КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер 18-75-10069

НазваниеРазработка стратегии создания высокопермиссивных к вирусу гриппа клеточных линий для получения вакцинных препаратов

РуководительСтепанов Григорий Александрович, Кандидат химических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт химической биологии и фундаментальной медицины Сибирского отделения Российской академии наук, Новосибирская обл

Период выполнения при поддержке РНФ

07.2018 - 06.2021

Конкурс№30 - Конкурс 2018 года по мероприятию «Проведение исследований научными группами под руководством молодых ученых» Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными, в том числе молодыми учеными.

Область знания, основной код классификатора 05 - Фундаментальные исследования для медицины, 05-401 - Молекулярная и клеточная медицина

Ключевые словавирус гриппа, пермиссивность клеточных культур, накопление вируса гриппа, факторы противовирусной устойчивости, геномное редактирование, CRISPR/Cas9, культуральные вакцины против гриппа

Код ГРНТИ34.15.31

СтатусУспешно завершен

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Грипп представляет собой растущую угрозу для здоровья населения во многих странах с ежегодными эпидемиями в зимний период, сопровождающимися значительным подъемом заболеваемости и смертности. Ежегодно в эпидемический сезон в России заболевает до 10% населения, а от гриппа и его осложнений умирает несколько тысяч человек. Вакцинопрофилактика является наиболее рациональной стратегией борьбы с гриппозной инфекцией. При этом современный метод производства противогриппозных вакцин, основанный на накоплении вирусов гриппа в развивающихся куриных эмбрионах, очень трудоемок, длителен и требует больших расходов. Такая технология требует, чтобы выбор используемого штамма вируса был произведен за много месяцев до начала сезона повышенной заболеваемости, что значительно повышает вероятность несоответствия вакцины вирусу, для профилактики которого она предназначена. Кроме того, культивирование вируса на куриных эмбрионах способствует непроизвольному отбору штаммов и накоплению адаптивных мутаций, что еще больше повышает вероятность несостоятельности вакцины. Таким образом, в настоящее время существует очевидная потребность в разработке более быстрых и технологически более совершенных подходов к производству вакцин. В то же время технология производства противогриппозных вакцин с использованием человеческих клеточных культур является более гибкой и быстрой, а также лишенной всех перечисленных недостатков. Использование клеточных культур человеческого происхождения для накопления вирусов гриппа осложняется недостаточной изученностью механизмов пермиссивности клеток к гриппозной инфекции. Целью данного проекта является исследование факторов пермиссивности клеточных культур к гриппозной инфекции методами геномной инженерии. С использованием системы геномного редактирования CRISPR/Cas9 в ходе проекта будут получены культивируемые линии клеток человека, дефектные по одному из генов IFITM3, IRF7 или AnxA6 для обеспечения эффективной репликации широкого спектра вирусов гриппа с максимальным сохранением их антигенных свойств. Для клеточных линий с повышенной продуктивностью по отношению к вирусу гриппа будут охарактеризованы профили транскрипционной активности генов в условиях заражения вирусами гриппа с применением методов массового параллельного секвенирования. Будут выявлены регуляторные пути, формирующие признак пермиссивности клеток человека к вирусу гриппа при подавлении активности генов IFITM3, IRF7 и AnxA6. Одним из ключевых фундаментальных вопросов является возможность направленного формирования пермиссивности клеток человека к вирусам гриппа при подавлении активности единичных генов или группы из нескольких генов. Полученные клеточные линии могут быть использованы для высокопроизводительной наработки вакцин против вируса гриппа. Модифицированные клеточные культуры могут также применяться на этапе определения штаммов вируса гриппа, циркулирующих в конкретный эпидемический период. Данные об антигенных и молекулярно-генетических свойствах циркулирующих вирусов, выделенных на клеточных культурах, могут быть использованы при выборе актуальных штаммов для создания противогриппозных вакцин. Результаты проекта нацелены на разработку новых подходов к улучшению противовирусной вакцинации в рамках модернизации технологий здоровьесбережения.

