобеги гибридной формы ‘Зоркий’ × ‘Stark Early Orange’. Гибридные зародыши персика комбинаций скрещивания ‘Clyde Wilson × Никитский Подарок’ (16 зародышей); ‘Jerseyglo × Никитский Подарок’ (21 зародыш); ‘Loadel × Никитский Подарок’ (7 зародышей); ‘Summerglo × Никитский Подарок’ (18 зародышей); а также зародыши от свободного опыления сортов ‘Carolum’ (18 зародышей); ‘Clyde Wilson’ (19 зародышей); ‘Loadel’ (18 зародышей); ‘Summerglo’ (72 зародыша); ‘Персей’ (39 зародышей) и селекционных форм ‘ДБ 97-120’ (19 зародышей); ‘КАТ 92-2210’ (24 зародыша) были введены в условия in vitro. Семена исследуемых гибридных форм персика были выполнены и зародыши имели длину 1,21 ± 0,15 до 1,90 ± 0,07 см. Поэтому успешное прорастание зародышей персика происходило на безгормональной питательной среде Монье, дополненной 2,5% сахарозы, 0,9% агара и 400,0 мг/л гидролизата казеина. После стратификации лучшее развитие было отмечено у гибридных форм ‘Loadel × Никитский Подарок’, ‘Summerglo × Никитский Подарок’ и ‘Carolum’, ‘Summerglo’ от св. оп. Продолжалось изучение регенерационного потенциала in vitro 5 гибридных форм персика скрещивания 2019 г. Высоким регенерационным потенциалом обладали микропобеги гибридной формы ‘Summerglo’ × ‘Никитский Подарок. В целом все испытанные концентрации БАП в сочетании с 0,1 и 0,2 мг/л ИМК активизировали процесс морфогенеза и повышали частоту регенерации по сравнению с контролем. Проанализированы некоторые параметры анатомии листьев персика и абрикоса при культивировании in vitro. Так, форма и цвет листовых пластинок соответствовали таковым у исходных растений (ex situ). Листья имели типичное для данных культур бифациальное, гипостоматическое строение. Плотность упаковки хлоренхимы была выше у сортов абрикоса. Мезофилл листа дифференцирован на палисадную и губчатую ткань. Число слоев в зависимости от культуры составило 2 палисады и 2-3 губчатой ткани соответственно для микропобегов персика; 1 (реже 2) палисады и 2-3 губчатой хлоренхимы – для листьев растеньиц абрикоса. Механические ткани сформированы, проводящая система закрытого коллатерального типа. Устьичные аппараты аномоцитного типа, на одном уровне с клетками эпидермы. Полученные в 2019 г. проростки гибридных форм абрикоса и персика высаживали на адаптацию в условия ex vitro. Выращивание гибридных форм в климатической камере (CONVIRON, Канада) при температуре 24 ± 1°С, интенсивности освещения 37,5 μmol m-2s-1, фотопериоде 16 часов и влажности 70-80% способствовало их адаптации в течение 3-4 недель. После завершения адаптации ex vitro растения помещали в изолированную стеллажную теплицу для доращивания. Через 2 мес растения переваливали в емкости большего объема в почвенную смесь почва : торф : песок в соотношении 3:1:1. Проведено исскуственное заражение вирусными патогенами (PNRSV, PPV, PDV Результаты проведенных через 3 и 6 месяцев после инокуляции тестирований показали отсутствие вирусов PPV, PNRSV, PDV в проанализированных методом ИФА образцах персика. ОТ-ПЦР гибридных форм также подтвердил отсутствие вирусов PNRSV и PPV. В ходе наблюдений установлено, что адаптируемые растения персика in vivo после 9 месяцев адаптации ex vitro имели сформированные скелетные ветви (от 2 до 6), высота растений составляла от 36 до 59 см. Феноритмы соответствовали растениям открытого грунта: распускание листьев отмечено в апреле, полное облиствление – в мае. Листовые пластины по форме и цвету соответствуют таковым характеристикам растений открытого грунта. Основным отличием является размер листьев: длина листа не превышала 11 см, ширина – 3 см. Хлорозы и некротические пятна выявлены не были. По структурным параметрам: плотности тканей мезофилла, толщине покровных тканей и регуляции устьичной транспирации можно выделить наиболее перспективные гибриды Прогресс × Персей, Baby Gold 7× Никитский Подарок и Loadel × Никитский Подарок, ДБ 97-120. Исследования водоудерживающей способности тканей листа позволили разделить изученный селекционный фонд на две группы: низкая водоудерживающая способность характерна для сорта Никитский Подарок, гибридов Summerglo × Никитский Подарок, Jerseyglo × Никитский Подарок и Персей × Никитский Подарок; высокая – для гибридов отцовского сорта Персей, а также гибридов: Baby Gold 7 × Никитский Подарок, Loadel × Никитский Подарок и ДБ 97-120. Минеральное питание было оптимальным, минимальное количество азота определено у растений с активным ростом. Содержание хлорофилла в листьях составило 22-26 мг/см2, существенно не различалось между изученными генотипами. Количество флаванолов не превышало 0,55 отн.