КАРТОЧКА ПРОЕКТА ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ПОИСКОВЫХ НАУЧНЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

Номер 18-74-10088

НазваниеКлинико-экспериментальное исследование на овцах эффективности миорелаксантного полипептида аземиопсина и его аналогов

РуководительКудрявцев Денис Сергеевич, Кандидат биологических наук

Организация финансирования, регион Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова Российской академии наук, г Москва

Период выполнения при поддержке РНФ 07.2018 - 06.2021 

Конкурс№30 - Конкурс 2018 года по мероприятию «Проведение исследований научными группами под руководством молодых ученых» Президентской программы исследовательских проектов, реализуемых ведущими учеными, в том числе молодыми учеными.

Область знания, основной код классификатора 04 - Биология и науки о жизни, 04-209 - Биотехнология (в том числе бионанотехнология)

Ключевые словамиорелаксанты, хирургия, мышечные дистонии

Код ГРНТИ34.15.63

СтатусУспешно завершен

 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ

Аннотация
Аземиопсин - линейный пептид из яда гадюки Azemiops feae является высокоаффинным и селективным ингибитором никотинового ацетилхолинового рецептора (нАхР) мышечного типа и может рассматриваться как потенциально применимый неполяризующий миорелаксант. Данный пептид не содержит дисульфидных связей, что облегчает его синтез и модификации в сравнении с другими нейротоксинами змей. В рамках Государственного контракта № 14.N08.12.1025 от 28 апреля 2015 «Доклинические исследования лекарственного средства для лечения мышечных дистоний на основе полипептида, блокирующего нервно-мышечную передачу» было проведено изучение доклинического профиля аземиопсина в отношении in vitro и in vivo эффективности, острой и хронической токсичности, фармакокинетики, аллергенной способности, иммунотоксичности и мутагенной активности. Пептид показал высокую эффективность релаксации мышц при внутримышечной инъекции мышам. Пептид не обладал иммунотоксическими, аллергенными или мутагенными свойствами. В целом, результаты показывают, что аземиопсин обладает хорошими лекарственными свойствами для применения в качестве местного миорелаксанта и по своим параметрам не уступает релаксантам, которые в настоящее время используются. Однако испытания на грызунах дают не вполне достаточную информацию о распределении молекул аземиопсина в мышечной ткани, а также о применимости данного миорелаксанта в различных хирургических операциях, требующих различных длительностей действия и скоростей выведения препарата. Всегда остается возможность того, что в реальной хирургической операции могут проявиться свойства, которые не были предсказаны по результатам доклинических испытаний. В рамках предлагаемого проекта планируется выполнить поисковое исследование, включающее синтез нескольких (не менее двух) производных аземиопсина с целью улучшения его фармакокинетических и фармакодинамических свойств, характеристику их взаимодействия с мышечными нАхР млекопитающих in vitro, а также изучение миорелаксантной эффективности аземиопсина и его новых аналогов при хирургических операциях на отдельных представителях жвачных и/или нежвачных парнокопытных. Преимуществом работы с относительно крупными животными является их большее родство с человеком, возможность более тщательно, нежели в случае грызунов, оценить распределение и биодеградацию исследуемых молекул. Выполнение подобного проекта возможно только в рамках комбинированного исследования, включающего взаимодействие коллективов, владеющих биохимическими и ветеринарными подходами и способных вместе провести полный цикл работ от рационального конструирования новых производных аземиопсина, их синтеза и тестирования in vitro до выполнения испытаний на крупных животных с мониторингом различных биологических и биохимических показателей. В предлагаемом проекте будет проведено исследование миорелаксанта пептидной природы. Это – принципиально новый тип препарата, поскольку применяемые в настоящее время в хирургии миорелаксанты являются низкомолекулярными соединениями. Они представляют собой ксенобиотики и обладают вследствие низкой специфичности целым рядом побочных эффектов. Эта же проблема существуют при использовании периферических миорелаксантов для лечения дистоний. Применяемый для лечения дистоний ботулотоксин не лишен существенных недостатков, включая высокую токсичность и вызываемую им дистрофию мускулатуры. Создание нового препарата на основе соединения пептидной природы позволит преодолеть недостатки существующих миорелаксантов. Предлагаемый проект позволит установить эффективность и способы применения аземиопсина при оперативных вмешательствах и в качестве местного миорелаксанта.

