КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер 18-75-10030

НазваниеВлияние структурно-функциональных свойств эритроцитов на формирование нестабильных атером в патогенезе атеросклероза

РуководительКонохова Анастасия Игоревна, Кандидат физико-математических наук

Организация финансирования, регион федеральное государственное бюджетное учреждение «Национальный медицинский исследовательский центр имени академика Е.Н. Мешалкина» Министерства здравоохранения Российской Федерации, Новосибирская обл

Период выполнения при поддержке РНФ

07.2018 - 06.2021

Конкурс№30 - Конкурс 2018 года по мероприятию «Проведение исследований научными группами под руководством молодых ученых» Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными, в том числе молодыми учеными.

Область знания, основной код классификатора 05 - Фундаментальные исследования для медицины, 05-202 - Сердечно-сосудистая система

Ключевые словаэритроциты, атеросклероз, нестабильная атерома, гликированный гемоглобин, проточная цитометрия

Код ГРНТИ76.03.29

СтатусУспешно завершен

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Несмотря на увеличение ежегодных показателей своевременной диагностики и развитие новых терапевтических методик, атеросклероз и его осложнения, приводящие к таким сердечно-сосудистым заболеваниям (ССЗ), как ишемическая болезнь сердца, инсульт и болезни периферических артерий, занимают лидирующие позиции среди непосредственных причин смерти не только на территории Российской Федерации, но и во всем мире. Именно по причине широкой распространённости, сохраняющейся тенденции к росту числа больных, высокой смертности и ранней инвалидизации атеросклероз и вызываемые им ССЗ представляют острейшую медико-социальную проблему. В связи с этим вопросы, связанные с диагностикой, профилактикой и терапией атеросклероза, призванных сократить темпы роста численности больных, а также значительно уменьшить риск развития сердечно-сосудистых осложнений, увеличить продолжительность жизни больных и минимизировать социально–экономические потери, представляет особую актуальность и поставлены во многих странах на государственный уровень. Одним из основных проявлений атеросклероза является формирование атеросклеротических бляшек (АБ), нестабильность которых во многом определяет риск развития фатальных сердечно-сосудистых событий. Несмотря на существенный прогресс в развитии клинических методов диагностики атеросклероза, дифференцирование стабильных и нестабильных АБ до сих остается наиболее сложной диагностической задачей, в решении которой особое место отводится выявлению новых факторов дестабилизации атером, которые имели бы наибольшую предсказательную ценность. Согласно имеющимся в литературным данным, среди множества процессов, способствующих дестабилизации АБ, важную роль играет возникновение гипоксических состояний в различных участках сосудов, которые так или иначе связаны с функцией эритроцитов. При этом, несмотря на множество разрозненных литературных данных, напрямую или косвенно указывающих на важную роль, которую могут играть эритроциты в патогенезе атеросклероза, вопросы об их вкладе в развитие патологии и о месте, которое они занимают в цепи событий, приводящих к кардиоваскулярным и атеротромботическим осложнениям, до сих пор остаются открытыми. Настоящий проект направлен на исследование роли эритроцитов в патогенезе атеросклероза и развития его осложнений, и, в частности, на проверку гипотезы, согласно которой нарушение газотранспортной функции эритроцитов, вследствие изменения морфологических и функциональных характеристик клеток, является одним из факторов риска дестабилизации атером и развития атеротромботических осложнений. Для решения поставленных задач, в данном проекте планируется проведение комплексного исследования морфологии и функциональных свойств эритроцитов в норме и при атеросклерозе с использованием самых современных методов оптического анализа дисперсных сред, а именно сканирующей проточной цитометрии. Данная технология позволяет измерять зависимость интенсивности рассеянного излучения от угла (индикатрису светорассеяния) для одиночных частиц