Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Первый этап (2018-2019) включал в себя молекулярный блок, биотехнологический и физиолого-биохимический блоки исследований. В молекулярном блоке для генетического анализа гермоплазмы чая собрана коллекция ДНК кавказских генотипов Camellia sinensis (L.) Kuntze (включая гермоплазму промышленных плантаций, одичавшей флоры подлеска, морозостойкие адыгейские, туапсинские генотипы, мутантные формы грузинской селекции, отобранные перспективные формы и лучшие местные сорта коллекции ФГБНУ ВНИИЦиСК) – всего 106 образцов. Членами команды проекта проведено генотипирование этой коллекции методом мультиплексного SSR анализа на приборе ABI 3500xl 24 Capillary DNA Genetic Sequencer (при поддержке германских коллег Prof.Dr. Henryk Flachowsky и Prof.Dr. Magda-Viola Hanke, любезно предоставивших расходные материалы и приборную базу Института селекционных исследований плодовых культур, Дрезден). С целью поиска маркеров, сцепленных с QTLs устойчивости к холоду и засухе, начата работа по поиску SSR в библиотеке EST китайской базы данных геномов чая http://tpia.teaplant.org/SimpleSequenceRepeats.html, любезно предоставленной китайскими коллегами - Prof.Dr. Chaoling Wei, Anhui State Agricultural University). Кроме того, проведен широкомасштабный литературный поиск, из которого выявлены наиболее важные транскрипционные факторы и регуляторные гены, участвующие в каскадах ответных реакций на абиотические стрессы у чая (ICE, CBF, WRKY, DHN, HD-Zip, LEA, LOX, NAC, HSP, гены углеводного метаболизма, пролина и др.). Подобраны праймеры для изучения вклада этих генов в устойчивость кавказских генотипов чая к осмотическому стрессу, оптимизированы протоколы выделения РНК и обратной транскрипции. Полученные результаты станут заделом для будущих работ по структурной геномике (генотипирование расщепляющихся популяций и родительских генотипов) и функциональной геномике (анализу уровня экспрессии и подтверждения генов-кандидатов) чайного растения. Биотехнологический блок был направлен на оптимизацию протоколов in vitro культивирования чая для размножения расщепляющихся популяций и моделирования стресса in vitro. Оптимизированы протоколы in vitro культивирования изолированных зародышей, размножения и укоренения микропобегов чая. Выявлено, что ранние этапы развития зародыша (зимняя фаза покоя, весенняя фаза начала набухания семени) – неэффективны для инициации стерильной культуры. Наиболее оптимальным периодом введения зародышей в стерильную культуру является сентябрь-октябрь, стадия вызревания эндосперма семян. Для культивирования микропобегов чая оптимизирован состав питательной среды для размножения (1/2МС+казеина гидролизат 500мг/л,+БАП 0.5мг/л) и укоренения (1/2МС+казеина гидролизат 500мг/л,+НУК1мг/л). Оптимизированы протоколы индукции заморозков in vitro и in vivo. При моделировании холодового стресса для in vitro микропобегов чая температуры 0…+2о С приводили к существенным изменениям комплекса биохимических показателей (накоплению пролина, снижению содержания воды в тканях, изменению стабильности клеточных мембран). При моделировании засухи in vitro отмечалось, что маннит (36,4 г/л) в питательной среде достоверно снижал ростовую активность микропобегов чая, увеличивал водный дефицит в тканях, демонстрируя адаптивные реакции микропобегов. Высокие концентрации маннита (54,6 мг/л) негативно влияли на жизнеспособность микропобегов чая, вызывая сильный осмотический стресс, приводящий в конечном итоге к некрозу тканей. Показано, что добавление PEG (m.w.8000) в питательную среду в концентрации 50 г/л приводит к среднему осмотическому стрессу для микропобегов чая. При моделировании холодового стресса у двухлетних горшечных растений чая in vivo выявлено, что температуры 0…+2оС (действующие в течение 7 дней) приводят к естественной холодовой адаптации растений, которая регистрируется по накоплению