КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер 16-15-00298

НазваниеРазработка и изучение биологического действия костно-пластического отверждаемого композитного материала с заданной кинетикой высвобождения индукторов неоостеогенеза

РуководительКулаков Анатолий Алексеевич, Доктор медицинских наук

Организация финансирования, регион федеральное государственное бюджетное учреждение Национальный медицинский исследовательский центр "Центральный научно-исследовательский институт стоматологии и челюстно-лицевой хирургии" Министерства здравоохранения Российской Федерации, г Москва

Период выполнения при поддержке РНФ

2019 г. - 2020 г.

Конкурс Конкурс на продление сроков выполнения проектов, поддержанных грантами Российского научного фонда по приоритетному направлению деятельности Российского научного фонда «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований по приоритетным тематическим направлениям исследований» (11).

Область знания, основной код классификатора 05 - Фундаментальные исследования для медицины, 05-405 - Регенеративная медицина

Ключевые словаКостно-пластический материал, регенерация костной ткани, хитозан, полилактид, BMP-2, композитный материал, остеоиндукция, остеокондукция, морфометрия, цитосовместимость, биодеградация.

Код ГРНТИ76.09.29

СтатусУспешно завершен

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Большое количество нозологий в стоматологии, челюстно-лицевой хирургии, ортопедии и травматологии сопровождаются обширным дефицитом костной ткани, что обуславливает потребность в остео-пластических материалах, обеспечивающих органотипическую регенерацию в зоне костных дефектов. Несмотря на обилие материалов для восстановления костной ткани, самым эффективным вариантом лечения таких заболеваний является трансплантация аутогенной костной стружки, применение которой предполагает формирование дополнительного операционного поля, что сопровождается болевыми ощущениями, потерей крови, развитием гематом, риском инфицирования, а также требует использования барьерных мембран и армирующих конструкций. Настоящий проект является логическим продолжением проекта 2016 года и направлен на создание и изучение физико-химических и медико-биологических свойств композитного костно-пластического материала с выраженными остеоиндуктивными свойствами для обеспечения гистотопической регенерации при нозологических формах, связанных с дефицитом костной ткани. В состав материала, разработанного в ходе выполнения проекта 2016 года, состоящего из хитозанового гидрогеля и гранул полилактида и хитозан, вместо rhBMP-2 будет включена плазмидная конструкция, содержащая ген этого белка. Замена рекомбинантного BMP-2 на генные конструкции позволит увеличить эффективность разработанного композитного материала, при этом избегая нежелательного избыточного формирования или, напротив, резорбции костной ткани, которое может являться следствием неправильного подбора терапевтической дозы rhBMP-2 [Kanatani и др., 2009; Kaneko и др., 2000; Yabe, Samuels, Schwartz, 2002; Yanagisawa и др., 2001]. Доставка таких плазмид в остеопрогениторные клетки, мигрирующие в область костного дефекта, позволит обеспечить экспрессию функционально активного белка BMP-2 в течение нескольких дней с целью коммитирования резидентных предшественников в остеогенном направлении. Подход, основанный на использовании плазмидных векторов, обеспечивает безопасную транзиентную трансфекцию, исключающую встраивание генетического материала в геном клетки хозяина. Компоненты конструкции будут выбраны с целью обеспечения эффективной трансфекции клеток. Кроме того, плазмиды более устойчивы к условиям внешней среды, чем BMP-2, который является паракринной молекулой-сигнализатором с малой дистантностью действия. То есть замена BMP-2 на плазмидный вектор с его геном позволит упростить требования к хранению готового материала, а также существенно снизит стоимость препарата, что будет способствовать удобству его применения и широте распространения, как коммерческого препарата. Развитие проекта предполагает решение новых научных задач, направленных на обеспечение эффективного проникновения плазмид в остеопрогениторные клетки, мигрирующие в область дефекта, с целью локальной контролируемой экспрессии BMP-2 на уровне, достаточном для инициации дифференцировки камбиальных клеток костного дифферона. Материал будет обладать удобными манипуляционными характеристиками – пластичностью, способностью принимать требую форму в зависимости от геометрии дефекта – эти свойства проектируемого материала уже были отработаны в ходе выполнения проекта 2016 года. В работе будет использована плазмидная конструкции pCDNA3.1, в которую будет вставлена открытая рамка считывания (ORF) полноразмерного человеческого BMP2. В условиях in vitro на клеточных моделях остеогенных предшественников и других культурах будут подобраны условия трансфекции клеток с применением поликатионных агентов (полиэтиленэмина). Для оценки эффективности будет использована плазмида с геном репортерного белка EGFP. Разработанная в ходе выполнения проекта 2016 года методика получения материала будет адаптирована для иммобилизации плазмидных конструкций - они будут включены в структуру хитозановых и/или полилактидных частиц и самого хитозанового геля. На культурах МСК МСК будет оценена эффективность остеогенной дифференцировки при добавлении плазмиды с геном BMP-2. Будут использованы электронная (сканирующая) и световая, в том числе флуоресцентная микроскопия, методы ПЦР-анализа для определения уровня экспрессии генов транскрипционных факторов и маркеров остеогенеза, иммуноферментный анализ для исследования продукции белков. В ходе экспериментов in vivo на лабораторных животных будет дана оценка эффективности готовой композиции проектируемого материала в целостном организме. Для этого на модели эктопического остеогенеза у крыс при подкожном/внутримышечном введении будет произведена оценка неостеогенеза и воспаления с использованием современных подходов к гистоморфометрии. Ортотопический остеогенез будет показан на модели критического дефекта теменных костей. Оценка эффективности трансфекции будет произведена путем выявления клеток, экспрессирующих EGFP при трансфекции модельной векторной системой. Результаты экспериментальных исследований будут являться подтверждением эффективности разработанного материала для регенерации костной ткани и послужат основанием для проведения полномасштабных доклинических, а в перспективе и клинических исследований в соответствии с требованиями Минздрава России, с целью регистрации нового генно-терапевтического препарата для восстановления костных дефектов.