в потоке с большой скоростью (до 1000 частиц в секунду). В совокупности с передовыми методами решения прямой и обратной задачи светорассеяния и математического моделирования внутриклеточных процессов (модель лизиса эритроцитов в изотоническом растворе), данный метод позволяет получить детальную информацию о форме клеток (диаметр, максимальная и минимальная толщина, объем, площадь поверхности, индекс сферичности, спонтанная кривизна), структурно-функциональных свойствах мембраны (эластичность, скорость анионного обмена) и содержании гемоглобина в одиночных эритроцитах. В рамках клинических исследований данного проекта будет проведен комплексный анализ эритроцитов у пациентов атеросклерозом брахиоцефальных артерий и условно здоровых волонтеров (контрольная группа). У испытуемых также будут определены стандартные диагностические показатели, включающие оценку липидных нарушений (ХС, триглицериды, α-ХС, β-ХС) и уровень гликированного гемоглобина. По результатам сопоставления совокупности полученных данных будут выявлены те характеристики эритроцитов, отклонения которых, во-первых, несут наибольший вклад в нарушение газотранспортной функции эритроцитов при атеросклерозе, а, во-вторых, имеют наибольший прогностический потенциал в оценке риска развития атеросклероза по результатам сопоставления со стандартными диагностическими показателями. У пациентов с доказанным атеросклерозом будет проведена оценка стабильности атером методами триплексного УЗИ и МРТ ангиографии, а также по результатам патоморфологического исследования бляшек, удаленных при каротидной эндартерэктомии. Сопоставление данных оценок с результатами комплексной характеризации эритроцитов, осуществленной с помощью сканирующего проточного цитометра (СПЦ), позволит выявить взаимосвязь между отклонениями морфофункциональных характеристик эритроцитов и риском развития нестабильных АБ. Таким образом, в результате проведения комплекса запланированных исследований будет подтверждена или опровергнута выдвигаемая гипотеза, согласно которой нарушение газотранспортной функции эритроцитов, вследствие изменения морфологических и функциональных характеристик клеток, является одним из факторов риска дестабилизации атером и развития атеротромботических осложнений при атеросклерозе. Помимо конкретных практических задач, перечисленных выше, в рамках проекта также подразумевается разработка нового подхода к оценке гликозилированного гемоглобина (HbA1c) в одиночных эритроцитах на основе прецизионного измерения показателя преломления одиночных клеток с СПЦ, и усовершенствование методики иммуннотурбидиметрической оценки уровня HbA1c в крови с помощью адаптивного поляризационного нефелометра. В рамках проекта планируется дальнейшее развитие метода сканирующей проточной цитометрии как в инструментальной части (модернизация оптического блока СПЦ, в т.ч. для измерения большого объема оптической информации от отдельных частиц), так и в алгоритмической части (развитие общих подходов решения параметрической обратной задачи светорассеяния с использованием нескольких одновременно измеряемых сигналов). С одной стороны, это приведет к улучшению точности характеризации эритроцитов, что будет способствовать решению вышеописанных задач. С другой стороны, данные методы находятся на переднем крае развития биомедицинской оптики и актуальны во многих других приложениях. В результате проведения запланированных исследований будет получена новая информация как о роли эритроцитов в патогенезе атеросклероза и сердечно-сосудистых заболеваний, так и о факторах, приводящих к дестабилизации атеросклеротических бляшек и развитию острых атеротромботических событий. Характеристики эритроцитов, которые по результатам исследований покажут наибольшую диагностическую ценность, могут послужить новыми независимыми факторами риска, оценка которых позволит повысить качество диагностики атеросклероза и его осложнений. Это приведет к увеличению вероятности выявления атеросклероза на ранних этапах развития, позволит прогнозировать течение заболевания и оценивать эффективность проводимой терапии для подбора корректирующего медикаментозного лечения.