осмолитов в цитоплазме: белков, пролина, сахаров. При этом сохраняется стабильность клеточных мембран, что указывает на отсутствие дестабилизирующего влияния этого режима охлаждения на двухлетние растения чая. Последующее их 5 дневное промораживание при -6…-8 оС вызывало деструктивное воздействие на ткани листьев, которое для изученных генотипов выражалось в существенном снижении относительного содержания воды, изменении рН клеточного сока, снижении стабильности клеточных мембран. В физиолого-биохимическом блоке проведен поиск информативных дескрипторов для фенотипирования устойчивости растений чая к заморозкам и засухе. При поиске информативных морфологических дескрипторов установлено, что толщина столбчатой и губчатой паренхимы листа больше у устойчивых сортов, что также может служить информативным маркером устойчивости чая. Однако размер устьиц (длина, ширина) меньше у устойчивых генотипов чая. Поэтому размер устьиц может являться информативным дескриптором в ответе на осмотический стресс. При индукции стресса у более устойчивых генотипов чая в меньшей степени происходит сдвиг pH клеточного сока в щелочную сторону. Содержание пролина сильно варьирует у разных растений внутри одного генотипа, поэтому необходимы дальнейшие исследования для оценки информативности этого маркера. Относительное содержание воды (ОСВ) в листьях снижается при промораживании сильнее у неустойчивых генотипов, поэтому данный маркер может быть одним из информативных показателей устойчивости. Установлено, что содержание водорастворимого белка повышается при холодовом стрессе, является информативным дескриптором в ответе чая. При осмотическом стрессе показано снижение содержания хлорофилла и каротиноидов в листьях пропорционально силе воздействия. Таким образом, к параметрам, отражающим устойчивость чая к осмотическому стрессу, которые могут быть включены в процедуру скрининга гибридов чая были отобраны следующие: содержание водорастворимого белка и пролина, показатели стабильности клеточных мембран, содержание углеводов и катехинов, относительное содержание воды. Среди них водорастворимый белок и пролин рассматриваются как наиболее важные компоненты, аккумуляция которых при стрессе характерна для клеток многих высших растений, в том числе и чая.

Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Исследования 2-го этапа Проекта были направлены на характеристику родительских пар и популяций и сфокусированы в двух направлениях: структурной геномики и функциональной геномики чая. Проведена апробация 42 SSR и 10 ISSR праймеров, на основе которой выполнено генотипирование родительских пар и выявлены наиболее информативные полиморфные маркеры для генотипирования популяций чая. Установлено, что из 10 апробируемых ISSR праймеров, три праймера № 7 (CTTCA)3, № 9 (AC)7C и № 12 (CT)8TG позволяют выявить диагностические фрагменты, характерные для родительских генотипов. По 42 SSR микросателлитным маркерам анализ частот распределения аллелей выявил 12 уникальных аллелей и 18 редких аллелей в популяции родительских генотипов, а также диагностические аллели для родительских генотипов. SSR- анализ позволил выявить суммарно 83,3 % полиморфных локусов в популяции родительских пар. По результатам апробации SSR-маркеров были отобрано шесть полиморфных SSR (L07, L22, L14, L34, L70, L82) для генотипирования основной выборки, включающей сортообразцы 6 популяций чая, из различных локалитетов. Мультилокусный поиск идентичных генотипов в этой выборке выявил, что 30% морозостойкой популяции и 50 % неморозостойкой популяции имеют идентичный характер распределения аллелей. Для 3-х популяций из различных локалитетов произрастания, Адыгейской (самой северной), Грузинской и Шри-Ланка (самой южной) были выявлены редкие и уникальные аллели. Анализ генетических дистанций методом PCoA (GeneAlex) и структуры популяции по Bayesian – алгоритму (STRUCTURE) также подтвердил