ед., максимально у засухоустойчивых гибридов. Установлено очень низкое содержание антоцианов (у единичных растений гибридов Baby Gold 7 × Персей, Loadel × Никитский Подарок - 0,01 отн.ед.). Установлено, что наиболее эффективно работают ассимиляционные комплексы гибридов Baby Gold 7 × Никитский Подарок, Loadel × Никитский Подарок и ДБ 97-120, Baby Gold 7 × Персей. Фотосинтетическая активность у данных образцов выше, чем у родительских форм в открытом грунте, что указывает на их оптимальное функциональное состояние. Фотоингибирования отмечено не было. Таким образом, изученные растения сортов и гибридных форм персика in vivo демонстрируют оптимальное функциональное состояние, которое нацелено на активный рост и акклиматизацию. Отработан метод криоконсервации меристем персика и абрикоса путем инкапсуляции-дегидратации, который включает в себя ряд этапов. Определены оптимальные параметры подготовки меристем к криосохранению. Удалось сформировать альгинатные шарики для сохранности эксплантов. В результате проведенных исследований был отмечено влияние совместного применения сахарозы в растворе для обезвоживания и продолжительности обезвоживания на выживание и отрастание криосохраненных апексов верхушек побегов изучаемых генотипов абрикоса и персика. После часовой обработки у абрикоса и персика частота замороженных капсул составила 19 и 15%, соответственно, при предварительной обработке 0,75 М сахарозой. При 8-часовом обезвоживании апексов верхушек побегов персика капсулы, содержащие лед, не наблюдались. Тем не менее, для эксплантов абрикоса доля замерзших капсул при 8-часовой дегидратации составила 2,8%. Увеличение концентрации сахарозы в предкультуре и продолжительность обезвоживания увеличивали степень жизнеспособности и отрастания. Наибольший процент жизнеспособности (79,4-86,4%) и частота регенерации (84,5-98,6%) для криосохраненных апексов верхушек побегов абрикоса и персика получены, после предварительной обработки верхушек побегов раствором сахарозы 0,5-0,75 М в течение 2 дней и затем обезвоживали 4 часа, при сохранении 20% влажности в альгинатных шариках. Установлена зависимость жизнеспособности изучаемых эксплантов от культуры и сортовой принадлежности. Разрыв альгинатных шариков с апексами верхушек побегов абрикоса и персика происходил через 7-9 сут после помещения их на свет. В течение недельного культивирования в стандартных условиях криосохраненных эксплантов абрикоса и персика отрастающие побеги были укорочены. Тем не менее, после второго субкультивирования они восстановили нормальную морфологию с аналогичной способностью к размножению по сравнению с некриосохраненными побегами. Несомненно, разрабтанный подход к криоконсервации персика и абрикоса, открывет новын возможности как сохранения генофонда, так и криотерапии от вироидов и вирусных патогенов. Полученные результаты в 2020 г. позволили раскрыть возможности создания толерантных к вирусной инфекции гибридных форм абрикоса и персика в условиях in vitro с участием в скрещивании толерантных сортов при их всестороннем изучении, включая вирусологические, молекулярно-генетические, анатомо-морфологические, физиолого-биохимические методы и применение биотехнологических подходов в размножении и сохранении растений, что подтверждает перспективность и необходимость продолжения исследований в данном направлении. Результаты экспериментов опубликованы в 6 научных работах (в изданиях индексируемых в базах данных Scopus and Web of Science Core Collection) и апробированы на 7 всероссийских и международных конференциях, симпозиумах и конгрессах.