Ожидаемые результаты
Касаемо основной цели проекта: 1. Будет проверена гипотеза, согласно которой нарушение газотранспортной функции эритроцитов, вследствие изменения морфологических и функциональных характеристик клеток, является одним из факторов риска дестабилизации атером и развития атеротромботических осложнений при атеросклерозе. 2. Впервые будет проведено комплексное исследование эритроцитов, включающее определение морфологических и функциональных характеристик клеток, а именно анализ формы (диаметр, максимальная и минимальная толщины, объем, площадь поверхности, индекс сферичности, спонтанная кривизна), структурно-функциональных свойств мембраны (эластичность, скорость анионного обмена) и содержания гемоглобина в одиночных клетках методом сканирующей проточной цитометрии, в норме и при атеросклерозе. 3. Будут выявлены характеристики эритроцитов, отклонения которых имеют наибольший прогностический потенциал в диагностике и профилактике атеросклероза. 4. В результате будет получена новая информация как о роли эритроцитов в патогенезе атеросклероза и сердечно-сосудистых заболеваний, так и о факторах, приводящих к дестабилизации атеросклеротических бляшек и развитию острых атеротромботических событий. Для достижения вышеупомянутых результатов в проекте будут разработаны и получены: 1. Метод оценки доли гликозилированного гемоглобина в одиночных эритроцитах на сканирующем проточном цитометре, модернизированном для одновременного измерения индикатрис светорассеяния эритроцитов на двух длина волн, одна из которых совпадает с полосой поглощения гемоглобина (415 или 580 нм), а также для измерения автофлуоресценции гемоглобина, возбуждаемой импульсным лазером с длиной волны 308 нм и регистрируемой в области 350 нм. В отличие от стандартных методов измерения общего уровня гликозилированного гемоглобина в крови, данный метод впервые позволит оценивать долю гликозилированного гемоглобина в каждом эритроците и измерять его распределение по популяции клеток, тем самым повышая информативность анализа по определению уровня гликемии и комплексного морфо-функционального анализа эритроцитов с помощью сканирующей проточной цитометрии. 2. Модернизированный сканирующий проточный цитометр для одновременного измерения индикатрисы светорассеяния в переднюю и заднюю полусферу на двух длинах волн. Это позволит измерять форму и соответствующие морфологические характеристики эритроцитов и других несферических частиц сложной формы с субдифракционной точностью, а также поднимет мировой уровень науки в области поштучного анализа полидисперсных систем. 3. Общие подходы решения параметрической обратной задачи светорассеяния с использованием нескольких одновременно измеряемых сигналов. В комбинации с новыми инструментальными возможностями, описанными в предыдущих пунктах, это приведет к беспрецедентной (в мировом масштабе) точности характеризации морфологии отдельных частиц. Применительно к эритроцитам это позволит с высокой точностью определять форму и измерять содержания гемоглобина в одиночных эритроцитах, в т.ч. оценивать долю гликозилированного гемоглобина по определению реальной и мнимой части показателя преломления клеток. С одной стороны, это позволит достичь заявленных выше результатов. С другой – откроет новые возможности в анализе других объектов биологического или искусственного происхождения в составе различных полидисперсных сред. 4. Усовершенствованная методика иммуннотурбидиметрического измерения концентрации гликозилированного гемоглобина в крови по иммуноагглютинации на адаптивном поляризационном нефелометре. По сравнению со стандартным иммунотурбидиметрическими методами, данная методика за счет применения новых инструментальных решений в области детектирования продуктов агрегации и последних достижении в области моделирования агрегации полимерных микросфер, позволит с более высокой точностью и надежностью определять концентрацию гликозилированного гемоглобина в крови без использования калибровочных процедур, тем самым снизив стоимость проведения анализа.