наличие в исследуемой выборке трех популяций с наименьшими генетическими дистанциями внутри каждой из них. С использованием фрагментного анализа на ABI Prism 3500xl для 35 из 106 сортообразцов базовой коллекции селекционных генотипов Института выявлены специфичные аллели. Эта работа проведена впервые, полученные результаты важны для поиска маркеров, сцепленных с признаками засухоустойчивости и морозоустойчивости, в коллекции геноресурсов чая, а также для паспортизации геноресурсов чая на Кавказе. В направлении функциональной геномики, для чая выявлены основные генетические мишени, новые гены-кандидаты и подтверждена вовлеченность 21 нового гена в низкотемпературный стрессовый ответ. В этой работе проанализирована экспрессия а) 30 генов (транскрипционных факторов, генов метаболизма углеводов, липидов, гормонов) в условиях засухи; б) экспрессия 33х новых генов-кандидатов в условиях холода. А) При разной степени воздействия засухи: средней засухе, сильной засухе и восстановлении выявлен генотип-специфический характер экспрессии ряда транскрипционных факторов: DHN1, DHN2, DHN3, CBF1, WRKY2, bHLH17, bHLH43, NAC17, NAC30, которые на разных этапах стрессового воздействия экспрессировались в большей степени для устойчивого генотипа (Кимынь). Гены семейства липоксигеназ LOX1, LOX6, LOX7 и гены – регуляторы углеводного обмена SnRK1.1, SnRK1.2, SnRK1.3 тоже показали более выраженный уровень экспрессии для устойчивого генотипа. В нашем исследовании впервые была показана активность генов углеводного обмена у чая при засухе и впервые выявлены корреляции между различными генами ответа на засуху. Для устойчивого генотипа под воздействием засухи и при дальнейшем восстановлении более выраженная экспрессия была характерна для генов метаболизма углеводов RS2 (синтез раффинозы), TPS11 (синтез трегалозы), BAM (расщепление крахмала до мальтозы), INV (гидролиз сахарозы до глюкозы). Предположительно, эти гены могут быть маркерами устойчивых сортов. Наибольшее количество положительных корреляций наблюдалось у транскрипционных факторов семейства bHLH и WRKY2. Б) В листьях и корнях трехлетних растений чая при индукции холода сравнивали уровень экспрессии 33х новых генов-кандидатов, а также генов-регуляторов холодового ответа (ICE1, CBF1) и генов DHN1, DHN2, DHN3. Из этих 38 генов у 12 генов впервые было подтверждено повышение уровня экспрессии не только в листьях, но и в корнях при индукции холода. Это гены CBF1, DHN1, DHN2, PEI, GOLS3, GR-RBP3, WRKY42, GsSPK, ZAT, LEA2, HSP80 и PRP, при этом был выявлен генотип-специфический характер их экспрессии. По уровню экспрессии 38 генов разделили на три группы (первая группа – повышение экспрессии до 10 раз, вторая группа – в десятки раз и третья группа – в сотни раз). В первую группу вошло 19 генов из 38-ми. Анализ уровня экспрессии показал, что из этих 19 генов 10 активно участвуют в ответе на низкотемпературный стресс, что проявляется повышением их уровня экспрессии. Из этих 10 генов у устойчивого генотипа чая в наибольшей степени экспрессируются CBF1, DHN3, WRKY42, AP-ERF-AP, PRP, PEI, CIP. Из трех этапов холодового воздействия (холод, мороз, восстановление), наиболее активно транскрипты этих генов накапливаются при морозе, однако, устойчивый сорт отличается более ранним ответом, и у него уже на этапе холодового воздействия происходит значительное повышение уровня экспрессии этих генов. Во вторую группу вошли 12 генов с кратностью повышения уровня экспрессии в десятки раз. Все они активно экспрессировались в ответ на холод, что подтверждало вовлеченность новых генов-кандидатов в холодоустойчивость у чая. В этой группе наиболее активно экспрессировались ранее известные гены DHN1, DHN2 и новые гены-кандидаты RPK, GOLS3, RBP, GsSPK, LEA. Наконец, в третью самую малочисленную группу генов, экспрессия которых возросла в сотни крат, вошли всего три гена-кандидата: SUST, HSP80 и GST. Активность экспрессии этих генов была существенно выше у устойчивого генотипа не только при промораживании, но и на этапе восстановления. Из новых генов-кандидатов два гена ENII и TLP дифференциально экспрессировались при индукции мороза, и один ген - CIP - на этапе восстановления у устойчивого сорта чая. В результате выполнения этих работ выявлены новые механизмы устойчивости чайного растения к засухе и морозу, существенно дополнены известные механизмы комплексного ответа чайного растения на засуху и мороз.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
