Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Клетки скелетной мускулатуры мыши С2С12 были получены из Российской коллекции клеточных культур Института цитологии РАН (Санкт-Петербург, Россия). Дифференцированные миотубулы С2С12 промывали фосфатно-солевым буфером (PBS) и помещали их в 3 мл среды дифференцировки, содержащей дополнительные компоненты. В некоторых экспериментах миотубулы подвергались электростимуляции (EPS) с использованием пульсового генератора C-Pace (C-Pace EP, IonOptix, USA) при 37°С в режиме 40 V, 10 ms, 1Hz. Жизнеспособность клеток оценивали с помощью Alamar Blue. Для оценки действия EPS на трансмембранные потоки одновалентных катионов мы использовали Rb+ и Li+ в качестве аналогов K+ и Na+ соответственно. Внутриклеточное содержание Na+, K+, Rb+ и Li+ определяли с помощью метода атомно-абсорбционной спектрометрии. Для изучения роли генов раннего ответа (immediate response genes, IRGs) и циклооксигеназы второго типа (СОХ2) в секреции миокинов при электростимуляции клеток скелетной мускулатуры были выполнены эксперименты с использованием малых интерфирирующих РНК (siRNA). Для исследования влияния динамических и статических нагрузок на содержание внутриклеточного Na+ и K+i в клетках скелетной мускулатуры контрольных и предварительно тренированных мышей были выполнены эксперименты in vivo. EPS в течение 4 часов приводит к 2-кратному увеличению содержания Na+i и уменьшению К+i. Инкубация с 10 мкМ уабаина не влияет на базовый уровень содержания одновалентных катионов, но почти на треть увеличивает соотношение [Na+]i/[K+]i, вызванное EPS. Эти результаты позволяют предположить, что EPS увеличивает относительный вклад α2-Na,K-ATPазы в поддержание трансмембранного градиента Na+ и K+. Действительно, активность α2-Na,K-ATPазы в миотубулах С2С12, определенная по входу в клетки Rb+ в присутствии 10 мкМ уабаина, возрастает в результате EPS с 19±21 до 73±24 нмоль/мг белка/10 мин. Напротив, полное ингибирование обеих изоформ Na,K-ATPазы по действием 3 мкМ уабаина приводит почти к 3-кратному снижению входа Rb+ как в контроле, так и в миотубулах, подверженных EPS . EPS увеличивает активность NKCC, которую мы определяли как уабаин-резистентную и буметанид-чувствительную компоненту внутриклеточного входа Rb+. На фоне буметанида 2000 мкМ фуросемида не оказывало влияния на вход Rb+, что говорит о несущественной активности K,Cl-котранспорта, направленного внутрь клетки. Ни буметанид, ни фуросемид не оказывают влияния на внутриклеточное содержание Na+ и K+ в контроле, а также на изменение [Na+]i/[K+]i-соотношения в С2С12, опосредованного действием EPS. 1 мкМ амилорида не влиял на увеличение [Na+]i и уменьшение [K+]i, вызванное действием EPS, однако эффект электростимуляции на диссипацию градиента одновалентных катионов устранялся в присутствии 1000 мкМ амилорида. Эти данные позволяют предположить существование в С2С12 каналов с низким сродством к амилориду. Данные, полученные нами в ходе исследования, позволяют сделать три важных вывода. Во-первых, диссипация трансмембранных градиентов Na+ и K+ в С2С12, подвергнутых действию EPS, происходит в основном за счет активации тетродотоксин-чувствительных потенциал-зависимых Na-каналов (NaV) и харибдотоксин-чувствительных K-каналов большой проводимости (BKCa). Во-вторых, EPS приводит к активации α2-Na,K-ATPазы, работа которой подавляет диссипацию градиента одновалентных катионов, опосредованную активацией потенциал-чувствительных Na- и Ca-активируемых К-каналов. Это заключение поддерживается тем фактом, что в присутствии 10 мкМ уабаина увеличение соотношения [Na+]i/[K+]i, опосредованное действием EPS, происходит в большей степени, т.