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Приоритетным направлением работ в первый год реализации проекта было развитие технологии сканирующей проточной цитометрии (СПЦ) для комплексной морфологической и функциональной характеризации эритроцитов, с целью повышения точности, информативности и воспроизводимости результатов анализа клеток, получаемых на основании измерения сигналов светорассеяния. Особый акцент ставился на развитии методик, связанных с измерением тех параметров эритроцитов, которые характеризуют их способность выполнять газотранспортную функцию. Работы велись сразу по нескольким направлениям, затрагивающим инструментальную, теоретическую, и экспериментальную стороны технологии. С позиции усовершенствования инструментальной части, была проведена модернизация оптического блока СПЦ для одновременной регистрации индикатрис светорассеяния, измеряемых на разных длинах волн. Благодаря увеличенному количеству измеряемой оптической информации достигнута высокая точность измерения характеристик сферических частиц, а именно, точность оценки диаметра частиц до нескольких нанометров и точность измерения показателя преломления до 4 знака. Были решены две важных задачи, касающиеся анализа данных, получаемых с СПЦ в виде индикатрис светорассеяния, и извлечения из них информации о форме и других характеристиках клеток. Благодаря развитию параметрического подхода к решению обратной задачи светорассеяния, разработаны методы (1) экспресс-идентификации сферизованных эритроцитов, чья форма в процессе лизиса, измеряемого на СПЦ, максимально точно описывается сферической моделью, и (2) экспресс-характеризации сферизованных эритроцитов, позволяющий на порядок ускорить оценку их размера и показателя преломления по сравнению с решением обратной задачи прямой подгонкой с использованием теории Ми. Результаты, достигнутые в ходы выполнения данных работ, изложены в 3 статьях, подготовленных и направленных в международные рецензируемые журналы. Необходимость точной идентификации и измерения характеристик сферизованных эритроцитов на СПЦ обусловлена предлагаемыми методами для оценки доли содержащегося в клетках гликированнного (HbA1с) гемоглобина, и оценки долевое соотношения оксигенированного (oxyHb) и дезоксигенированного (deoxyHb) гемоглобина. Развиваемые в работе методы основаны на прецизионном измерении показателя преломления эритроцитов, получаемых в результате обработки индикатрис светорассеяния, регистрируемых для одиночных эритроцитов на двух длинах волн: 660 нм, где оптические свойства разных типов гемоглобина не имеют никаких особенностей, и на длине волны, находящейся вблизи зоны поглощения той или иной формы гемоглобина, включая HbA1с (поглощение 415 и 540 нм) и deoxyHb (поглощение 443 нм). Теоретические расчеты показали, что индикатриса светорассеяния, измеряемая на СПЦ, на длине волны 540 нм имеет низкую чувствительность к концентрации гликированного гемоглобина, и демонстрирует максимальную чувствительность на длине волны 415 нм. Получено экспериментальное подтверждение того, что имеющаяся практическая реализация прибора с лазерами 405 нм и 660 нм, не позволяет производить оценку концентрации гликированного гемоглобина с необходимой точностью, а потому оптическая конструкция требует замены лазера 405 на 415 нм. Произвести указанную замену в отчетный период не удалось, однако вместо этого был установлен лазер 443 нм, для того, чтобы перейти к еще одной важной задаче: оценке доли oxyHb и deoxyHb в эритроцитах. Еще одним важным шагом в усовершенствовании метода характеризации эритроцитов по светорассеянию, измеряемому на СПЦ, стало расширение базы данных индикатрис эритроцитов, используемой для подгонки экспериментальных индикатрис и извлечения из них характеристик эритроцитов, заложенных в их оптической модели. Расширенная база данных индикатрис позволяет характеризовать эритроциты в нативном состоянии, учитывая формы, приближенные к сферам. Экспериментальная апробация показала, что насчитанная база позволяет получать надежные и воспроизводимые результаты, извлекать большое количество информации о форме, размерах, содержании гемоглобина одиночных эритроцитов. Среди измеряемых на СПЦ характеристик эритроцитов будет проводиться поиск новых диагностических маркеров по результатам сравнения данных, полученных у условно-здоровых доноров и пациентов с диагностированным атеросклерозом, в т.ч. с различными формами его осложнения. Предложен метод оценки HbA1с в эритроцитах, основанный на прецизионном измерении объема и концентрации гемоглобина в одиночных эритроцитах, и установлении связи измеряемых характеристик с условным возрастом клеток и степенью гликозилирования гемоглобина, взаимосвязь которых подтверждается недавними исследованиями. Для выявления данной корреляции проанализированы характеристики эритроцитов, измеренные на СПЦ у условно-здоровых доноров с нормальным уровнем HbA1с (≤6%) и у группы пациентов с повышенным уровнем HbA1с (значение HbA1с в каждом случае было измерено независимо стандартным способом). Для описания зависимости была предложена функция, описывающая эволюцию параметров эритроцитов на карте объем vs содержание гемоглобина. Показано наличие корреляции между параметром - переходный условный возраст эритроцитов и результатами измерения доли HbA1с иммунологическим методом. Помимо этого, на основании полученных результатов было предложено описание популяции эритроцитов по условному возрасту. Дальнейшее развитие и верификация данного подхода, с возможностью создания патента, входит в план работ на второй год проекта. Разработан протокол измерения актуального и предельного значения анионного обмена эритроцитов на СПЦ с использованием блокатора кальциевых каналов – нифедипина (в диапазоне концентраций от 60 до 100 мкМ). Предложена молекулярно-кинетическая модель данного процесса. Она включает: 1) связывания с нифедипина мембраной эритроцитов; 2) ингибирование кальциевых каналов и насосов; 3) накоплению ионов кальция внутри клеток; 4) увеличение скорости анионного обмена. Проведена экспериментальная апробация предлагаемой модели на данных, получаемых при измерении эритроцитов на СПЦ. На основании полученных данных разработан детальный протокол для измерения актуального и предельного значения анионного обмена популяции эритроцитов на СПЦ. Были проведены пилотные исследования по сопоставлению результатов морфологических характеристик эритроцитов, измеренных на СПЦ для условно-здоровых доноров (N=20) и пациентов с диагностированным атеросклерозом (N=13). Было выявлено несколько статистических значимых отличий. В группе пациентов величина минимальной толщине эритроцита в среднем выше на 11% выше по сравнению с контрольной группой. Так же безразмерный параметр спонтанной кривизны мембраны, отвечающий за структурные свойства мембраны и степень вогнутости эритроцитов, выше на 12% у пациентов. Выраженное различие между исследуемыми группами удалось зафиксировать в коэффициенте корреляции Пирсона между содержанием гемоглобина и объема в одиночных эритроцитах. Среди функциональных характеристик эритроцитов наибольшее различие для пациентов и контрольной группы показала средняя предельная текучесть мембраны эритроцитов, характеризующая отношение жесткости к эластичности мембраны, которая оказался в два раза выше у пациентов с атеросклерозом.

