Аннотация результатов, полученных в 2019 году
За 2019 год выполнения гранта РНФ №16-15-00086-П были подобраны условия введения клеточной культуры (кратность, концентрация, режим кондиционирование) для пролонгирования сроков отторжения кожного лоскута. Было показано, что использование кондиционирование может неспецифически пролонгировать эффект дендритных клеток, трансфицированных плазмидой, кодирующей IL-10, не влияя на антиген-специфический механизм предупреждения отторжения кожного лоскута. Увеличение кратности введения с 1 до 4 раза клеточной культуры без кондиционирования, при сравнении с результатами полученные ранее в рамках проекта РНФ №16-15-00086, приводило к увеличению сроков приживления на 5 дней в группах ДК0, ДК+p5, ДК+pIL-10, ДК+pGVHD+pIL-10, и на 7 дней в группе ДК+pGVHD. В аналогичных группах, при однократном введении 1млн. клеток (как ранее показано) увеличение сроков отторжения не превышало 3 суток. Исходя из полученных результатов, можно сделать вывод, что для пролонгирования сроков отторжения кожного лоскута рекомендуются использовать многократное введение (4-х кратное) клеточной культуры в концентрации 1 млн. клеток/мышь; использование режима кондиционирования имеет потенциал пролонгирования сроков отторжения кожного лоскута за счет индукции неспецифической толерантности, реализуемой посредством эффектами плазмидой, кодирующей IL-10, трансфицированной в полученные дендритные клетки, но не влияет на антиген-специфическую толерантность (в группах ДК+pGVHD). Была создана генетическая конструкция, экспрессирующая рецептор хемокина CCR9, и оценена экспрессия CCR9 на поверхности дендритных клеток, трансфицированных данной ДНК-конструкцией. Результаты показали, что разработанная ДНК-конструкция, кодирующая мышиный CCR9, при ее электропорации позволяет увеличить количество ССR9 экспрессирующих B220+ пДК костного мозга мышей с 11,2% (электропорация без плазмиды) до 39,6% (электропорация плазмидой в концентрации 6мкг/мл), что делает ее пригодной для дальнейших экспериментов по стимуляции миграции дендритных клеток в тимус. Был разработан подход индукции плазмоцитоидных дендритных клеток у мышей из клеток костного мозга в присутствии Flt3-L, для которого была подобрана оптимальная концентрация, и сроки культивирования для наибольшего количества получения плазмоцитоидных дендритных клеток. Было показано, что абсолютное количество клеток в культуре на 7 сутки значимо выше в сравнении с получаемым количеством клеток в культуре на 5 сутки. Значимых отличий в количестве получаемых клеток на 7 и 9 сутки обнаружено не было. Характеристика дендритных клеток, культивируемые в присутствии двух концентраций Flt3-L (100нг/мл и 200нг/мл) значимо не отличалась. Было обнаружено, что количество генерируемых CD11c+ ДК в культуре через 7 суток значимо выше по сравнению с количеством CD11c+ ДК, генерируемых к 5 суткам, при этом, значимых отличий между генерируемыми количествами CD11c+ ДК в культурах на 7 и 9 сутки обнаружено не было. Значимых отличий в количестве получаемых CD11c+ ДК в культуре при концентрациях 100нг/мл или 200нг/мл не обнаружено. Относительное количество CD11c+ ДК из всех событий в культуре в среднем составляло 54,4±2,2% для концентрации 100нг/мл и срока культивирования 7 суток. Также было показано, что на 7 сутки культивирования в присутствии Flt3-L наибольшее количество дендритных клеток, в частности плазмоцитоидных дендритных клеток, доля клеток, экспрессирующих молекулу-маркер плазмоцитоидных дендритных клеток - PDCA-1, достигало 92-97%. Было показано, что относительное количество Sirpα+CD11c+ ДК и B220+CD11c+ ДК в получаемых культурах значимо выше в сравнении с относительным количеством исследуемых ДК в костном мозге. Среднее относительное количество Sirpα+ мДК и B220+ пДК в культуре составило 22,2±0.7% и 23,7±1,7% соответственно. В костном мозге среднее относительное количество Sirpα+ мДК и B220+ пДК составило 1,0±0,1% и 1,1±0,1%, соответственно. Также было показано, по мере увеличении времени культивирования мДК и пДК приобретают зрелый фенотип. Показано, что ДК в исследуемых культурах экспрессируют I-A(b) (MHCII) и CD86 значимо выше, чем ДК костного мозга. Относительные количества CCR9+мДК и пДК в костном мозге значимо не отличались от количеств CCR9+ мДК и пДК, генерируемых в присутствии Flt3-L. Однако, согласно средней интенсивности флюоресценции (MFI), уровень экспрессии CCR9 на Sirpα+ мДК, полученных в культуре, оказался значимо выше по сравнению с уровнем