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
В 2021 году продолжалось обследование коллекционных насаждений косточковых плодовых культур ФГБУН «НБС-ННЦ» (центрального и степного) на наличие особо опасных вирусов растений. На листьях сливы (Prunus domestica) сортов Ненька и Улюблена обнаружены типичные симптомы Plum pox virus (PPV). Симптомы PPV были обнаружены на плодах и косточках абрикоса сорта Сальери. Тестирование этих образцов с помощью ИФА и ОТ-ПЦР подтвердило, что растения заражены PPV. Установлено, что изоляты PPV из сортов сливы принадлет к штамму D. Низкие концентрации вируса в листьях абрикоса, продемонстрировали, что возможно данный изолят PPV, принадлежит к новому штамму вируса, который еще слабо приспособлен к новому хозяину. При обследовании коллекционных насаждений косточковых культур Степного отделения НБС-ННЦ выявлены деревья с признаками возможной вирусной инфекции на листьях. Симптомы обнаружены на деревьях сливы сорта Чачакская Самая Лучшая (происхождением из бывшей Югославии), а также межвидовых гибридов абрикоса, алычи и сливы альпийской (форма 87-23), алычи с абрикосом и сливой альпийской, алычи с абрикосом сорта Шлор Циран. Были обнаружены PNRSV и PDV (род Ilarvirus, семейство Bromoviridae), Little cherry virus 1 (LChV 1) (род Velarivirus, семейство Closteroviridae), Cherry virus A (CVA) (род Capillovirus, семейство Betaflexiviridae). Прочтения, родственные LChV1, были обнаружены в образце из межвидового гибрида P. armeniaca x P. cerasifera x P. brigandiaca. В образце в результате метагеномного секвенирования собрался один контиг, покрывающий свыше 99% референсного изолята. Ближайшим родственником российского изолята является греческий изолят из черешни (Prunus avium) (LN794218) [Kassiani et al., 2015], однако идентичность полных геномов этих изолятов составила 77.27%. В GenBank доступно 33 полногеномных последовательностей данного вируса, однако российский изолят очень сильно отличается от них по нуклеотидной последовательности и является самым дивергентным. LChV-1 обнаружен в России впервые. Наряду с этим впервые в России в абрикосе сорта Шлор Циран обнаружен распространенный по всему миру CVA. В настоящее время в GenBank депонировано 88 полногеномных последовательностей длиной 7447 нуклеотидов. Ближайшим родственником российского изолята является канадский изолят (KY510919), геном которого оказался почти полной копией российского изолята. Наряду с этим Иларвирусы (Prunus necrotic ringspot virus и Prune dwarf virus) идентифицированы в образцах сливы сорта Чачакская Самая Лучшая. Результаты работы еще раз подтверждают что диагностированные вирусы проникают в ФГБУН «НБС-ННЦ» в результате ранее проводимой интродукции растительного материала косточковых плодовых культур из различных регионов мира, активному использованию частниками неоздоровленного посадочного материала, многолетнему накоплению данных вирусов на различных растениях-хозяевах и распространения от растения к растению насекомыми-переносчиками. Для оценки генофонда косточковых плодовых культур определяющим является как фенотип, так и генотип. Изучена морозостойкость сортов и форм персика и абрикоса, отобранных в гибридизацию. Показано, что из 10 генотипов персика наибольшую морозостойкость цветковых почек (53,5-77,8% повреждений) при искусственном замораживании при -20°С проявили 2 формы ('Дружба Народов' × 'Бэби Голд-5γс40') 97-120, [('Космический' × 'Ак Шефталю Кесьма 84-107') × 'Товарищ'] 92-2210 и сорт Бэби Голд-7. У абрикоса по морозостойкости выделились 3 формы: 97-11 и 97-6, 97-17. У большинства сортов и форм персика степень цветения была хорошей (4–5 баллов), но у семи сортов и форм она была пониженной (2–3 балла). В группу с раннесредним сроком созревания плодов (26.07–30.07) вошел сорт Никитский Подарок; со средним сроком ( 15.08–20.08) – 6 сортов: Babygold -7, Clyde Wilson, Summerglo, Carolum, Персей, ('Дружба Народов' х 'Бэби Голд-5γс40') 97-120; со среднепоздним (10.09) – сорт Jerseyglo, с поздним (20.09) – форма [('Космический' х 'Ак Шефталю Кесьма 84-107') х 'Товарищ'] 92-2210. По высокой урожайности (19,2-25,4 кг/дер.,128,1-169,7 ц/га) выделено 2 сорта: Никитский Подарок и Loadel. Для Крыма необходимо создавать сорта абрикоса устойчивые к засухе. Среди изучаемых объектов наиболее засухоустойчивыми оказались сорта Harris, Stark Early Orangе, Harlayne, Harcot и формы 93-119, 93-121, 97-17, 97-19, 432. Наиболее крупные плоды (60,5-87,5 г) отмечены у сортов абрикоса SEO, Крымский Амур (к) и 4 селекционных форм (97-6, 97-10, 97-11 и 93-119). По всем исследуемым показателям у абрикоса отобраны 4 селекционные формы 97-6, 97-10, 97-11 и 97-17. Последняя проявила признаки толерантности к воздействию PPV. В настоящее время форма получила название Альдебар и проходит испытание на госсортоучастке. Проведено помологическое описание сортов и форм. Для генотипирования отобрано 54 сорта и формы абрикоса из генофондовой коллекции НБС-ННЦ. Показано, что наиболее перспективными для ДНК-маркерной идентификации локуса PPVres являются маркеры PGS 1.21 и PGS 1.24. Они могут быть использованы как для скрининга коллекций генетических ресурсов в целях выявления потенциально устойчивых форм в коллекциях генетических ресурсов, так и для ведения программ по маркер-опосредованной селекции на устойчивость к PPV. По результатам исследования выявлены сорта селекции НБС-ННЦ, являющиеся донорами локуса PPVres: Сенатор и Романкош, происходяшие из гибридной комбинации Henderson/Harlyne, а также сорт Алустон (SEO/Олимп). Сорта зарубежной селекции Bergarouge, Mandule Kajszi, Betinka, Sophinka, Да-Хуан-Хоу, также являются потенциальными донорами искомого локуса. Разработано два эффективных мультиплексных набора SSR-маркеров, каждый из которых позволяет одновременно вести анализ по четырем маркерам при постановке одной реакции. Анализ генетической структуры изученной выборки по результатам SSR-генотипирования выявил высокий уровень ее гетерогенности. Кроме того, установлен, что сорта селекции НБС-ННЦ представляют собой гетерогенную группу, что обусловлено вовлечением в селекционный процесс широкого перечня сортов из разных эколого-географических групп и из разных регионов мира возделывания абрикоса. Это очевидный положительный факт, свидетельствующий об отсутствии сужения генофонда абрикоса в процессе селекции в Никитском ботаническом саду. На репрезентативной выборке образцов выполнена апробация и валидация ряда CAPS-маркеров локуса PPVres, которые также могут быть использованы для его идентификации. Проведенный CAPS-анализ по четырем маркерам и сопоставление его результатов с данными об аллелях SSR-маркеров, тесносцепленных с локусом PPVres, позволяет говорить об информативности двух типов анализа при их использовании для маркер-опосредованного контроля наличия целевого локус устойчивости к PPV. Сформирована признаковая коллекция персика и абрикоса из сортов – источников, доноров устойчивости и толерантности к вирусным патогенам и представлены паспорта на сорта и формы, устойчивые и толерантных к основным вирусам. В 2021 г. проведена паспортизация трех гибридных форм: (Дружба Народов × Бэби Голд-5 γс 40) 97-120, Ветеран самоопыление, Ветеран × Фаворита Мореттини 80-698. Представлены паспорта на 11 сортов и форм абрикоса, проявляющие признаки толерантности к вирусу шарка сливы или являющиеся потенциальными источниками данного признака. С целью создания ранних сортов с толерантностью к вирусу шарки сливы была продолжена гибридизация. Проверена жизнеспособность пыльцы, используемой для опыления как у персика, так и абрикоса. Количество проросшей пыльцы у персика сорта Никитский Подарок на среде с 15% сахарозой достигало 40,5%. У абрикоса лучшие показатели прорастания пыльцы 43,9% и 16,3% у сорта Bergarouge отмечены в вариантах с раствором 20 и 15% сахарозы. У всех остальных сортов показатель не превышал 11,7%. Полученные гибридные семена были переданы для проведения биотехнологических исследований. Изолированные гибридные зародыши абрикоса от межсортовых скрещиваний ‘Зоркий’ × ‘SEO’, ‘Память о Друге’ × ‘Harcot’, ‘Память