Публикации

1. Конохова А.И., Ястребова Е.С., Строкотов Д.И., Чернышев А.В., Карпенко А.А., Мальцев В.П. Ultimate peculiarity in angular spectrum enhances the parametric solution of the inverse Mie problem Journal of Quantitative Spectroscopy and Radiative Transfer, - (год публикации - 2019)

2. Романов А.В., Конохова А.И., Ястребова Е.С., Гилев К.В., Строкотов Д.И., Мальцев В.П., Юркин М.А. Sensitive detection and estimation of particle non-sphericity from the complex Fourier spectrum of its light-scattering profile Journal of Quantitative Spectroscopy and Radiative Transfer, - (год публикации - 2019)

3. Ястребова Е.С., Конохова А.И., Строктов Д.И., Карпенко А.А., Мальцев В.П., Чернышев А.В. Increase of HCO3-/Cl- transmembrane exchange rate in human erythrocytes by nifedipine Journal of Theoretical Biology, - (год публикации - 2019)

4. Новикова О.А, Локтионов П.П., Карпенко А.А. The roles of mechanotransduction, vascular wall cells, and blood cells in atheroma induction Vascular, - (год публикации - 2018) https://doi.org/10.1177/1708538118796063

Аннотация результатов, полученных в 2019 году
В текущем отчетном периоде большая часть работы была выделена на разработку методов, способствующих детальной характеризации популяции эритроцитов с целью повышения диагностической значимости выдаваемых параметров газотранспортной функции эритроцитов в организме. Кроме того, продолжалась работа по модернизации сканирующего проточного цитометра для проведения более длительных непрерывных кинетических экспериментов в режиме реального времени. Была реализована модернизация гидродинамического блока сканирующего проточного цитометра за счет замены плунжерной системы формирования потока внешней обжимающей струи на перистальтическую, после чего стало возможным непрерывное измерение эритроцитов в процессе гемолиза. Сделан значительный шаг вперед в задаче определения доли оксигенированного и деоксигенированного гемоглобина в одиночном сферизованном эритроците по сигналам светорассеяния измеряемым на СПЦ. С помощью последовательной обработки сигналов измеренных на длинах волн 660 нм и 443 нм достигнута точность измерения 13% доли оксигенированного гемоглобина. Был установлен оптимальный алгоритм определения диапазонов значения инварианта для поиска сфер среди подвергшихся гемолизу эритроцитов с использованием предельной особенности спектра от индикатрисы. Исследование работы алгоритма проверено на теоретических данных, найдены оптимальные диапазоны значений инварианта для выделения сферизованных эритроцитов. Подробно работа описана в статье «Spectral approach to recognize spherical particles among non-spherical ones by angle-resolved light scattering», отправленной в журнал Optics and Lasers in Engineering [IF = 4.059 (JCR = 2018), Q1]. Еще одним важным результатом работы стало расширение базы данных исследуемых доноров для публикации результатов по референсным значениям морфологических и функциональных характеристик эритроцитов, получаемых с помощью сканирующего проточного цитометра. Число исследованных условно здоровых доноров за отчетный период было увеличено вдвое и теперь составляет 40 человек. На основе этих данных подготовлена публикация «On the way to detailed inspection of a gas exchange function of human organism on cell level: scanning flow cytometry measures 48 indices of erythrocytes», где подробно описаны все способы расчета и значимость 48 параметров популяции эритроцитов и, самое главное, их диапазоны значений при условии отсутствии патологий. Было проведено клиническое обследование 17 пациентов с диагностированным атеросклерозом, включая сбор результатов общего (клинического) анализа крови и результаты оценки доли гликированного гемоглобина. Помимо клинического обследования проводилось патоморфологическое исследование атероматозных масс, удаленных во время каротидной эндартерэктомии из бифуркации сонной артерии у данных пациентов, с целью оценки стабильности удаленных атером. Стабильные бляшки с сохранением целостности фиброзной покрышки были выявлены в 6 (35%) случаях. Нестабильные бляшки встречались в 11 (65%) случаях. Было выявлено отличие в функциональных характеристиках эритроцитов. Количество активно работающих анионных обменников в группе пациентов со стабильной атеромой на 26% выше по сравнению с пациентами, у которых выявлена нестабильная атерома. Это показывает, что газотранспортная функция эритроцитов у пациентов со стабильной атеромой проявляет себя активнее, перекачивая большее число анионов через мембрану в единицу времени по сравнению с другими исследованными группами. Предельная растяжимость мембраны, характеризующая степень устойчивости к изотоническому гемолизу выше на 24% у так же выше у пациентов со стабильной атеромой, чем у обладателей нестабильной бляшки и на 15% выше группы условно здоровых доноров. Скорее всего данный эффект компенсирует повышенный гемолиз эритроцитов внутри атеросклеротических бляшек и способствует снижению количества разрушенных эритроцитов совместно с локальной гипоксией. В группе пациентов на 14% выше степень реакции на активацию анионных обменников, что информирует нас о сниженной нативной работе анионного обмена эритроцитов и как результат газотранспортной функции. По текущими результатам исследований, проводимых по теме проекта, опубликованы две статьи: 1) Yastrebova et. al., Proposed Dynamics of CDB3 Activation in Human Erythrocytes by Nifedipine Studied with Scanning Flow Cytometry. Cytometry Part A 95, 1275-1284 (2019) DOI: 10.1002/cyto.a.23918. Impact Factor - 3.43 Q2 (JCR 2018); 2) Konokhova et. al., Ultimate peculiarity in angular spectrum enhances the parametric solution of the inverse Mie problem. Journal of Quantitative Spectroscopy and Radiative Transfer. 235, 204–208 (2019) DOI: 10.1016/j.jqsrt.2019.06.034. Impact Factor - 2.955 Q1 (JCR 2018). Статья «Spectral approach to recognize spherical particles among non-spherical ones by angle-resolved light scattering». (E. S. Yastrebova, Ivan Dolgikh, K. V. Gilev, Irina Vakhrusheva, Elizaveta Liz, Alena L. Litvinenko, Vyacheslav Nekrasov, Dmitry I. Strokotov, Andrei A. Karpenko, Valeri P. Maltsev) направлена в журнал Optics and Lasers in Engineering [IF = 4.059 (JCR = 2018), Q1]. Фактически готова к отправке в журнал статья по результатам с условно здоровыми донорами: «On the way to detailed inspection of a gas exchange function of human organism on cell level: scanning flow cytometry measures 48 indices of erythrocytes».