Ожидаемые результаты
Будут получены культивируемые линии клеток человека, дефектные по ряду выбранных генов противовирусной системы клеток человека для обеспечения эффективной репликации широкого спектра вирусов гриппа с максимальным сохранением их антигенных свойств. В соответствии с планом проекта, будут созданы линии, дефектные по одному или более генам из IFITM3, IRF7 и AnxA6 на основе исходных культур 293FT, WI-38, MRC-5. Для полученных линий будет проведена оценка их пермиссивности к гриппозной инфекции. Для полученных клеточных линий с повышенной чувствительностью к инфекции вирусом гриппа будут охарактеризованы профили транскрипционной активности генов с применением методов массового параллельного секвенирования (RNA-Seq). Будут выявлены регуляторные пути, формирующие признак пермиссивности клеток человека к вирусу гриппа при подавлении активности выбранных генов. Применение запланированных культур и данных о регуляторных путях, формирующих чувствительность к инфекции, позволят реализовать рациональный подбор клеточных линий на стадиях выделения сезонных штаммов и получения вакцинных препаратов. Реализация данного проекта станет основополагающей для формирования нового подхода к получению клеточных культур для наработки вакцинных препаратов.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
В рамках разработки стратегии создания высокопермиссивных к вирусу гриппа клеточных линий были выбраны гены из системы регуляции противовирусного ответа. В качестве модели для изучения молекулярных механизмов вирусной инфекции и путей формирования пермиссивности, а также оценки эффективности функционирования систем геномного редактирования была выбрана клеточная линия эмбриональных фибробластов почки человека HEK293FT (293FT). Первоначально был охарактеризован базовый уровень экспрессии генов-мишеней по уровню мРНК и белковых продуктов в клетках 293FT. С использованием системы CRISPR/Cas9 в ходе проекта были получены культивируемые моноклональные линии клеток человека с мутациями в целевых участках генов AnxA6, IRF-7 и IFITM3. Для полученных линий был описан характер CRISPR/Cas9-опосредованных мутаций и охарактеризован уровень экспрессии генов-мишеней. Далее было проведено комплексное исследование для оценки продуктивности наработки модельного вируса гриппа H1N1 в полученных клеточных линиях. Было показано, что нокаут генов AnxA6 и IRF-7 приводит к повышению эффективности накопления вируса внутри клеток. При этом нокаут единичных генов обеспечил умеренное повышение в продукции зрелых вирусов. С помощью транскриптомного анализа экспрессии генов в клетках исходной линии и клеток с нокаутом генов-мишеней после заражения вирусом были выявлены группы генов с изменившимся уровнем экспрессии и сформированы функциональные кластеры. Полученные данные позволяют заключить, что гены AnxA6 и IRF-7 могут быть использованы в качестве мишеней в стратегии формирования и повышения пермиссивности клеток человека в отношении вируса гриппа A. В дальнейшей при разработке стратегии повышения пермиссивности будут использованы клеточные линии, рекомендованные к наработке вакцинных штаммов вирусов, а именно WI-38 и MRC-5. Полученные результаты представлены на российских конференциях CRISPR-2018 и OpenBio-2018 и подготовлена публикация для журнала Virus Research. Информационные ресурсы в сети Интернет, посвященные проекту реализации: статья в издании «Наука в Сибири» http://www.sbras.info/articles/science/nokautirovat-gen-chtoby-pobedit-gripp .

Публикации

1. Комиссаров А.Б., Сергеева М.В., Медведев С.П., Малахова А.А., Андреева Е.Д., Шурыгина А.-П.С., Васильев К.А., Горшков А.Н., Тимофеева М.М., Балахонова Е.А., Грудинин М.П., Закиян С.М., Рихтер В.А., Степанов Г.А. CRISPR-Cas9 mediated knockout of AnxA6 gene enhances influenza A virus replication in low-permissive HEK293FT cell line Virus Research, - (год публикации - 2019)

2. Можаева Е.В., Степанов Г.А. CRISPR/Cas9 опосредованный нокаут генов врожденного иммунного ответа для получения клеточной линии, пермиссивной к вирусу гриппа A Материалы 57-й Международной научной студенческой конференции: Биология, с. 85 (год публикации - 2019)

3. Можаева Е.В., Степанов Г.А., Журавлев Е.С., Семенов Д.В., Балахонова Е.А., Касакин М.Ф., Махмуд Р. Ш., Маланин С.Ю., Григорьева Т.Ю., Сергеева М.В., Комиссаров А.Б. 293FT — модель для изучения молекулярных механизмов инфекции вируса гриппа А Сборник тезисов V Международной конференции молодых ученых: биотехнологов, молекулярных биологов и вирусологов, АНО «Инновационный центр Кольцово», Новосибирск, с. 331-334 (год публикации - 2018)

4. Степанов Г.А., Сергеева М.В., Медведев С.П., Малахова А.А., Андреева Е.Д., Шурыгина А.-П.С., Горшков А.Н., Тимофеева М.М., Балахонова Е.А., Грудинин М.П., Рихтер В.А., Комиссаров А.Б. Геномный нокаут факторов противовирусной устойчивости для создания клеточных линий для продукции штаммов вируса гриппа Гены & Клетки, Т. XIII, № 2, Приложение, №2, 2018, с. 49. (год публикации - 2018)

5. - Нокаутировать ген, чтобы победить грипп Наука в Сибири, 28 февраля 2019 года № 8 (3169), С. 4 (год публикации - )