Ожидаемые результаты
При выполнении данного проекта предполагается получить следующие результаты 1) Будут определены миорелаксантные свойства аземиопсина при проведении хирургических операций на крупных животных (овцах) и при местном применении: будут установлены действующие концентрации и влияние на биологические и биохимические параметры животных. 2) Будет проведено рациональное конструирование и синтезировано несколько (не менее двух) новых аналогов аземиопсина, для которых будут определены параметры взаимодействия с различными подтипами никотиновых холинорецепторов и установлены миорелаксантные свойства. 3) С использованием первичных культур клеток будет проведено исследование фармакологического профиля никотиновых холинорецепторов мышечного типа овцы, для которых в настоящее время отсутствуют данные о свойствах рецепторов этого типа. 4) Будет проведено исследование взаимодействия аземиопсина и сконструированных новых аналогов с никотиновыми холинорецепторами мышечного типа овцы и человека. Выполнение поисковых исследований в рамках предлагаемого проекта позволит заложить научную основу для последующего создания миорелаксантных препаратов нового типа. В частности на основе аземиопсина и аго аналогов может быть создана линейка миорелаксантных препаратов с различными периодами выведения и разной степенью локального эффекта для применения в хирургии и терапии социально-значимых заболеваний – мышечных дистоний. Следует отметить, что все используемые в настоящее время при проведении хирургических вмешательств препараты являются низкомолекулярными органическими соединениями, что обуславливает их низкую селективность и другие побочные эффекты. К тому же они являются ксенобиотиками. Аземиопсин, являющийся полипетидом, деградирует в организме до аминокислот, которые не являются чуждыми соединениями. В настоящее время в мире отсутствуют пептидные миорелаксанты, таким образом, поученные в данном проекте результаты будут пионерскими. Исполнители проекта (сотрудники ИБХ РАН) принимали участие в доклинических испытаниях аземиопсина в рамках госконтракта. Результаты, полученные при выполнении доклинических испытаний, опубликованы в международном журнале Toxins. Мы предполагаем, что пептидные миорелаксанты, лишенные недостатков используемых в настоящее время препаратов, найдут применение в медицине и ветеринарии. Их применение позволит существенно улучшить качество жизни больных страдающих дистониями и снизить нежелательные последствия применения миорелаксантов при оперативных вмешательствах.

 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ

Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Глобальной задачей проекта является исследование применимости в хирургии миорелаксантов нового поколения - пептидов на основе альфа-нейротоксинов из яда змей. В текущем трехлетнем цикле работ было предложено исследовать свойства аземиопсина - миорелаксантного пептида из яда бирманской гадюки Azemiops feae. Для выяснения свойств аземиопсина в условиях хирургической операции нами предложено исследование на относительно крупном млекопитающем - Ovis aries (овца), что является лучшим приближением к хирургической операции на человеке, чем работа с более мелкими лабораторными животными и позволит комплексно исследовать воздействие змеиного токсина-миорелаксанта на организм млекопитающего в условиях анестезии. В период с июля 2018 г. по май 2019 г. нашим коллективом был выполнен комплекс работ, создающих рациональную научную основу для дальнейшего исследования физиологических эффектов аземиопсина: 1) сконструированы и синтезированы два производных аземиопсина, предположительно обладающих измененными фармакокинетическими и фармакодинамическими свойствами; 2) полученные аналоги аземиопсина протестированы в моделях in vitro, подтверждено их действие на мышечные никотиновые рецепторы; 3) произведен отбор биопсии мышечной ткани Ovis aries, из части образцов мышечной ткани были изготовлены гистологические срезы; из другой части образцов выделена суммарная РНК, проведено молекулярное клонирование субъединиц мышечного никотинового рецептора; из еще одной части была выделена первичная культура миосателлитных клеток (клеток-предшественниц мышечных волокон), с помощью флуоресцентной микроскопии показана экспрессия мышечного нАхР в данной культуре. Таким образом, в настоящий момент коллектив располагает всем необходимым для начала выполнения следующего этапа проекта.

 

Публикации

Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Исследована биологическая активность синтетического аземиопсина на овцах в условиях хирургической операции. Показана высокая миорелаксантная активность при внутривенном введении в дозах от 0,15 мг/кг. Проведен забор проб тканей, общий анализ крови и биохимические показатели крови в течение пяти суток после введения препарата. Отработаны методики масс-спектрометрической детекции нейротоксинов из ядов змей в обрзцах плазмы крови, а также различные способы детекции комплексообразования указанных нейротоксинов с их природными и неприродными мишенями с помощью нативной масс-спектрометрии. Показана применимость комплексного подхода с применением молекулярного моделирования, масс-спектрометрии и гель-фильтрации для исследования активности нейротоксинов в отношении различного типа рецепторов. Была проверена гипотеза о возможности создания пептидного миорелаксанта на основе "редуцированной" структуры аземиопсина. Выяснено, что катионный олигопептид, имитирующий структуру N-онца аземиопсина взаимодействует с мышечным никотиновым рецептором in vitro, но не оказывает миорелаксантного действия in vivo. Исследована функциональная активность липидных производных эндогенного лиганда мышечного никотинового рецептора. Полученные данные будут использованы для рационального конструирования принципиально новых аналогов аземиопсина с улучшенными свойствами. Получены новые синтетические флуоресцентные производные аземиопсина, которые могут служить инструментом исследования никотиновых рецепторов, а также имеющие перспективы внедрения в клиническую практику для диагностики редких аутоиммунных и генетических заболеваний из группы миастений.

