Аннотация результатов, полученных в 2019 году
На основе ранее полученных данных массового параллельного секвенирования, литературных сведений и информации открытых баз данных выявлены миРНК: миРНК-9, миРНК-17, миРНК-18а, миРНК-21, миРНК-129, миРНК-155, миРНК-181, миРНК-193, миРНК-221 и миРНК-222, ассоциированные с процессами злокачественной трансформации, и определены уровни их экспрессии в опухолевых клетках различного гистогенеза и нетрансформированных клетках человека. Показано, что в опухолевых линиях в процессе онкотрансформации значительно меняется уровень онкогенных миРНК-17, миРНК-18а, миРНК-21 и миРНК-155 и онкосупрессорной миРНК-129. Выявлена прямая корреляция между уровнем экспресси миРНК-21 и скоростью пролиферации опухолевых клеток. В рамках проекта проведен синтез, очистка и характеризация аналогов антисмысловых олигонуклеотидов, содержащих N-мезилфосфорамидные (μ-) и фосфоротиоатные (PS-) модификации всех межнуклеотидных связей в последовательности: (1) олигонуклеотидов, адресованных к онкогенным миРНК-мишеням, выявленным в ходе решения задачи 1 (μ-miR-17-ON, μ-miR-21-ON, PS-miR-21-ON и μ-miR-155-ON), и (2) олигонуклеотидов, последовательность которых не имеет гомологии в геноме млекопитающих (μ-Scr-ON и PS-Scr-ON). Исследована биологическая активность разработанных μ-олигонуклеотидов. Показано, что в клетках меланомы B16 миРНК-направленные μ-олигонуклеотиды эффективно снижают уровень их мишеней на 84%, 73% и 92%, для миРНК-17, миРНК-21 и миРНК-155 соответственно, не меняя уровень экспрессии других миРНК. Разработаны и синтезированы двойные олигонуклеотид-пептидные конъюгаты (ОПК), адресованные к миРНК-17, миРНК-18а, миРНК-21 и миРНК-155 (миРНК-17-DC , миРНК-18a-DC, миРНК-21-DC и миРНК-155-DC, соответственно), а также 2’OMe-модифицированные ОПК, адресованные к миРНК-21. Показано, что двойные конъюгаты c высокой эффективностью (до 96%) связываются с соответствующими миРНК-мишенями в эквимолярной концентрации и расщепляют миРНК-мишени с эффективностью 23-57% преимущественно по одноцепочечному участку, сформированному в результате связывания конъюгатов. Выявлено, что эффективность и скорость расщепления миРНК двойными конъюгатами многократно (до 10 раз) возрастает в присутствии РНКазы Н (Patutina et al., Molecules, подготовка к публикации). Показано, что введение 2’OMe модификаций в состав олигонуклеотидной компоненты конъюгатов способствует 3-х кратному усилению эффективности связывания с миРНК-21 по сравнению с немодифицированным аналогом. Выявлено, что конъюгат, в котором 2’OMe модификации не затрагивают область олигонуклеотидной части, прилегающей к пептиду, расщепляют РНК-мишень в 2 раза быстрее, чем его ДНК аналог, и почти в 4 раза быстрее, чем конъюгат с полностью 2’OMe-модифицированной олигонуклеотидной компонентой (Miroshnichenko et al., Russian Journal of Bioorganic Chemistry, 2019). Исследование нуклеазоустойчивости разработанных 2’OMe- и немодифицированных ОПК в среде, содержащей 50%-ную бычью эмбриональную сыворотку, и в плазме крови мышей показало, что введение 2'OMe модификаций в олигонуклеотидную компоненту конъюгата не повышает достоверно его стабильность (Miroshnichenko et al., Russian Journal of Bioorganic Chemistry, 2019). Исследование цитотоксического действия разработанных ОПК и μ-олигонуклеотидов показало, что все они проявляют высокое цитотоксическое действие: через 72 ч выживаемость клеток эпидермоидной карциномы человека КВ-8-5 под действием миРНК-21-специфичных 2’OMe ОПК и немодифицированного ОПК снижается на 58%, 48% и 75%, соответственно, а выживаемость клеток меланомы В16 снижается на 63%, 74% и 53% под действием μ-miR-17-ON, μ-miR-21-ON и μ-miR-155-ON, соответственно (Miroshnichenko et al., Russian Journal of Bioorganic Chemistry, 2019). Показано, что разработанные миРНК-21-направленные препараты (ОПК и μ-олигонуклеотиды) индуцируют апоптоз в клетках меланомы B16 мыши: через 48 ч в состояние апоптоза переходят 28 и 17% клеток для PO-ОПК и μ-ON, соответственно, что в 6 и 3 раза, соответственно, превосходит процент апоптотических клеток в контрольных клетках (Patutina et al., Frontiers in Pharmacology, 2019). В