Публикации

2. Ястребова Е.С., Конохова А.И., Строкотов Д.И., Карпенко А.А., Мальцев В.П., Чернышев А.В. Proposed Dynamics of CDB3 Activation in Human Erythrocytes by Nifedipine Studied with Scanning Flow Cytometry Cytometry Part A, Cytometry. 2019. P. cyto.a.23918. (год публикации - 2019) https://doi.org/10.1002/cyto.a.23918

3. - В формировании атеросклероза оказались задействованы эритроциты Наука в Сибири, - (год публикации - )

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Была разработана модель процесса везикуляризации эритроцитов в кровотоке. Получены зависимости морфологических параметров эритроцитов такие как, диаметр, толщины, объем, площадь поверхности и индекс сферичности от шага итерации в процессе везикуляризации, что коррелирует с временем жизни клеток. Это позволяет получить параметры распределения по популяции условного возраста эритроцитов, по которым, в свою очередь, можно судить о нарушениях в работе эритропоэза в организме. Осуществлен переход к новому способу обработки данных – интерполяции на регулярной базе данных, который позволил увеличить точность выдаваемых морфологических характеристик (до 0.25 мкм по размерным параметрам), что, в свою очередь, приведет к более детальной характеризации особенностей газотранспортной функции организма у пациентов с атеросклерозом брахиоцефальных артерий. За отчетный период количество исследованных пациентов с атеросклерозом брахиоцефальных артерий увеличилось более чем в два раза и составило 67 человек. Из них у 45 пациентов была выделена и гистологически типирована нестабильная атерома, а у 22 -стабильная атерома. База данных доноров так же расширялась и теперь составила 60 человек. По итогам проведенных исследований получены результаты по функциональным параметров эритроцитов, на имеющейся выборке доноров и пациентов. Было выявлено, что количество активно работающих анионных обменников в группе пациентов со стабильной (0.39±0.04)×106 и нестабильной атеромой (0.4±0.04)×106 на финальной базе данных пациентов в пределах точности совпадает. Однако, это значение оказалось выше, чем у условно здоровых доноров (0.33±0.02)×106. В свою очередь, предельная растяжимость мембраны, характеризующая степень устойчивости к изотоническому гемолизу оказалась выше у условно здоровых доноров (6.2±0.2)×10-2 , чем у пациентов с атеросклерозом брахиоцефальных артерий. Самая низкая устойчивости к гемолизу проявила себя в группе со стабильной атеромой и составила (4.6±0.3)×10-2. По числу активированных нифедипином анионных обменников различия между групп остаются без значительных отклонений и составляют для условно здоровых доноров (0.56±0.07)×106, для обладателей стабильных атером (0.52±0.08)×106, для группы нестабильных атеросклеротических бляшек (0.67±0.07)×106. Самое значительное отличие, которое удалось обнаружить между пациентами с различными типами атером, связано с параметром, характеризующим процент активных анионных обменников в нативном состоянии по сравнению с максимально возможным в процессе активации в растворе нифедипина. У пациентов со стабильной атеромой начальный уровень эффективно работающих обменников составляет (85±5)%, в то время как у пациентов с нестабильной атеромой (67±4)%. Группа условно здоровых доноров имеет по этому показателю (72±4)%. Из имеющихся на текущий момент данных, можно сделать вывод о том, что газотранспортная функция эритроцитов у пациентов со стабильной атеромой работает ближе к своему порогу насыщения, перекачивая количество анионов через мембрану в единицу времени приближенное к максимально возможному по сравнению с другими исследованными группами. Данный механизм способствует улучшению