е. ингибирующий эффект 10 мкМ уабаина усиливается в случае миотубул, подвергнутых EPS. В третьих, данные, полученные с использованием буметанида и фуросемида свидетельствуют о том, что в С2С12 присутствуют каналы, активируемые высокими концентрациями амилорида. Нельзя также исключить, что высокие концентрации амилорида, влияющие на активность протеинкиназ, могут через эти протеинкиназы подействовать на проводимость существующих амилорид-чувствительных каналов или переносчиков. Ранее было показано, что ингибирование α1-изоформы Na,K-ATPазы уабаином изменяет экспрессию генов посредством увеличения внутриклеточного соотношения [Na+]i/[K+]i. Мы сравнили изменения транскриптома при действии разных концентраций уабаина в нейронах, которые обогащены α3-изоформой Na,K-ATPазы, имеющей более высокое сродство к уабаину (на 4 порядка выше, чем у α1-изоформы). Ингибирование α1- и α3-Na,K-ATPазы в присутствии 1 мМ уабаина приводило к диссипации трансмембранного градиента Na+ и K+ и экспрессии 994 транскриптов, в то же время селективное ингибирование α3-Na,K-ATPазы под действием 100 нМ уабаина изменяло экспресию 114 транскриптов, не влияя при этом на соотношение [Na+]i/[K+]i. Среди генов, экспрессия которых изменялась при действии 1 мМ уабаина более чем в 2 раза, обнаружены участники сигнальных каскадов, регуляторы транскрипции, включая Npas4, Fos, Junb, Atf3 и Klf4, увеличение экспрессии которых показано при электрической и глутаматной стимуляции нейронов. Показано, что как динамическая (1 час плавания), так и статическая (40 мин виса на сетке) приводили к 2-х кратному увеличению содержания Na+i, уменьшению содержания K+i на 25-35% и 3-4-х кратному увеличению соотношения Na+i/K+i. Действие динамической и статической нагрузок на эти параметры сохранялась у мышей, подвергнутых регулярной тренировке в виде плавания или вис на сетке в течение 4 недель по 1 часу в день. Полученные результаты позволяют рассматривать диссипацию трансмембранных градиентов натрия и калия при физической нагрузке как фактор регуляции функциональной активности скелетной мускулатуры, включая обнаруженные ранее изменения транскрипции и трансляции миокинов.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Изучен характер изменения внутриклеточной концентрации Са2+ при электростимуляции клеток С2С12. Показано, что добавление хелатора ВАРТА существенно снижает уровень Са2+ внутри клеток. Однако электростимуляция даже в отсутствие хелатора снижает уровень Са2+ в клетках С2С12 в большей степени, сравнимой с уровнем, который наблюдается в присутствие блокатора Na-насоса уабаина. Изучена роль интермедиатов сигнального каскада, запускаемого увеличением концентрации внутриклеточного Са2+ при изменении внутриклеточного соотношения [Na+]i/[K+]i. В контроле ингибитор кальмодулин-зависимой протеинкиназы II KN-62 практически не оказывает влияния на содержание ионов натрия и калия в клетках С2С12, в то время как другой блокатор той же протеинкиназы KN-93 достоверно снижает уровень натрия в клетке (примерно на 30%), не влияя на уровень калия. Так же действует в контроле и циклоспорин А (ингибитор кальцинейрина). По-видимому, это свидетельствует о том, что при подавлении кальмодулин-зависимой протеинкиназы II или кальцинейрина активируется либо Na,K-АТPаза, либо другие натриевые переносчики, увеличивающие выход натрия из клетки. Предположение об активации Na,K-АТРазы подтверждается данными о том, что эффекты KN-93 и циклоспорина слабо выражены в среде с уабаином. Ингибитор митоген-активируемой протеинкиназы ERK (PD98059) не оказывал влияния на содержание в клетке Na+ во всех трех случаях (контроль, EPS и уабаин). Однако на фоне уабаина обнаружено достоверное увеличение содержания К+ в клетках С2С12 под действием никардипина. Это позволяет предполагать, что Са2+, входящий в клетку, подавляет выход из нее К+. Изучена роль генов раннего ответа (immediate response genes, IRGs) и циклооксигеназы второго типа (СОХ2) в секреции миокинов при электростимуляции клеток