Ожидаемые результаты
1. Будут разработаны условия эффективной трансфекции клеточных культур остеогенных предшественников плазмидными конструкциями с геном BMP-2, обеспечивающие безопасную транзиентную доставку гена в клетки и экспрессию BMP-2 в терапевтических количествах, достаточных для инициации остеогенной дифференцировки клеток культур МСК 2. Будут выбраны методы импрегнации плазмидными конструкциями с BMP-2 компонентов материала, разработанного в ходе выполнения проекта 2016 года – хитозановых гранул, полилактидных гранул и непосредственно хитозанового геля с целью обеспечения пролонгированного высвобождения плазмид, способных инициировать остеогенную дифференцировку. Проектируемые материалы будут иметь форму пластилина, отверждаемого при температуре внутренней среды организма. 3. В процессе исследований in vivo будет оценена биологическая эффективность проектируемого костно-пластического материала. Будет изучена эффективность трансфекции имплантированными плазмидными конструкциями (с EGFP) резидентных костных прогениторов, мигрирующих в область костного дефекта. Будут подробно изучены остеоиндуктивные и остеокондуктивные свойства материала, его гистосовместимость, способность к сохранению формы и полной резорбции в процессе замещения костной тканью. С учетом результатов биологических испытаний будет оптимизирован состава и свойства композиционного материала. Разработанный костно-пластический материал повысит эффективность костных пластик и реконструктивныхопераций, связанных с восполнением твёрдых тканей, в стоматологии, челюстно-лицевой хирургии и ортопедии. Остеоиндуктивные свойства материала наделяют его конкурентными преимуществами по сравнению с существующими препаратами: отсутствие необходимости забора аутогенных транспплантатов позволит снизить травматичность операций и ускорит реабилитацию пациента, что в свою очередь сократит время нетрудоспособности и уменьшит экономические потери при реабилитации пациента. Запланированные результаты приведут к созданию нового ген-активированного материала, сочетающего в себе свойства выраженной остеоиндуктивности, пластичности и способности термоотверждаться. Материал с таким комплексом свойств является новым в мировой практике.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Cконструированы плазмидные конструкции, несущие целевой ген BMP-2, (pcDNA3, TaqRFP-NN1 и fusion TaqRFP-Nk-2F) и экспрессирующие флуоресцентные белки (pEGFP-C1 и TaqRFP-N). На основе результатов сравнение трансфицирующих агентов липофильной и поликатионной природы выбран реактив TurboFect, как наиболее эффективный и наименее токсичный. Определен оптимальный протокол трансфекции – инкубация адгезированных ММСК с трансфицирующими комплексами (2мкг peGFP-C1 + 4мкл TurboFect) в культуральной среде с 5% ЭТС в течение 1 часа с дальнейшей отмывкой. Показано, что ММСК эффективно мигрируют в материалы на основе хитозана с различной степенью деацетилирования: 15%, 25%, 40% и 70%. При это наблюдается эффективная трансфекция трансфекция ММСК плазмидными конструкциями с референсным геном, импрегнированными в материал. Показано, что наиболее предпочтительны материалы со степенью деацетилирования 25%. При подкожной имплантации крысам также было показано, что снижение степени деацетилирования хитозана снижает таксис лейкоцитов в область имплантации хитозана, т.е. устраняет причины развития острого экссудативного воспаления. На основании данных ПЦР-анализа и окрашивания очагов минерализации ализариновым красным показано остеогенное действие хитозановых материалов, импрегнированных плазмидными конструкциями с геном BMP-2. Исследования реологических и физико-механических свойств хитозанов гидрогелей показали значительное снижение модулей упругости гидрогелей вследствие падения растворимости хитозана и возможности образования комплексов при снижении степени деацетилирования. При наполнении гидрогелей на основе коллагена пористыми гидрофобными полилактидными частицами с последующим гелеобразованием, связанным с изменением pH раствора, позволяет увеличить модуль упругости коллагенового гидрогеля с 80 кПа до 400-600 кПа при доле пористых частиц 12-15 %, и до 1,8 Мпа при наполнении 20-25 % частиц. Основные положения о предыдущих достижениях проекта были опубликованы в журнале «Коммерсантъ»: https://www.kommersant.ru/doc/4172756