о Друге’ × ‘SEO’ были введены в условия in vitro на безгормональную питательную среду Монье и культивировались при пониженной положительной температуре 4°С без освещения в течение 2-3 месяца. При отсутствии холодовой предобработки в большинстве случаев наблюдали аномальное развитие проростков с недоразвитой корневой системой. Зародыши активно прорастали и начинали формировать полноценные проростки через 45-50 сут культивирования. Установлено, что регенерационный потенциал гибридных зародышей ‘Зоркий’ × ‘SEO’, ‘Память о Друге’ × ‘Harcot’, ‘Память о Друге’ × ‘SEO’ составил 90, 90 и 80%, соответственно. Вместе с тем, высокий уровень регенерации адвентивных почек и побегов был получен из пролиферирующих побегов in vitro форм ‘Зоркий’ × ‘SEO’, ‘Олис’ × ‘Bergarouge’ и ‘Сенатор’ × ‘Магистр’. На среде МС, дополненной 1,27 мг/л ТДЗ на семядолях гибридной формы абрикоса ‘Олис’ × ‘Bergarouge’ наблюдали прямой органогенез из сегментов семядолей, что обеспечивает эффективный способ получения регенерантов. В отличии от зародышей абрикоса холодовая предобработка гибридных зародышей персика составила 45-60 сут. Гибридные зародыши ‘ДБ 97-120’ × ‘Никитский Подарок’ и ‘Loadel’ × ‘Никитский Подарок’ показали большее количество сформировавшихся растеньиц как на безгормональной среде Монье (96,30 и 92,59%, соответственно), так и на среде с 0,4 мг/л кинетина + 0,1 мг/л ГК3 (88,89 и 81,48%). У зрелых гибридных зародышей персика изучаемых комбинаций скрещивания в основном наблюдали образование полноценных проростков. Высоким регенерационным потенциалом обладали побеги гибридной формы ‘Loadel’ × ‘Никитский Подарок’ и ‘ДБ 97-120’ × ‘Никитский Подарок’. Продолжалось изучение регенерационного потенциала in vitro 4 гибридных форм персика ‘Clyde Wilson’ × Никитский Подарок’, ‘Jerseyglo’ × ‘Никитский Подарок’, ‘Loadel’ × ‘Никитский Подарок’, ‘Summerglo’ × ‘Никитский Подарок’ скрещивания 2020 г. и гибридными формами от свободного опыления сортов ‘Carolum’, ‘Loadel’, ‘Summerglo’, ‘ДБ 97-120’, ‘Персей’. Высокий регенерационный потенциал отмечен у гибридных форм ‘Loadel’ × ‘Никитский Подарок’, ‘Summerglo’ × ‘Никитский Подарок’ после 3 субкультивирования. У гибридной формы ‘Clyde Wilson’ × ‘Никитский Подарок’ на питательной среде с 1,27 мг/л ТДЗ был индуцирован прямой органогенез из семядолей. Отмечено развитие адвентивных почек и микропобегов из аксиллярных почек сегментов побегов гибридных форм персика от свободного опыления сортов ‘Carolum’, ‘Loadel’, ‘Summerglo’, ‘ДБ 97-120’, ‘Персей’ Полученные in vitro растения прошли поэтапную адаптацию ex vitro и in vivo и выращены в теплице в смеси почва : торф : перлит в соотношении 3:1:1. Дана морфометрическая и физиологическая характеристика полученных гибридных сеянцев. В исследованиях по криотерапии были апробировали методы иссушения для черенков персика сортов ‘Никитский Подарок’, ‘Baby Gold’,‘Loadel’ и витрификации для гибридных форм абрикоса ‘Зоркий × Stark Early Orange’, ‘Память о Друге × Harcot’ и персика – ‘Loadel’ × ‘Никитский Подарок’. Лучшие результаты были получены при акклиматизации побегов абрикоса и персика in vitro в климатической камере при переменных температурах (8 ч при 22°С, интенсивности освещения 10 мкM м-2 с-1/16 ч в темноте при -1°С). Оптимальная длительность закаливания для исследуемых культур составила 3,5-4 недели. Выявлено, что метод витрификации с 0,3 М сахарозой является довольно эффективным. Этот метод позволил получить от 52 до 63% выживших апикальных меристем абрикоса и персика в зависимости от генотипа. Растения из меристем после криотерапии развивались быстро и по морфологии не отличались от контрольных. Разрабатывался протокол элиминации вирусов с использованием криотерапии путем иссушения почек персика сортов ‘Никитский Подарок’, ‘BabyGold’, ‘Loadel’. Показана необходимость применения метода витрификациии с криопротекторами. В результате проведенных опытов по криотерапии меристематических тканей гибридных форм абрикоса ‘Зоркий × SEO’, ‘Память о Друге × Harcot’ и персика – ‘Loadel’ × ‘Никитский Подарок’ в среднем