скелетной мускулатуры. В проведенных экспериментах нам удалось несколько снизить экспрессию трех генов: Fos, PTGS2 и Erg2. Однако эти результаты статистически недостоверны. Итак, несмотря на длительный и тщательный подбор условий эксперимента (изменение концентрации siRNA в растворе, с которым инкубировали клетки, изменение содержание липофектамина, необходимого для проведения трансфекции и их соотношение в комплексе siRNA – липид, а также времени проведения трансфекции), мы не смогли вызвать нокдаун этих генов. Есть несколько возможных объяснений того, почему нам не удалось добиться успешной трансфекции. Одна из причин заключается в том, что siRNA не проникали в клетку. Возможно, для этого требовалось проведение электропорации либо использование аденовирусных конструкций. Кроме того, возможно, была использована не совсем удачная система оценки успешности нокдауна. Для этого можно было использовать и другие методы, которые могли бы дать более наглядный результат при использовании siRNA, меченой флуоресцентной меткой (например, проточная цитометрия). Выполнено исследование по оценке повреждения сарколеммы после многократного применения электрических стимулов. Полученные значения AMP соответствовали положительному контролю с искусственно проницаемыми мембранами, а контрольное значение соответствовало отрицательному контролю без искусственной проницаемости или эффектов, вызванных EPS. Следовательно, если показатели предложенной модели проницаемости мембраны для тестовой группы не находятся в пределах между показателями групп положительного и отрицательного контроля, значение AMP ниже 0 или выше 1 может быть получено в первом случае, наблюдаемом в электростимулируемых миотубулах, полученных из клеток C57BL / 10ScSnJ. Эффекты ЭПС на мышечные трубки, полученные из клеток C57BI / 10ScSnJ, включают уменьшение включения ядерных пятен по сравнению с таковым у нестимулированного контроля. Наблюдаемые эффекты могут быть объяснены измененным транспортом красителя, который может зависеть от мембранного потенциала, внутриклеточных концентраций Na + / K + и мембранного градиента. Кроме того, было показано, что изменения мембранного потенциала, то есть деполяризация, исследуемая по изменениям внеклеточной концентрации K + и Cl ~, влияют на жесткость эндотелиальной мембраны, измеренную с помощью атомно-силовой микроскопии в течение нескольких минут после воздействия, что можно объяснить кортикальной сеткой актина и влиянием мембранного потенциала на полимеризованное состояние кортикально расположенных актиновых филаментов. Исследована взаимосвязь динамики содержания одновалентных катионов в скелетных мышцах экспериментальных животных и содержания миокинов при статических и динамических нагрузках. Для этого у экспериментальных животных (мышей) выполнятся определение содержания миокинов в гомогенате скелетных мышцах методом ИФА и концентрации натрия и калия в мышечных клетках методом атомной спектрофотометрии после статических и динамических физических нагрузок различной интенсивности. Во всех группах тренированных и нетренированных животных при статической и динамической нагрузках наблюдается увеличение уровня IL-6 спустя 24 часа. Это может свидетельствовать о запуске продукции белков внутри скелетной мышцы. При однократным динамической нагрузке происходит постепенное увеличение IL-15, при хронической нагрузке прирост IL-15 происходит значительно быстрее: спустя один час, а затем спустя 24 часа. При статической нагрузке происходит значительное увеличение уровня IL-15 как при однократной нагрузке, так и при хронической.