Публикации

1. А.В. ВАСИЛЬЕВ, В.С. КУЗНЕЦОВА, Т.Б. БУХАРОВА , Ю.Д. ЗАГОСКИН, Г.Е. ЛЕОНОВ, Т.Е. ГРИГОРЬЕВ, С.Н. ЧВАЛУН, Д.В. ГОЛЬДШТЕЙН, А.А. КУЛАКОВ Повышение биосовместимости хитозановых гидрогелей с перспективой их использования в качестве основы для костнопластических материалов в стоматологии Стоматология, №98 (6 вып. 2), стр.12-18 (год публикации - 2019) https://doi.org/10.17116/stomat20199806212

2. Т.Е. Григорьев, Ю.Д. Загоскин, С.В. Крашенинников, Е.О. Осидак, А.В. Васильев, Т.Б. Бухарова, В.С. Кузнецова, С.П. Домогатский, Д.В. Гольдштейн, С.П. Чвалун, А.А. Кулаков Porous polylactide microparticles as effective filler of collagen hydrogel Journal of Applied Polymer Science, - (год публикации - 2020)

3. Бухарова Т.Б., Галицына Е.В., Васильев А.В., Гольдштейн Д.В., Кулаков А.А. Генная терапия костных дефектов при использовании генетических конструкций, несущих ген костного морфогенетического белка-2 (BMP-2) Гены и клетки, - (год публикации - 2020)

4. Васильев А.В., Кузнецова В.С., Бухарова Т.Б., Григорьев Т.Е., Загоскин Ю. Д., Галицына Е.В., Фатхудинова Н.Л., Бабиченко И.И., Чвалун С.Н., Гольдштейн Д.В., Кулаков А.А. Osteoinductive potential of highly porous polylactide granules and Bio-Oss impregnated with low doses of BMP-2 IOP Conference Series: Earth and Environmental Science, - (год публикации - 2020)

5. - Чем заменить кость Российский регенеративный материал нового поколения включает хитозан Коммерсантъ, Коммерсантъ. Наука от 27.11.2019, 22:53 (год публикации - )