было получено 52-63% выживших апикальных меристем зеленой окраски в зависимости от генотипа. Установлено, что жизнеспособность апикальных меристем после криотерапии у гибридных форм абрикоса ‘Зоркий × SEO’ и ‘Память о Друге × Harcot’ в среднем составляет 67,8 и 62,5%, соответственно. Количество жизнеспособных меристем персика ‘Loadel’ × ‘Никитский Подарок’ было ниже и составило 52,4%. Проводимые нами наблюдения показали отсутствие внешних признаков заражения у культивируемой гибридной формы персика ‘Loadel’ × ‘Никитский Подарок’. Результаты проведенных тестирований с использованием группы праймеров для выявления PNRSV и РРV на примере пораженных растений персика показали отсутствие вирусов PPV и PNRSV в проанализированных образцах персика. С целью выявления изменений в структуре и функционировании листьев новых гибридных форм персика при культивировании in vitro и во время акклиматизации ex vitro и in vivo был проведен ряд анатомических и физиологических анализов листьев гибридных формы персика ('Jerseyglo' × 'Никитский Подарок', 'Loadel' × 'Никитский Подарок', 'Summerglo' × 'Никитский Подарок', 'Clyde Wilson' × 'Никитский Подарок', 'Прогресс' × 'Персей'). Листовые пластинки изученных гибридных форм имеют комплекс общих анатомо-морфологических признаков, характерных для культуры P. persica в целом: дорзовентральный гипостоматический тип листовой пластинки, проводящую систему закрытого коллатерального типа, плотный мезофилл, развитые кутикулярные покровы, наличие кроющих трихом вдоль центральной жилки. При сравнительно одинаковой толщине листа изученных гибридных форм как in vitro, так и при постепенной адаптации ex vitro и in vivo, отмечены различия в толщине эпидермы, палисадного мезофилла, размере межклеточного пространства мезофилла. Максимальной толщиной адаксиальной эпидермы отличаются 'Summerglo' × 'Никитский Подарок' и 'Loadel' × 'Никитский Подарок', в то время как у гибридной формы 'Jerseyglo' × 'Никитский Подарок' абаксиальная эпидерма максимальной толщины. Полученные нами результаты демонстрируют постепенное увеличение содержания хлорофилла от 12-26 μg / cm2 в условиях in vitro к 43-50 μg / cm2 у адаптировавшихся растений. Максимальные значения данного параметра зарегистрированы у растений 'Loadel' × 'Никитский Подарок' (за исключением периода 15-суточной адаптации). Эффективная активная работа фотосистемы II в период 60 суток культивирования in vivo дает основания заключить о полноценном функционировании листового аппарата гибридных форм персика, накоплении необходимой фитомассы и возможности высаживать полученные саженцы в открытый грунт. Процессов фотоингибирования отмечено не было, что позволяет судить о нормальном функционировании гибридных форм персика на всех этапах размножения и о разработке оптимального протокола получения растений in vitro для последующего использования в садоводстве. Перед высадкой в открытый грунт в среднем растения характеризовались высотой 43,4 см., диаметром штамба 4,2 см., длиной междоузлий 1,5 см. и развитой стержневой корневой системой. Их высаживали сначала в парники открытого грунта и, затем, пересаживали в селекционный сад. Таким образом, изучен генофонд ФГБУН "НБС-ННЦ" персика и абрикоса, выявлены основные вирусы, поражающие косточковые плодовые культуры, разработана биотехнологическая система получения гибридных форм персика и абрикоса, часть из которых могут быть перспективными для дальнейшей селекции на устойчивость и толерантность к наиболее опасным вирусным заболеваниям. Показаны возможности криосохранения меристем и вегетативных почек, а также криотерапии исследуемых культур. Описаны морфометрические и физиологические параметры полученных гибридных форм. Гибридные формы переданы для дальнейшего изучения в селекционерам. Результаты экспериментов в 2021 г. опубликованы в 7 научных работах, из них 4 публикации в изданиях индексируемых в базах данных Scopus and Web of Science Core Collection, одна из которых в журнале Q1 и апробированы на 7 всероссийских и международных конференциях, симпозиумах и конгрессах.