Аннотация результатов, полученных в 2019 году
В ходе выполнения проекта проведен комплекс исследований, связанных со взаимодействиями между энтомопатогенными грибами, пасленовыми растениями и насекомыми. Показано, что на картофельных полях количество колониеобразующих единиц (КОЕ) грибов Metarhizium зависит от потенциального плодородия почв, достигая 20 тыс КOE/грамм почвы. Однако во внутренних тканях растений грибы детектируются единично. Метагеномный анализ внутренних тканей картофеля также показал очень низкое относительное обилие энтомопатогенных грибов (Beauveria, Metarhizium) в корнях и их отсутствие в листьях, относительно общего пула грибов, представленных преимущественно фитопатогенами. Таким образом, естественная колонизация внутренних тканей картофеля очень незначительная. Установлено, что при выращивании картофеля в условиях гидропоники, обработка корневой системы конидиями грибов B. bassiana и M. robertsii приводит к существенным изменениям в содержании фотосинтезирующих пигментов, активации ферментативной защиты растений (пероксидаза, супероксиддисмутаза) и снижению уровня пролина. При этом указанные изменения происходят в короткие сроки (7 суток после обработки). Исследовано влияние штаммов M. robertsii с разными патогенными стратегиями на стимуляцию роста томатов. Так, при инфицировании насекомых рядом штаммов грибов наблюдается бактериальный распад трупов насекомых после их колонизации грибом. Это приводит к повышенному содержанию нитратного и аммонийного азота в трупах и значительной стимуляции роста растений при их выращивании на субстратах, дефицитных по минеральному азоту. Штаммы с классическим развитием микоза (способные спорулировать на убитых ими насекомых) приводят к менее выраженной стимуляции роста растений. Таким образом, использование «девиантных» штаммов (не способных спорулировать на трупах), будет приводить к более быстрому, но только пассивному потоку азота от убитых насекомых к растениям. В ходе проекта получены линии изолятов B. bassiana и М. robertsii шестикратно пассированных через растения томатов и через личинок вощинной огневки. Данные изоляты представляют интерес для исследования изменения их морфофизиологических и вирулентных свойств в ходе адаптации к разным хозяевам – растениям и насекомым. Данный анализ запланирован на следующих этапах проекта. Проведен генно-информационный анализ гомологичных последовательностей лектинов, содержащих рициновый домен у насекомых, растений и бактерий. Установлено, что данный домен неоднократно заимствовался и дуплицировался разными видами бактерий, растений и членистоногих. Исходя из проанализированных данных мы предположили, что рициновый домен может входить в состав фермента, обладающего фунгицидными свойствами. Проведены эксперименты по оценке экспрессии гена гомолога В-лектина рицина в тканях колорадского жука при грибных инфекциях. Показано существенное повышение его экспрессии в кутикуле и жировом теле при развитии микозов, вызываемых разными видами грибов (B. bassiana и M. robertsii). Уровень экспрессии также прямо зависел от уровня восприимчивости у личинок разных возрастных групп. Следует отметить, что изменения экспрессии гена гомолога В-лектина рицина не было взаимосвязано с экспрессией генов антибактериального пептида Аттацина и белка теплового шока. Последнее косвенно свидетельствует о том, что усиление экспрессии гена гомолога В-лектина рицина вызвано именно грибными инфекциями. В настоящее время нет достоверной информации об антигрибных пептидах колорадского жука, поэтому дальнейшее исследование рицин-подобного В-лектина представляет существенный интерес. Впервые получены данные по влиянию обработки картофеля грибами M. robertsii и B. bassiana на развитие ризоктониоза и стимуляцию роста растений в полевых условиях. Показано, что обработка посадочных клубней конидиями B. bassiana приводит к существенному снижению ризоктониоза стеблей и столонов. Сходные тренды отмечены при обработке посадочных клубней конидиями M. robertsii, но различия были несущественными. Оба гриба значительно снижали склероциальный индекс