экспрессии CCR9 на Sirpα+ДК костного мозга. B220+ пДК костного мозга экспрессировали CCR9 значимо больше, чем пДК, получаемые в культуре в присутствии Flt3-L. Для изучения фенотипических и функциональных свойств дендритных клеток, индуцированных в присутствии Flt3-L, проводили тесты со стимуляцией агонистами TLR (2 и 9) с помощью LPS (2мкг/мл) или CPG ДНК (ODN1826) (6мкг/мл) в течение 24 часов. Контролем служили ДК без стимуляции LPS или CPG ДНК (ODN1826). Было показано, что для мДК и пДК, индуцированных в присутствии Flt3-L, было показано увеличение экспрессии молекул созревания в ответ на стимуляцию как LPS, так и CpG ДНК, что может быть связан с тем, что Sirpα+ мДК и B220+ пДК, индуцированные в культурах с помощью Flt3-L, как и выделенные из интактного костного мозга не являются терминально дифференцированными популяциями и несут признаки как миелодных, так и плазмоцитодных ДК. Для изучения толерогенных свойств дендритных клеток мышей С57Bl/6, полученных с помощью Flt3-L в условиях инкубации с LPS или CpG ДНК, их сокультивировали c CD4+ лимфоцитами мышей BALB/c. В полученных культурах оценивали относительное количество CD25hiFoxP3+Treg и пролиферативную активность CD4+ лимфоцитов по снижению флюоресценции витального красителя CFSE. Результаты показали, что количество CD25hiFoxP3+Treg, индуцируемое дендритными клетками, полученные с помощью Flt3-L без дополнительной стимуляции, значимо больше по сравнению с количеством Treg, чем у CD4+ лимфоцитов, не стимулированных дендритными клетками и стимулированных дендритными клетками, активированных CpG ДНК. Уровень пролиферации CD4+ лимфоцитов под воздействием ДК, полученных с помощью Flt3-L без дополнительной стимуляции, значимо меньше по сравнению с уровнем пролиферации CD4+ лимфоцитов под воздействием ДК, активированных CpG ДНК. По результатам проекта опубликованы 9 статей в журналах, индексируемые в базах Web of Science и/или Scopus с учетом публикаций в журналах, входящие в категорию Q1 как за две статьи. Полученные результаты, также доложены на международной конференции (Объединенный иммунологический форум-2019). Проведена апробация кандидатской работы Терещенко Валерия Павловича на тему "Индукция иммунологической толерантности с помощью дендритных клеток, трансфицированных ДНК-конструкцией, кодирующей антигенные последовательности молекул МНС", в которую вошли результаты полученные в рамках выполнения проекта РНФ, работа рекомендована принять к защите по специальности 14.03.09 - клиническая иммунология, аллергология. Таким образом, все задачи, запланированные на 2019 г, выполнены в полном объеме.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Модулирование миграции клеток иммунной системы и направление их в желаемые органы и ткани, требующие терапевтического вмешательства, может быть целесообразно при разработке клеточных вакцин. В частности, стимуляция миграции плазмацитоидных (pDCs) и конвенциональных дендритных клеток 2 типа(сDC2) в тимус может быть использована для индукции центральной иммунологической толерантности с целью подавления патологических аутоиммунных реакций и нежелательных трансплантационных реакций (реакции отторжения и реакции «трансплантат против хозяина»), поскольку известно, что в физиологических условиях плазмацитоидные дендритные клетки с помощью рецептора хемотаксиса CCR9 транспортируют антигены периферических тканей в тимус(в направлении хемокина CCL25) для их участия в негативной селекции и поддержания центральной иммунологической толерантности, а конвенциональные дендритные клетки, мигрируя в тимус, захватывают антигены из кровотока, также для их презентации в процессе негативной селекции. В 2020 году в рамках проекта РНФ16-15-00086 «Разработка клеточной технологии подавления иммунных реакций отторжения трансплантируемых тканей» была изучена эффективность стимуляции миграции иммунных клеток с помощью их трансфекции ДНК-конструкциями. А именно, изучена эффективность стимуляции миграции плазмацитоидных и конвенциональных дендритных клеток мыши к CCL25 и клеткам тимуса invitro и в тимус invivo с помощью их трансфекции ДНК-конструкциями, кодирующими рецептор хемотаксиса мыши CCR9. Также, была изучена способность полученных трансфицированных дендритных клеток генерировать тимические NRP-1+Foxp3+ Treg клетки, подавлять иммунный ответ на трансплантационные антигены и увеличивать время отторжения аллогенного кожного лоскута. Результаты электропорации культур дендритных клеток мышей плазмидой