ситуации в зоне повышенной потребности в кислороде, за счет более активной работы анионного обмена эритроцитов, уменьшая риск возникновения локальной гипоксии и связанных с ней осложнений. В результате такого компенсаторного поведения эритроцитов, в участках с атеросклеротическими бляшками оказывается достаточное количества кислорода для поддержания клеток, вступивших в формирование атеромы, в жизнеспособной форме, препятствуя их некрозу с последующим разрыхлением атеромы. Удалось опубликовать статью Yastrebova E.S., Dolgikh I., Gilev K.V., Vakhrusheva I.V., Liza E., Litvinenko A.L., Nekrasova V.M., Strokotov D.I. Karpenko A.A., Maltsev V.P. «Spectral approach to recognize spherical particles among non-spherical ones by angle-resolved light scattering». Optics and Laser Technology 135 (2020). DOI:10.1016/j.optlastec.2020.106700. Impact Factor - 3.233 Q1 (JCR 2019). Результаты, опубликованные в этой статье, напрямую используются для определения частоты пролета сферизованных эритроцитов в процессе изотонического гемолиза при расчете функциональных параметров (быстрая скорость сферизации пропорциональна высокой скорости работы анионных обменников на мембране эритроцита). Была отправлена в журнал статья, основанная на обработке индикатрис светорассеяния одиночных клеток (сферизованных эритроцитов, тромбоцитов, полистирольных сфер), измеренных на СПЦ на двух длинах волн 660 и 443 нм. В работе показано достигнутое повышение точности для определения размера и показателя преломления клеток по сравнению с работой на одной длине волны. Более того, данных подход может помочь в выборе адекватной оптической модели для клеток, способных к агрегации (в нашем случае были исследованы тромбоциты). Статья «Dual-wavelength angle-resolved light scattering in analysis of particles by scanning flow cytometry» отправлена в журнал Journal of Optics. Вторая статья «Blood platelet quantification by light scattering: from morphology to activation», которая сейчас направлена в журнал Analytical Methods появилась в результате активного интереса со стороны клиники к тромбоцитам и возможность описания способности к активации в понятных количественных параметрах. Это работа является развитием текущего проекта с расширением списка исследуемых клеток и их роли в формировании нестабильных атером. Результаты выполненных работ представлены или будут представлены (тезисы приняты к публикации) на следующих конференциях: 1) CYTO 2021: The International Society for Advancement of Cytometry, конференция перенесена в онлайн формат, June 7 - 10, 2021. Тема доклада: «Anion exchange changes in red blood cells depending on the stability of the atherosclerotic plaque» (I. Semenova, E. Iastrebova, A. Konokhova, D. Strokotov, V. Maltsev). Стендовый доклад. 2) CYTO 2021: The International Society for Advancement of Cytometry, конференция перенесена в онлайн формат, June 7 - 10, 2021. Тема доклада: «Modeling the change in the shape of an erythrocyte during vesiculation» (A. Gisich, E. Iastrebova, A. Cherneshev, V. Maltsev). Стендовый доклад. 3) OpenBio 2020 - VII Международная конференция молодых ученых: вирусологов, биотехнологов, молекулярных биологов и биофизиков, Кольцово, 27-30 октября. Тема доклада: «Determination of the conditional age of erythrocytes by flow cytometry» (A. Gisich, Е. Yastrebova, D. Strokotov) Устный доклад. 4) ISTH 2021 - XXIX Congress of the International Society on Thrombosis and Haemostasis, July 17-21 2021 г, конференция перенесена в онлайн формат. Тема доклада: «Investigation of Red Blood Cells influence on atherosclerotic plaque by scanning flow cytometry» (E. Iastrebova, A. Konokhova). Стендовый доклад.