В отчетном году получены следующие основные результаты: На основе сравнительного фенотипирования контрастных по устойчивости сортов чая, установлены наиболее информативные морфологические (длина листа, толщина листа, основание листовой пластинки, длина черешка, тип поверхности листа, глубина зубчиков листа, толщина паренхимы, размер и плотность устьиц) и физиолого-биохимические (оводненность листа и интенсивность выхода из тканей листьев электролитов - относительная электропроводность) признаки, достоверно коррелирующие с устойчивостью растений чая к морозу и засухе. Аминокислотный профиль листьев чая (Arg, Tyr, b-Phen, Leu, Met, Val, Thr, Ser, a-Ala, Gly, Pro) варьировал в большей степени при индукции холода, чем при засухе. Для устойчивых к холоду генотипов характерным ответом на стресс было накопление 6 аминокислот (Leu, Met, Val, Thr, Ser, Gly), 4 из которых (Met, Thr, Leu и Ser) имели прямую связь с ключевыми генами холодового ответа (CBF, DHNs, SnRK1). При моделирование засухи листья растений накапливали 2 аминокислоты (Pro, Thr). При индукции продолжительной засухи in vitro, происходит накопление эпигаллокатехина (в 3 раза) и эпигаллокатехин галлата (в 1,5 раза) и снижение содержания кофеина, которые отвечают за качество чайного сырья и могут служить информативными маркерами устойчивых генотипов. Установлена связь профилей экспрессии генов и биохимических показателей при индукции засухи in vitro. К примеру, содержание треонина и галлокатехина положительно коррелировало с профилями экспрессии генов RS1, RS2, DHN2, LOX6, BAM5, SnRK1.3, SUS4, HXK3. Содержание эпигаллокатехина, эпикатехина и пролина положительно коррелировало с профилями экспрессии генов LOX1 и TPS11. Эти результаты позволяют предположить, что транскрипты данных генов могут участвовать во вторичном метаболизме и белковом обмене у чайного растения при засухе и влиять на качество чайного сырья. Содержание альфа-аланина, хлорофиллов, каротиноидов положительно коррелировало с характером экспрессии генов: CBF1, HXK2, SWEET3, SnRK1.1, SPS, DHN3, что позволяет предположить участие этих генов в поддержании фотосинтетической стабильности при засухе. При индукции осмотического стресса in vitro (на клеточном уровне) происходит повышенная экспрессия ряда генов: DHN2, BAM, SUS4, RS1, RS2, SnRK1.3, TPS11, LOX1 и LOX6, шесть из которых участвуют в углеводном метаболизме. В условиях осмотического стресса in vitro были выделены две группы генов, в пределах каждой отмечена положительная корреляция между генами: 1. CBF1, DHN3, HXK2, SnRK1.1, SPS, SWEET3, SWEET1 и 2. DHN2, SnRK1.3, HXK3, RS1, RS2, LOX6, SUS4, BAM5. Похоже, что эти два модуля генов имеют высокую степень коэкспрессии и могут участвовать в работе соответствующих регулонов при стрессе. Сочетание двух подходов (in silico и экспериментального) позволило впервые доказать вовлеченность девяти новых генов у чая в ответ на холод и засуху: galactinol synthases (GOLS1 and GOLS3), glycine-rich RNA-binding protein 3 (GR-RBP3), xyloglucan endotransglucosylase/hydrolase protein 22 (XTH22, Hydrolase22), zinc finger protein RHL41, histone methylase SKB1, pectinesterase inhibitor PME41, dehydration response element-binding protein DREB26, and protein kinase superfamily protein ARCK1. Установлены гены неспецифического стрессового ответа у чая: HSP70, GST, SUS1, DHN1, BMY, bHLH102, GR-RBP3, ICE1, GOLS1, и GOLS3, которые характеризовались высокой экспрессией при засухе и холоде. На основании этого к важным механизмам неспецифического стрессового ответа у растений чая на холод и засуху отнесены следующие: активизация ферментов, участвующих в фазе II реакций детоксификации окислительных повреждений путем синтеза низкомолекулярного антиоксиданта глутатиона (GSH); расщепление крахмала до растворимых сахаров, опосредованного бета-амилазой, и трансформация сахарозы до раффинозы, глюкозы и фруктозы, опосредованной ферментом SUS4; механизм защиты салицилата, опосредованный галактинолом и раффинозой от атаки гидроксильными радикалами; предотвращение дегидратации клеточных компонентов за счет транслокации белков; активация механизмов альтернативного сплайсинга и синтез белков, участвующих в транскрипционной регуляции и регуляции онтогенетических процессов. Специфический ответ на низкотемпературное воздействие у растений чая включал повышенную экспрессию генов: SnRK1.2, HXK1/2, и bHLH7/43/79/93, которые задействованы в следующих механизмах: HXKs и SnRK1-опосредованная активация углеводного сигнала путем модуляции количества транскриптов различных генов углеводного обмена и интеграции субстратов стрессовых реакций, включая АБК и этилен, процессы фосфорилирования глюкозы и фруктозы; АБК-зависимый механизм с участием белков цинковых пальцев (ZAT, WRKY) и позднего эмбриогенеза (LEA); активация механизмов флагеллинового сигнала и механизмов патогенез-относящейся иммунной защиты, опосредованных белками FLS2 и TLP; укрепление клеточной стенки путем ремоделирования пектина с участием PRP и GRP, ковалентно связанных с пектином или гемицеллюлозой. Специфический ответ на засуху у растений чая предположительно обусловлен экспрессией генов RHL41, CAU1, и Hydrolase22 и следующими механизмами: активизацией внеклеточных и внутриклеточных сигнальных рецепторов (кальциевый сигналинг, АБК-сигналинг, активацией протеинкиназных рецепторов мембран); АБК-опосредованный механизм регуляции водного баланса (закрытие устьиц, повышение гидравлической проводимости корня и стимуляция роста корня при соответствующем ингибировании роста стеблей); ремоделированием клеточных стенок, поддержанием их эластичности и повышением толщины ее за счет усиления вторичной стенки отложениями гемицеллюлозы и лигнина. На клеточном и тканевом уровнях (in vitro) подтвердилось вовлечение ряда генов ответа на засуху, связанных с механизмами активации углеводного обмена, АБК-опосредованного стрессового ответа, синтеза жасмоната и оксилипина. В фазу восстановления растений после стресса (засуха и холод) общим механизмом являлась экспрессия CIP-генов (семейство дегидринов), функционально вовлеченных в процессы защиты мембран макромолекулярных структур от коагуляции или секвестрации ионов кальция путем ассоциации или дис-ассоциации с мембраной. Механизмы, связанные с ремоделированием клеточных стенок, в частности диметилэстерификации пектина, опосредованный геном PME41, также были активны в фазу восстановления. В целом на основе биохимических, фенотипических и генетических данных установлено, что холодовое воздействие в сравнении с засухой приводит к более выраженным ответным реакциям растений на физиолого-биохимическом и молекулярном уровнях (более существенные изменения физиолого-биохимического профиля, вовлеченность большего количества генов с наиболее высоким уровнем экспрессии). Устойчивые генотипы чая раньше реагируют на всех уровнях на стресс-фактор, для них характерно более раннее «распознавание» стресса и более активная экспрессия ряда генов и выработка метаболитов, необходимых для защиты клеточных мембран. Полученные результаты вошли в публикации Frontiers in Genetics 2020 DOI: 10.3389/fgene.2020.611283; MDPI Plants 2020, 9(12), 1795; https://doi.org/10.3390/plants9121795 и PeerJ, 2020,8(12):e9787 DOI 10.7717/peerj.9787.