на клубнях нового урожая. Кроме того оба гриба приводили к повышению пероксидазной активности в корнях через 4 недели после обработки клубней. Прибавка урожая картофеля составила 12 и 19% процентов после обработки M. robertsii и B. bassiana соответственно. Системная колонизация картофеля энтомопатогенными грибами не превышала 5%, однако было зарегистрировано активное развитие исследуемых грибов в корневой системе. В экспериментах in vitro показано, что исследуемые энтомопатогены подавляют Rhizoctonia solani, некротизируя гифы фитопатогена и ингибируя формирование склероциев. Таким образом, обработка посадочных клубней конидиями энтомопатогенных грибов приводит к подавлению развития ризоктониоза в течение вегетационного периода и приводит к повышению качества клубней нового урожая.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Проект посвящен изучению механизмов взаимодействий между энтомопатогенными грибами, пасленовыми растениями, фитофагами и фитопатогенами. В рамках текущего этапа показано, что при естественной численности энтомопатогенных грибов Beauveria и Metarhizium в экосистеме картофельного поля (до 10 тыс. колониеобразующих единиц на грамм почвы) данные грибы могут детектироваться в ризосфере картофеля, однако проникновение во внутренние ткани этого растения является редким событием. Метагеномный анализ показал, что сообщества эндофитов картофеля при выращивании в открытом грунте представлены преимущественно фитопатогенными грибами, а доля участия Beauveria и Metarhizium очень низка. Среди грибов Metarhizium, в ризосфере и во внутренних тканях корней и стеблей обнаружены два криптических вида (M. robertsii и M. brunneum). В экспериментах, проводимых в условиях гидропоники выявлен ранний иммуно-физиологический ответ растений картофеля к энтомопатогенным грибам. Установлено, что обработка корневой системы конидиями грибов B. bassiana и M. robertsii приводит к задержке ростовых процессов, существенным изменениям в содержании фотосинтезирующих пигментов, активации ферментативной защиты растений и накоплению свободного пролина. Мы полагаем, что энтомопатогенные грибы на ранних этапах взаимодействия с растениями картофеля могут выступать в качестве стресс-фактора, приводящего к активации защитных систем. Запуск этих ответных реакций носит затратный характер для растительного организма, что может приводить к краткосрочному отставанию в росте. В ходе проекта получены линии изолятов B. bassiana и М. robertsii восьмикратно пассированных через растения томатов и через насекомых (личинок вощинной огневки). Установлено, что длительные пассажи приводят к изменениям содержания углерода и азота в спорах грибов, изменению характера углеводного питания, а также к модификации вирулентных свойств. Зафиксированные изменения свидетельствуют о наличии тонких, но статистически существенных сдвигов в метаболизме полученных линий энтомопатогенных грибов и могут служить отправной точкой в детальном изучении трансформаций, формируемых в ходе адаптации к разным хозяевам – растениям и насекомым. Проведён информационный анализ структуры пептида рицинового В-лектина колорадского жука и возможного его участия в защите от грибных инфекций. Эксперименты по изучению экспрессии гена при различных стрессах, в том числе при грибной инфекции показали, что подъем его экспрессии является специфической реакцией на грибное вторжение. Мы полагаем, что исследуемый рициновый В-лектин является антигрибным пептидом колорадского жука. Отметим, что ранее антигрибные пептиды не были описаны у этого вида насекомого. В полевых экспериментах показано что обработка картофеля грибом M. robertsii ингибирует развитие ризоктониоза и повышает урожайность. При этом стабильный результат достигался при разных способах внесения гриба: обработке клубней перед посадкой и проливе почвы в фазе всходов. Однако обработка клубней является более технологичным и экономичным методом. На основании этих данных мы планируем на следующий год проведение производственных испытаний грибов в целях защиты от ризоктониза и повышения продуктивности данной культуры.