pmaxCCR9, кодирующей рецептор хемотаксиса CCR9, показали, что количество РНК, кодирующей геномный и плазмидныйCCR9, в группе трансфекции плазмидой pmaxCCR9 было в 94,4 раза выше по сравнению с группой неэлектропорированных ДК (медианы 2^-∆∆Ct 119.46 и 1.27, соответственно, N=4). Согласно полученным данным проточной цитометрии в культурах, электропорированныхpmaxCCR9, наблюдалось статистически значимо большее количество B220+ pDC и SIRP+ cDC2, несущих CCR9 на поверхности клеток, по сравнению с неэлектропорированным культурами. Также, в культурах, электропорированныхpmaxCCR9, pDCs и cDC2 несли статистически значимо большее количество поверхностного CCR9, по сравнению с pDCs и cDC2 из неэлектропорированных культур. Таким образом, электропорация культур pDCs и cDC2 ДНК-плазмидой pmaxCCR9 приводила к значимому увеличению РНК, кодирующей рецептор хемотаксиса CCR9, в клетках, к значимому увеличению количества клеток, несущих поверхностный белок CCR9, и к значимому увеличению среднего количество белка CCR9 на поверхности дендритных клеток. Результаты тестов invitro миграции показали, что через 24 часа после старта исследования дендритные клетки, трансфицированные pmaxCCR9, в 2,26 раза более активно мигрируют к CCL25 и в 2,69 раза более активно мигрируют к клеткам тимуса по сравнению с неэлектропорированными ДК. В рамках исследования invivo миграции было выявлено, что через 30 дней после введения клеток в организм мыши относительное количество введенных клеток, было в 2,02 раза выше в тимусе мышей, получивших ДК, электропорированные с помощью pmaxCCR9 и pmaxMHC (кодирующей антигенные последовательности молекул MHCI класса мышей CBA, т.е. трансплантационный антиген), чем в тимусе мышей, получивших ДК, электропорированные контрольной некодирующей плазмидой pmax0. Кроме того, у мышей, получавших электропорированные плазмидами pmaxCCR9 и pmaxMHC ДК, относительное количество клеток, несущих трансген UBC-GFP, было статистически значимо больше в тимусе, чем в лимфатических узлах, тогда как у мышей, получавших ДК, электропорированные плазмидой pmax0, наблюдалась обратная тенденция. Таким образом, культуры дендритных клеток, трансфицированные ДНК-конструкцией, кодирующей рецептор хемотаксиса ССR9, проявляли большую способность к миграции к CCL25 и клеткам тимуса invitro и в тимус invivo. При этом, в экспериментах in vivo миграции были использованы дендритные клетки, трансфицированные CCR9 и одновременно нагруженные трансплантационным антигеном с помощью ко-трансфекции плазмидой pmaxMHC, кодирующей антигенные последовательности молекул MHCI класса мышей CBA, что говорит о том, что трансфекция ДНК-конструкциями, кодирующими CCR9, может быть использована с целью доставки желаемых антигенов в тимус для индукции на них центральной иммунологической толерантности и подавления трансплантационных или других иммунных реакций. Результаты трансплантации кожного лоскута от мышей CBA на спину мышам C57Bl/6 при внутривенном введении реципиентам 1 млн полученных дендритных клеток за 30 дней до операции показали, что дендритные клетки, трансфицированные одновременно плазмидами pmaxCCR9, pmaxMHC и pmaxIL-10, способны обуславливать значимое увеличение сроков отторжения пересаженного кожного лоскута мышей CBA (медиана времени отторжения – 11,5 суток против 9 суток в контрольной группе введения физиологического раствора). Таким образом, в результате выполнения проекта РНФ16-15-00086 «Разработка клеточной технологии подавления иммунных реакций отторжения трансплантируемых тканей» в 2020 году на мышиной модели был разработан способ стимуляции миграции дендритных клеток к CCL25 и клеткам тимуса in vitro и в тимус in vivo, с помощью трансфекции ДНК-конструкциями, кодирующими рецептор хемотаксиса CCR9. При этом, стимулирование миграции в тимус invivo было выполнено для дендритных клеток, нагруженных трансплантационным антигеном с помощью трансфекции, что позволяет предложить полученный метод для целевой доставки антигенов в тимус с целью индукции центральной иммунологической толерантности и подавления нежелательных трансплантационных и патологических аутоиммунных реакций. На данном этапе в рамках проекта была показана возможность увеличения сроков отторжения трансплантированного аллогенного кожного лоскута с помощью внутривенного введения дендритных клеток, трансфицированных одновременно ДНК-конструкциями, кодирующими рецептор хемотаксиса CCR9, иммунорегуляторный цитокин IL-10 и антигенные последовательности молекул MHCI класса.