Публикации

1. Ястребова Е.С., Долгих И., Гилев К.В., Вахрушева И.В., Лиза Е., Литвиненко А.И., Некрасов В.М., Строкотов Д.И., Карпенко А.А,, Мальцев В.П. Spectral approach to recognize spherical particles among non-spherical ones by angle-resolved light scattering Optics & Laser Technology, - (год публикации - 2021) https://doi.org/10.1016/j.optlastec.2020.106700

Возможность практического использования результатов
Была усовершенствована технология сканирующей проточной цитометрии (СПЦ), что привело к возможности получения сигналов светорассеяния от одиночных клеток одновременно на двух длинах волн. Это позволяет выбирать наиболее адекватную оптическую модель клеток для из дальнейшего анализа. Разработанная молекулярно-кинетическая модель воздействия нифедипина на анионный обмен эритроцита позволяет определять индивидуальные дозы препарата для необходимой активации газотранспортной функции эритроцитов. К сожалению, для реализации данного подхода требуется провести исследование образцов крови на СПЦ, который разработан в нескольких вариациях в лаборатории цитометрии и биокинетики в ИХКГ СО РАН, что затрудняет его доступность в рутинных клинических анализах. Однако, это приближает персонализированный подход к медицине в рамках установления индивидуальных терапевтических доз. Обнаруженные различия в поведении газотранспортной функции эритроцитов у пациентов с различными типами атером, несут в себе предсказательную и диагностическую ценность, как один из факторов о риски дестабилизации атером в случаях с низкой активностью анионного обмена в клетках.