Аннотация результатов, полученных в 2019 году
В рамках разработки стратегии создания высокопермиссивных к вирусу гриппа клеточных линий были получены модифицированные клетки человека с нокаутом одного из генов каскада врожденного иммунного ответа IRF7, AnxA6 и IFITM3. Для полученных линий был описан характер CRISPR/Cas9-опосредованных мутаций, охарактеризован уровень экспрессии генов-мишеней, проведена оценка пролиферации по сравнению с исходными линиями 293FT и WI-38 VA-13 subline 2RA. Показано, что нокаут выбранных генов-мишеней позволяет повышать продуктивность клеток человека в наработке вирусных частиц гриппа А. Для описания механизмов наблюдаемого изменения свойств клеток человека проведено транскриптомное исследование путей регуляции экспрессии генов в клетках человека с описанными мутациями в генах-мишенях. Полученные результаты представлены на зарубежных конференциях Options X for the Control of Influenza и CRISPR Technologies Conference, на российских конференциях «Белки и пептиды» и «Биотехнология – медицине будущего», а также вошли в состав экспериментальной статьи. Теоретические этапы работы по проекту были опубликованы в виде обзоров в журнале Биоорганическая химия (английская версия) и Biochimie. Информационные ресурсы в сети Интернет, посвященные проекту реализации: ресурс «Новосибирские новости» http://nsknews.info/materials/uchyenye-predlozhili-delat-vaktsinu-ot-grippa-na-osnove-kletok-cheloveka/

Публикации

1. А. Б. Комиссаров, М. В. Сергеева, Е. В. Можаева, Н. В. Ещенко, А. Д. Васильева, К. А. Васильев, С. П. Медведев, А. А. Малахова, Е. А. Балахонова, С. Ю. Маланин, Т. В. Григорьева, Е. С. Журавлев, Д. В. Семенов, В. А. Рихтер, Г. А. Степанов Increasing the susceptibility of HEK293FT cell line to influenza infection by CRISPR-CAS9 mediated knockout Russian Journal of Bioorganic Chemistry, Vol. 45, No. 6, pp. 748–756 (год публикации - 2019) https://doi.org/10.1134/S1068162019060232

2. Амирханов Р.Н., Степанов Г.А. Systems of Delivery of CRISPR/Cas9 Ribonucleoprotein Complexes for Genome Editing Russian Journal of Bioorganic Chemistry, Vol. 45, No. 6, pp. 431–437 (год публикации - 2019) https://doi.org/10.1134/S1068162019060025

3. Филиппова Ю.А., Матвеева А.М., Журавлев Е.С., Степанов Г.А. Guide RNA modification as a way to improve CRISPR/Cas9-based genome-editing systems Biochimie, V. 167, 49-60 (год публикации - 2019) https://doi.org/10.1016/j.biochi.2019.09.003

4. Комиссаров А.Б., Сергеева М.В., Медведев С.П., Васильев К.А., Васильев А. Д., Малахова А.А., Тимофеева М.М., Балахонова Е.А., Грудинин М.П., Закиян С.М., Рихтер В.А., Степанов Г.А. INCREASING THE SUSCEPTIBILITY OF HEK293FT CELL LINE TO INFLUENZA INFECTION BY CRISPR-CAS9 MEDIATED KNOCKOUT OF PARTICULAR GENES Abstracts Options X for the Control of Influenza, C. 286 (год публикации - 2019)

5. Комиссаров А.Б., Сергеева М.В., Медведев С.П., Малахова А.А., Можаева Е.В., Шурыгина П.С., Журавлев Е.С., Балахонова Е.А., Горшков А.Н., Грудинин М.П., Рихтер В.А., Степанов Г.А. Создание клеточной линии для продукции штаммов вируса гриппа с помощью CRISPR/Cas9-направленного геномного нокаута ACTA NATURAE, СПЕЦВЫПУСК том 2, с. 49 (год публикации - 2019)

6. М.В. Сергеева, А.Б. Комиссаров, С.П.Медведев, Е.С.Журавлев, А.Д. Васильева, А.А. Малахова, Н.В. Ещенко, Г.А. Степанов Особенности CRISPR/CAS9 опосредованного геномного нокаута факторов, противодействующих гриппозной инфекции, в клетках HEK293 Гены & Клетки, XIV, №3, С.115 (год публикации - 2019)

7. Можаева Е.В., Ещенко Н.В., Журавлев Е.С., Сергеева М.В., Комиссаров А.Б.. Степанов Г.А. Разработка стратегии CRISPR/Cas9 опосредованного нокаута генов IRF7 и IFITM3 для получения пермиссивной клеточной линии к вирусу гриппа А Материалы Всероссийской мультиконференции с международным участием "Биотехнология – медицине будущего", с. 195 (год публикации - 2019)