Аннотация результатов, полученных в 2021 году
В рамках заключительного этапа проекта проведена серия экспериментов по влиянию энтомопатогенных и фитопатогенных грибов на физиологические показатели картофеля, оценен ряд биохимических изменений энтомопатогенов, происходящих в процессе адаптаций к растениям и насекомым, а также установлены изменения в экспрессии генов грибов в ответ на стресс, вызванный b-лектинами растений - ортологами b-лектинов насекомых. Кроме того проведены производственные испытания грибов в картофельных агросистемах. Проведен анализ уровня экстрактивных соединений картофеля в ответ на колонизацию грибом B. bassiana. Колонизация привела к изменениям в композиции дитерпеноидов и увеличению некоторых гидроксикислот, принимающих участие в защите растений от фитопатогенов и фитофагов. Кроме того наблюдалось увеличение содержания гидроксикоричных кислот, участвующих в гормональной регуляции и ростовых процессах растений. Более выраженные изменения дитерпеноидов и гидроксикислот наблюдались в листьях, что свидетельствовало о наличии системных биохимических трансформациях при колонизации растений. Установленные нами изменения в составе экстрактивных соединений хорошо соотносится с выявленными ранее эффектами ростостимуляции и повышением устойчивости картофеля к фитопатогенам. Впервые был проанализированы биохимические изменения у картофеля, колонизированных грибом B. bassiana на фоне искусственного заражения фитопатогеном ризоктонией R. solani. Установлено, что колонизация растений B. bassiana повышает устойчивость к R. solani и нивелирует негативное влияние инфекционного процесса на ростовые параметры. Анализ активности ферментов (пероксидазы, СОД, полифенолоксидаза и др.) и продукции малонового диальдегида, косвенно свидетельствовал о конкурентных взаимодействиях между R. solani и B. bassiana. В частности R. solani ингибировала подъем активности пероксидаз и SOD, вызыванный B. bassiana. Активность полифенололоксидаз ингибировалась только при комбинированном действии грибов. R. solani снижала уровень колонизации тканей картофеля грибом B. bassiana в 1.3 раза, тогда как B. bassiana снижала уровень колонизации растений в 2.4 раза, что также свидетельствует о конкуренции. Впервые показано, что пассирование энтомопатогенных грибов М. robertsii через насекомых и растения может приводить к падению вирулентности, что сопряжено со снижением продукции гидролитических ферментов грибов (протеазы, липазы). В тоже время у культур, взаимодействующих с живыми клетками (пассированных через растения и насекомых) происходит подъем продукции вторичных метаболитов – деструксинов, при этом наблюдается обратная корреляция между вирулентностью грибов и содержанием этих токсинов. Установлено, что ортолог b-лектина колорадского жука – рициновый b-лектин клещевины подавляет экспрессию генов, связанных с вирулентностью грибов, в частности генов кодирующих протеиназы, хитиназы, белки регуляторы пути Pal-pH, а также приводит к частичной агглютинации пропагул гриба и разрушению мицелия. Таким образом, данный лектин обладает фунгицидными свойствами, воздействуя как клеточную стенку, так и на внутриклеточные процессы грибов. Проведены производственные испытания по внесению M. robertsii в картофельные агросистемы, и показано что обработка посадочных клубней методом малообъемного опрыскивания конидиями снижает развитие наиболее опасного заболевания картофеля - ризоктониоза в течение всего вегетационного периода. Данный прием обеспечивает значительное улучшение качества полученных клубней и увеличение урожайности картофеля в условиях Западной Сибири. Предложенный способ обработки клубней оказался не только наиболее технологичным, но и обеспечил максимальный защитный эффект. Хозяйственная эффективность M. robertsii достигла 68% и была выше химического стандарта (Эместо квантум). Полученные результаты позволяют дать рекомендации к внесению биопрепаратов в агроценозы с целью подавления фитопатогенов, повышения качества сельхоз продукции, и снижения применения синтетических пестицидов. Обнаруженные новые механизмы адаптаций грибов к хозяевам, а также индукции защитных механизмов растений и насекомых расширяют фундаментальные знания о взаимодействиях в триотрофных системах.