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
При сравнении трансфекционных агентов для доставки плазмид на основе катионных полимеров было показано, что TurboFect эффективнее, чем Polyethylenimine (PEI) способствует проникновению плазмид в ММСК, а также обеспечивает наименьшее цитотоксическое воздействие на клетки. При подкожной имплантации крысам материалов, импрегнированных полиплексами на основе TurboFect с pEGFP-C1, через 14 суток наблюдается значительная продукция EGFP в области имплантации, что подтверждает эффективную трансфекцию in vivo. При этом признаков выраженного острого и хронического воспаления не выявлено. При исследовании остеоиндуктивных свойств материалов in vitro было показано, что более высокий уровень экспрессии целевого гена BMP2, маркеров остеогенной дифференцировки и минерализации внеклеточного матрикса может быть достигнут при использовании плазмиды TaqRFP-N-BMP2 по сравнению с pcDNA3-BMP2. При наполнении полилактидными гранулами гидрогелей на основе хитозана с увеличением концентрации частиц возрастает модуль упругости материалов. Однако, чрезмерное заполнение гидрогеля гранулами PLA более 15% приводит к разрушению материала при деформации ~ 10%. Поэтому в качестве основы для материала был выбран состав, содержащий 12 мас.% гранул. Снижение степени деацетилирования хитозана существенно не меняет механические свойства композита. Цитотоксичность хитозан-глицерофосфатных гидрогелей повышается по мере повышения степени деацетилирования хитозана. Материал со степенью деацетилирования 39% практически не оказывает цитотоксического воздействия, а при 65% деацетилирования наблюдается значительная клеточная гибель. Включение 10-16 масс.% высокопористых полилактидных гранул в состав хитозан-глицерофосфатного гидрогеля приводит к увеличению жизнеспособности клеток. In vitro показано, что более выраженное остеоиндуцирующее действие на культуру ММСК оказывает материал, импрегнированный плазмидными конструкциями с геном BMP2, на основе хитозана с более высокой степенью деацетилирования. Хитозановый гидрогель с высокопористыми полилактидными частицами, импрегнированный полиплексами (2000 мкл/мл TF + 1000 мкг/мл TaqRFP-N-BMP2), обладает способностью инициировать неоостеогенез как в области костного дефекта, так и в моделях гетеротопического остеогенеза при имплантации под кожу и в мышцу. Материал не вызывает выраженного воспалительного ответа при имплантации. Объём новообразованной костной ткани при имплантации материала в область критического дефекта костей черепа составлял около 22±9% от общего объема материала на 28 сутки, что свидетельствуют о достаточно высокой эффективности полученного материала, которая зависит от концентрации полиплексов и может быть повышена за счет увеличения их дозы.

Публикации

1. Васильев А.В., Кузнецова В.С., Бухарова Т.Б., Григорьев Т.Е., Загоскин Ю.Д., Недорубова И.А., Бабиченко И.И., Чвалун С.Н., Гольдштейн Д.В., Кулаков А.А. Influence of chitosan deacetylation degree and BMP-2 concentration on biocompatibility and osteogenic properties of BMP-2/PLA-granules loaded chitosan/glycerophosphate hydrogels Molecules, - (год публикации - 2021)

2. Недорубова И.А., Бухарова Т.Б., Васильев А.В., Сячина М.А., Гольдштейн Д.В., Кулаков А.А. Comparative study of BMP-2 gene delivery to Human adipose tissue-derived mesenchymal stem cells with Turbofect and Polyethylenimine IOP Conference Series: Materials Science and Engineering, - (год публикации - 2021)

3. Недорубова И.А., Бухарова Т.Б., Загоскин Ю.Д., Васильев А.В., Григорьев Т.Е., Мокроусова В.О., Чвалун С.Н., Гольдштейн Д.В., Кулаков А.А. Development of osteoplastic material impregnated with plasmid encoding bone morphogenetic protein-2 Biotekhnologiya, Volume 36, Issue 4, Pages 59-64 (год публикации - 2020) https://doi.org/10.21519/0234-2758-2020-36-4-59-64

4. Васильев А.В., Кузнецова В.С., Бухарова Т.Б., Григорьев Т.Е., Загоскин Ю.Д., Короленкова М.В., Зорина О.А., Чвалун С.Н., Гольдштейн Д.В., Кулаков А.А. Development prospects of curable osteoplastic materials in dentistry and maxillofacial surgery HELIYON, Том: 6 Выпуск: 8 (год публикации - 2020) https://doi.org/10.1016/j.heliyon.2020.e04686

Возможность практического использования результатов
Разработанный костно-пластический материал на основе плазмидных конструкций с геном BMP-2 может существенно повысить эффективность костных пластик и реконструктивных операций, связанных с регенерацией костной ткани, в стоматологии, челюстно-лицевой хирургии и ортопедии. Остеоиндуктивные свойства материала наделяют его конкурентными преимуществами по сравнению с существующими препаратами: отсутствие необходимости забора аутогенных транспплантатов позволит снизить травматичность операций и ускорит реабилитацию пациента, что в свою очередь сократит время нетрудоспособности и уменьшит экономические потери при реабилитации пациента.