экспериментах in vivo показано, что миРНК-21 направленные μ-олигонуклеотиды снижают уровень этой миРНК в опухолевой ткани в 2 раза, что приводит к увеличению экспрессии белков супрессоров опухоли PTEN и PDCD4 в 1.5 – 3.5 раза. С помощью биоинформатического анализа выявлены онкогенные миРНК-17, миРНК-18а, миРНК-21 и миРНК-155, онкосупрессорные миРНК-129 и миРНК-193, а также дифференциально экспрессивные гены – мишени данных миРНК, в частности, EP300, APP, CTNNB1, PI3KR1, STAT3, ANAPC10 и др., уровень которых значительно меняется в процессе онкотрансформации меланоцитов человека. Выявлено, что меланома-специфичные микроРНК являются регуляторами генов, вовлеченных в такие ключевые клеточные процессы как рост клеток и их дифференциация, ангиогенез, мембранный транспорт, а также активация PI3K/Akt сигнальной оси и ряда некоторых цитокинов.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Проведен синтез, очистка и характеризация серии из 10 петлеобразующих олигонуклеотид-пептидных конъюгатов (ВС, bulge-forming), адресованных модельной мишени - дрожжевой фенил-аланиновой тРНК. Показано, что лучшие варианты ВС конъюгатов эффективно и специфично расщепляют РНК по связям, расположенным в петле, индуцированной связыванием конъюгата. Показано, что обязательным требованием к структуре ВС конъюгатов является присоединение каталитического пептида [(ArgLeu)2Gly]2 к модифицированному остатку сахара без основания, расположенному в центре адресующего олигонуклеотида и несущему на С1’ атоме аминогексильный линкер. Методами молекулярной динамики получено объяснение механизма действия ВС конъюгатов: показано, что при связывании с РНК-мишенью конъюгат индуцирует образование боковой петли, все основания которой способны принять конформации «в линию», необходимой для протекания реакции трансэтерификации (расщепления), однако вероятность принятия такой конформации возрастает с увеличением размера петли (Опубликовано в статье Staroseletz et al., Nucleic Acids Research, 2020, doi: 10.1093/nar/gkaa780). Исследована биологическая активность in vitro петлеобразующих (ВС) конъюгатов, адресованных к онкогенным миРНК-21 и миРНК-17, содержащих олигодезоксирибонуклеотид, комплементарный полноразмерной миРНК-мишени, при гибридизации с которым в центральной части миРНК образуется тринуклеотидная петля, и каталитического пептида, расположенного напротив формируемой петли. Показано, что рибонуклеазная активность петлеобразующих конъюгатов в значительной степени определяется последовательностью миРНК-мишени. Эффективность расщепления миРНК такими конъюгатами существенно ниже по сравнению с линейными и шпилечными миРНК-направленными олигонуклеотид-пептидными конъюгатами, разработанными ранее (Patutina et al., Biomaterials, 2017; Patutina et al., Sci. Reports, 2018; Patutina et al., Frontiers in Pharmacology, 2019). Таким образом, конъюгаты данного типа предпочтительно использовать для сиквенс-специфического расщепления более длинных РНК-мишеней (мРНК, длинные некодирующие РНК и др.). Установлено, что двойные конъюгаты (DC), направленные к онкогенным миРНК-17, миРНК-18а, миРНК-21 и миРНК-155, в которых каталитический пептид, расположенный между двумя короткими миРНК-узнающими олигонуклеотидами осуществляют сиквенс-специфическое магний-независимое расщепление миРНК-мишеней. При этом, анализ рН зависимости показал, что специфическое расщепление миРНК происходит только в диапазоне рН 5.5-7.5 при 37 °С (Опубликовано в статье Patutina et al., Molecules, 2020, doi: 10.3390/molecules25102459) . Увеличение температуры реакции с 37 °С до 45 °С способствует увеличению рибонуклеазной активности DC конъюгатов в 1.5-2 раза. Разработана модель опухолевой прогрессии с удалением первичного опухолевого узла, в которой сначала у лабораторных животных (мыши) формируется первичный опухолевый узел, а затем проводится его оперативное удаление с сохранением функционирующей конечности. Показано, что оперативное удаление первичного опухолевого узла способствовало существенному увеличению продолжительности жизни животных опухоленосителей с 24.9±0.5 до 32.4±2.4 суток, несмотря на возникновение рецидивов опухоли в месте операции.