Уровень LIF постоянен у тренированных мышей как при статической нагрузке, так и при динамической нагрузке, причём при статической нагрузке концентрация его выше. Это может свидетельствовать о том, что статическая нагрузка в большей степени приводит к пролиферации клеток миобластов и гипертрофии скелетных мышц. Уровень CXCL1 выше в группах как тренированных, так и нетренированных животных при статической физической нагрузке. CXCL1, относящийся к классу CXC принимает участие в процессах ангиогенеза, пролиферации, следовательно, статическая нагрузка в большей степени влияет на продукцию данного хемокина. Показано, что как динамическая (1 час плавания), так и статическая (40 мин виса на сетке) приводили к 2-х кратному увеличению содержания Na+i, уменьшению содержания K+i на 25-35% и 3-4-х кратному увеличению соотношения Na+i/K+i. Действие динамической и статической нагрузок на эти параметры сохранялась у мышей, подвергнутых регулярной тренировке в виде плавания или вис на сетке в течение 4 недель по 1 часу в день. Полученные результаты позволяют рассматривать диссипацию трансмембранных градиентов натрия и калия при физической нагрузке как фактор регуляции функциональной активности скелетной мускулатуры, включая обнаруженные ранее изменения транскрипции и трансляции миокинов. Заключительная серия исследований была посвящена оценке физиологических эффектов миокинов у людей с различной степенью физической подготовленности. Для этого изучалось влияние однократной физической нагрузки на концентрацию эндотелиальной NO-синтазы и фактора активации тромбоцитов в плазме крови у спортсменов, тренирующихся в циклических и силовых видах спорта и у нетренированных волонтеров, а так же на характер эндотелий-зависимой вазодилатации у мужчин с различным уровнем физической активности. В группе со средним уровнем двигательной активности наблюдается выраженная вазодилатация плечевой артерии после окклюзионной пробы: до физической нагрузки на 13,6%, после физической нагрузки на 17%. В группе отмечается нормальная реакция на пробу с реактивной гиперемией. Физическая нагрузка способствовала усилению функции эндотелия, что можно рассматривать как положительный эффект динамической физической нагрузки на сосудистую систему. Группа с высоким уровнем двигательной активности и группа спортсменов характеризуется неадекватной реакцией на пробу с реактивной гиперемией. В группе тяжелоатлетов до физической нагрузки не произошло изменения диаметра плечевой артерии, а после физической нагрузки диаметр артерии уменьшился на 5,3%, вследствие сужения кровеносных сосудов и, таким образом, уменьшения скорости кровотока. В группе легкоатлетов до физической нагрузки диаметр плечевой артерии увеличился на 2,9%, а после физической нагрузки произошло незначительное расширение сосуда на 4,7%. Расширение сосудов, посредством усиленного образования сосудорасширяющих веществ клетками тканей, происходит вследствие парциального давления кислорода, кровоток ускоряется с увеличением потребности кислорода. У контрольной группы была зарегистрирована концентрация eNOS 4,96±0,72 ng/ml, что достоверно выше данного показателя в обеих группах спортсменов. Одновременно в данной группе мы фиксируем максимальный прирост данного показателя сразу после физической нагрузки и сохранение его на неизменном уровне в течении часа. У спортсменов обеих групп концентрация eNOS в покое была достоверно ниже – в два раза ниже у легкоатлетов и в 4 раза ниже у тяжелоатлетов. У спортсменов группы ЛА после физической нагрузки регистрировался прирост концентрации eNOS в 2,5 раза, через час она снижалась примерно на 30%. У тяжелоатлетов мы, напротив, отмечали тенденцию к снижению концентрации eNOS в плазме после нагрузки, которая через час возвращалась к исходным значениям. https://www.babr24.com/tmk/?IDE=207203 http://www.sib-science.info/ru/heis/stati-20122019 https://tomsk.bezformata.com/listnews/universitete-startovala-aktciya-po-smartwalk/88550119/ https://tv2.today/News/Tgu-zapustil-podkast-bot-dlya-umnyh-progulok-davay-peshkom?utm_source=yxnews&utm_medium=desktop