8. Н.В. Ещенко, Е.В. Можаева, М.В. Сергеева, А.Д. Васильева, К.A. Васильев, С.П. Медведев, А.А. Малахова, Е.С. Журавлев, Д.В. Семенов, А.Б. Комиссаров, Г.А. Степанов НОКАУТ ГЕНОВ IRF7 И IFITM3 ПРИ ПОМОЩИ СИСТЕМЫ CRISPR/CAS9 В КЛЕТКАХ ЧЕЛОВЕКА ACTA NATURAE, СПЕЦВЫПУСК том 2, с.96 (год публикации - 2019)

9. Степанов Г.А., Сергеева М.В., Можаева Е.В., Ещенко Н.В., Медведев С.П., Малахова А.А., Шурыгина П.С., Семенов Д.В., Журавлев Е.С., Балахонова Е.А., Рихтер В.А., Комиссаров А.Б. Создание и изучение клеточных линий с CRISPR/Cas9-направленным нокаутом индивидуальных генов для повышенной продукции вируса гриппа Материалы Всероссийской мультиконференции с международным участием "Биотехнология – медицине будущего", С. 215 (год публикации - 2019)

10. - Учёные предложили делать вакцину от гриппа на основе клеток человека НОВОСИБИРСКИЕ НОВОСТИ, 27 Сентября 2019 (год публикации - )

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
В рамках разработки стратегии создания высокопермиссивных к вирусу гриппа клеточных линий были получены модифицированные клетки человека с нокаутом одного из генов каскада врожденного иммунного ответа IFITM3, IRF-9 и EIF2AK2. Для полученных линий был описан характер CRISPR/Cas9-опосредованных мутаций, охарактеризован уровень экспрессии генов-мишеней, проведена оценка пролиферации по сравнению с исходной линией эмбриональных фибробластов легких человека WI-38 VA-13 subline 2RA. Проведена оценка пермиссивности полученных линий к различным штаммам вируса гриппа А. Показано, что нокаут выбранных генов-мишеней позволяет повышать эффективность заражения клеток вирусом гриппа А и в ряде случаев повышать продуктивность клеток человека в наработке вирусных частиц гриппа А. Проведено транскриптомное исследование изменений в профиле экспрессии генов в модифицированных линиях по сравнению с исходной линией в условиях заражения различными штаммами вируса гриппа А. Выявлены механизмы, обеспечивающие повышение чувствительности клеток человека к заражению вирусом гриппа А. Предложены дальнейшие этапы стратегии формирования высокопермиссивных к вирусу гриппа клеточных линий. Результаты транскриптомного исследования, проведенного в рамках проекта, депонированы в базу ArrayExpress: https://www.ebi.ac.uk/arrayexpress/experiments/E- MTAB- 9511/

Публикации

1. Журавлев Е.С., Сергеева М.В., Маланин С.Ю., Амирханов Р.Н., Семенов Д.В., Григорьева Т.В., Комиссаров А.Б., Степанов Г.А. RNA-Seq transcriptome data of human cells infected with influenza A/Puerto Rico/8/1934 (H1N1) virus Data in brief, V. 33, 106604 (год публикации - 2020) https://doi.org/10.1016/j.dib.2020.106604

2. Ещенко Н.В., Сергеева М.В., Журавлёв Е.С., Комиссаров А.Б., Степанов Г.А. CRISPR/Cas9 опосредованный нокаут гена IFITM3 в клетках человека Сборник тезисов VII Международной конференции молодых ученых: биофизиков, биотехнологов, молекулярных биологов и вирусологов, стр. 58-59 (год публикации - 2020)

3. Корябина К.С., Ещенко Н.В., Степанов Г.А, Комиссаров А.Б., Сергеева М.В. Нокаутирование гена IFITM3 повышает восприимчивость клеток WI-38 к вирусу гриппа А Медико-биологические и нутрициологические аспекты здоровьесберегающих технологий : материалы I Международной научно- практической конференции (Кемерово, 27 ноября 2020 г.), - (год публикации - 2020)

4. Сергеева М.В., Ещенко Н.В., Васильева А.Д., Васильев К.А., Журавлев Е.С., Комиссаров А.Б., Степанов Г.А. CRISPR/Cas9-mediated knockout of host restriction factors allows increasing influenza A virus replication in human cell line FEBS Open Bio supplement, - (год публикации - 2021)

Возможность практического использования результатов
Результаты проекта будут востребованы для создания высокопермиссивных к вирусу гриппа клеточных линий, которые могут быть использованы в биотехнологическом производстве вакцинных штаммов вирусов. Наибольшую актуальность задача по созданию клеточных субстратов получила в результате развития текущей пандемии новой коронавирусной инфекции, которая продемонстрировала эффективность применения векторных вариантов вакцин, производство которых требует усовершенствованных подходов к накоплению вирусных препаратов в культурах клеток.