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
В рамках проекта проведен синтез и характеризация двух серий олигонуклеотид-пептидных конъюгатов: (1) петлеобразующих BC (BC, bulge-forming conjugates), содержащих два [RLRLG]2 пептида – бис-конъюгаты, или три пептида [RL]3G – трипл-конъюгаты, адресованных к тРНКPhe дрожжей, и (2) крабоподобных конъюгатов (CC, Crab conjugates), содержащих два пептида [RLRLG]2 и адресованных к онкогенным миРНК-21 и миРНК-17. Показано, что в условиях избытка крабоподобные конъюгаты катализируют 100%-ное расщепление миРНК-21 через 24 ч, а миРНК-17 – через 8 ч. Подтверждено, что крабоподобные конъюгаты способны расщеплять РНК в каталитическом режиме: в условиях избытка РНК степень расщепления миРНК-21 составляет 85%, а миРНК-17 – 97% через 48 ч. Установлено, что рибонуклеазная активность модифицированного конъюгата µ-miR-21-Crab1, содержащего точечно расположенные µ-модификации в структуре олигонуклеотида, примерно в два раза ниже, чем у немодифицированного аналога. Тем не менее, повышенная нуклеоазоустойчивость модифицированного конъюгата может способствовать высокой ингибирующей активности в опухолевых клетках. Исследование эффективности расщепления миРНК-21 СС конъюгатами в присутствии РНКазы Н показало, что суммарная эффективность расщепления мишени под действием конъюгата и РНКазы Н через 2 ч почти в 11 раз выше, чем под действием только конъюгата и в 45 раз выше, чем в комплексе с олигонуклеотидом, что свидетельствует о значительном увеличении оборотов реакции расщепления при совместном действии СС и РНКазы Н. Показано, что бис- и трипл-ВС-конъюгаты в условиях однооборотной реакции расщепляют 94-100% тРНКPhe за 24 ч, что значительно превышает показатели конъюгатов моно-ВС (75-90% тРНКPhe за 72 ч). Показано, что расщепление РНК-мишени ВС-конъюгатами происходит как по целевой петле 61С-65G, формируемой при связывании тРНКPhe с ВС, так и вне её. При этом, расщепление вне петли также протекает в составе комплекса тРНКPhe-конъюгат и является следствием высокой конформационной подвижности пептида. Все бис- и трипл-конъюгаты к 48 ч расщепляют 100% тРНКPhe по петле 61С-65G, тогда как ВС-моно расщепляют по петле в тех же условиях не более, чем на 30-55% за 72 ч. С использованием модельной системы F-Q-РНК (флуорофор FITC – тушитель DABCYL) показано, что все петлеобразующие конъюгаты (моно-, бис- и трипл-) способны расщеплять РНК в каталитическом режиме: наблюдается расщепление несколько молекул РНК на одну молекулу конъюгата, причем максимальные значения этого показателя составили 6,6, 6,4 и 5,6 для BC5-L-ββ, BC5-α и BC5-L-β, соответственно. Продемонстрировано синергическое действие комбинаций миРНК-направленных µ-олигонуклеотидов, способствующее значительному подавлению миграционной активности опухолевых клеток (µ-21-ON+µ-17-ON Combination Index CI = 0.32 и µ-21-ON+µ-155-ON CI = 0.57). Показано, что одновременное применение миРНК-21-направленного µ-олигонуклеотида и цитостатиков винкристина и доксорубицина значительно увеличивает анти-пролиферативный эффект по сравнению с монотерапией олигонуклеотидом (в 2.5 раза для винкристина и в 10 раз для доксорубицина) или цитостатика (на 8-15%). Оценка способности миРНК-направленных олигонуклеотидов в составе моно- и комбинированной терапии подавлять канцерогенез на высокоагрессивной метастатической модели меланомы В16 у мышей показала, что во всех экспериментальных группах мышей которым трансплантировали клетки, трансфицированные in vitro миРНК-направленными олигонуклеотидами, кроме группы µ-17-ON+µ-155-ON, среднее количество метастазов было приблизительно в 7 раз ниже по сравнению с контрольными группами. Оценка способности миРНК-направленных олигонуклеотидов в составе моно- и комбинированной терапии подавлять рост первичной опухоли и развитие метастазов на модели лимфосаркомы RLS40 мыши показала, что противоопухолевый эффект комбинированной терапии миРНК-направленными олигонуклеотидами значительно превосходит эффект монотерапии. При использовании миРНК-направленных олигонуклеотидов по отдельности, наибольший противоопухолевый эффект наблюдался в группе µ-17-ON, когда объём опухоли у животных был примерно в 4 раза меньше, чем в группе μ-Scr-ON. Среди комбинаций наибольшую эффективность показали попарные сочетания µ-21-ON+µ-17-ON и µ-17-ON+µ-155-ON, а также коктейль из трёх олигонуклеотидов µ-21-ON+µ-17-ON+µ-155-ON, для которых средний объём опухолей был приблизительно в 10 раз меньше, чем в контрольных группах. Морфометрический анализ гистологических срезов опухоли RLS40 показал, что под действием µ-21-ON происходит снижение численной плотности митозов в опухоли в 1.6 раз по сравнению с контролем, а под действием коктейлей µ-21-ON+µ-17-ON и µ-155-ON+µ-17-ON в 3.6 и 2.5 раз, соответственно. Наибольший эффект продемонстрировал коктейль µ-21-ON+µ-155-ON+µ-17-ON, способствующий 12-кратному снижению количества митозов в ткани опухоли по сравнению с контролем. Анализ противоопухолевого действия комбинации из трёх миРНК-направленных олигонуклеотидов – µ-21-ON + µ-17-ON + µ-155-ON, на модели лимфосаркомы RLS40, вводимых мышам перитуморально в комплексе с фолат-содержащими катионными липосомами F12, показал, что трёхкратное введение коктейля приводит к 4-х кратному снижению объема опухоли по сравнению с контролем (инъекции только F12). Показано, что перитуморальное введение коктейля олигонуклеотидов µ-17-ON, µ-21-ON и µ-155-ON обеспечивает долговременное снижение уровня миРНК в опухолевой ткани: на 60%, 35% и 30% для миРНК-17, миРНК-21 и миРНК-155, соответственно, через 12 дней после последней инъекции. Оценка изменения уровня белков PTEN и PDCD4 - прямых мишеней данных миРНК, в ответ на проводимую терапию показала многократное, в 6-10 раз увеличение уровней белков в опухолевой ткани. Иммуногистохимический анализ срезов опухоли показал, что введение коктейля µ-21-ON+µ-155-ON+µ-17-ON вызывает значительный антипролиферативный эффект по сравнению с контролем: PCNA-позитивные клетки в ткани опухоли были единичны. Исследование гепато- и нефротоксичности, а также биохимический анализ крови показал, что проводимая терапия не оказывает токсического воздействия на организм животных. В рамках эксперимента in vivo с использованием модели лимфосаркомы RLS40 в солидной форме была проведена оценка способности миРНК-21-направленного µ-олигонуклеотида снижать вероятность рецидивов и увеличивать продолжительность жизни мышей после оперативного удаления опухоли. Показано, что двукратное перитуморальное введение μ-21-ON вызывает увеличение продолжительности жизни мышей с лимфосаркомой RLS40 после операции, тогда как оперативное лечение мышей из группы контроля напротив вызывает множественные рецидивы и снижение продолжительности жизни. Биоинформатический анализ регулома миРНК для миРНК-17, миРНК-21, миРНК-155, показал, что миРНК-17 контролирует значительно большее количество таргетных генов (96), регулирующих пролиферацию, по сравнению с миРНК-155 (30) и миРНК-21 (17). Кроме этого, миРНК-17 имеет общий набор таргетных генов с миРНК-155 (5 генов: Osr1, Tcf7I2, Kras, Trp53inp1, Ptprj) и миРНК-21 (2 гена: Pten, Yy1). Полученные данные полностью коррелируют с полученными данными по противоопухолевой активности µ-олигонуклеотидов на модели лимфосаркомы мыши RLS40 ex vivo: лишь в случае монотерапии µ-17-ON и комбинаций µ-17-ON c µ-21-ON и/или µ-155-ON, наблюдалось достоверное снижение роста опухоли. Синергическое действие миРНК-направленных коктейлей, по-видимому, определяется наличием общих таргетных генов у модулируемых миРНК: µ-17-ON c µ-21-ON (2 общих гена)/µ-155-ON (5 общих генов). При анализе регулома, контролирующего метастатический потенциал опухолевых клеток, исходя из полученных данных по scratch assay и эксперименту на мышах, было сделано предположение, что в отличие от антипролиферативной активности, уровень антиметастатического потенциала исследуемых миРНК-направленных олигонуклеотидов определяется общим количеством таргетных генов у каждой конкретной миРНК-мишени (суммарный эффект): miR-17 (67), miR-155 (18) и miR-21 (17).