 

Публикации

1. Акимов М.Г., Кудрявцев Д.С., Крюкова Е.В., Фомина-Агеева Е.В., Захаров С.С., Серебрякова О.Г., Лущекина С.В., Паликов В.А., Паликова Ю.А., Дьяченко, А.И. Кашеверов И.Е., Цетлин В.И., Безуглов В.В. Arachidonoylcholine and Other Unsaturated Long-Chain Acylcholines Are Endogenous Modulators of the Acetylcholine Signaling System Biomolecules, 10 (2) (год публикации - 2020) https://doi.org/10.3390/biom10020283

2. Кудрявцев Д.С., Табакмахер В.М., Будылин Г.С., Егорова Н.С., Ефремов Р.Г., Иванов И.А., Белухина С.Ю., Егоров А.В., Кашеверов И.Е., Крюкова Е.В., Шелухина И.В., Ширшин Е.А., Жданова Н.Г., Жмак М.Н., Цетлин В.И Complex approach for analysis of snake venom α-neurotoxins binding to HAP, the high-affinity peptide Scientific reports, 10, 3861 (2020) (год публикации - 2020) https://doi.org/10.3390/biom10020283

3. Лебедев Д.С. Крюкова Е.В. Иванов И.А. Егорова Н.С. Тимофеев Н.Д .; Спирова Е.Н. Туфанова Е.Ю .; Синявин А.Е. Кудрявцев Д.С. Кашеверов И.Е .; Зоуридакис, М; Кацарава, Р; Заврадашвили, N; Ягоршвили, я; Цартос, C; Цетлин В.И. Oligoarginine Peptides, a New Family of Nicotinic Acetylcholine Receptor Inhibitors MOLECULAR PHARMACOLOGY, Volume: 96 Issue: 5 Pages: 664-673 (год публикации - 2019) https://doi.org/10.1124/mol.119.117713

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Третий год выполнения проекта был посвящен публикации ранее полученных в ходе выполнения проекта дополнительных данных о структурно-функциональных особенностях мышечного никотинового ацетилхолинового рецептора (нАхР), исследованных с помощью методов молекулярного моделирования, флуоресцентной микроскопии, флуоресцентной детекции кальция и электрофизиологии (локальной фиксации потенциала). При этом при подготовке публикаций были применены молекулярные модели, флуоресцентные токсины, методики обработки данных, полученные на предыдущих этапах проекта. Исследованы некоторые аспекты молкулярного механизма миастении медленных каналов, вызываемой мутацией G153S в субъединице альфа1 мышечного нАхР. В дополнение к ранее полученным данным по изменениям в клеточном составе крови овец под воздействием аземиопсина, проведены измерения in vitro жизнеспособности различных клеточных линий под воздействием змеиных нейротоксинов и низкомолекулярных лигандов нАхР.

 

Публикации

1. Кудрявцев Д.С., Исаева А.С., Баркова Д.В., Спирова Е.Н., Мухутдинова Р.Р., Кашеверов И.Е. и Цетлин В.И. Point Mutations of Nicotinic Receptor α1 Subunit Reveal New Molecular Features of G153S Slow-Channel Myasthenia Molecules, 2021, 26(5), 1278 (год публикации - 2021) https://doi.org/10.3390/molecules26051278

2. Гондаренко Е.А., Антипова Н.В., Павлюков М.С., Шахпаронов М.И., Цетлин В.И., Кудрявцев Д.С. Исследование функциональной активности никотиновых ацетилхолиновых рецепторов на первичной клеточной линии глиобластомы XXXIII Зимняя международная молодёжная научная школа "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии", ИБХ РАН, Москва, 2021 г., стр. 92 (год публикации - 2021)

3. Гондаренко Е.А., Кудрявцев Д.С., Антипова Н.В. Исследование функциональной активности никотиновых ацетилхолиновых рецепторов на первичной клеточной линии глиобластомы Материалы Международного молодежного научного форума «ЛОМОНОСОВ-2021», [Электронный ресурс] – М.: МАКС Пресс, 2021 (год публикации - 2021)

4. Исаева А.С., Кудрявцев Д.С., Баркова Д.В., Спирова Е.Н., Кашеверов И.Е., Цетлин В.И. Исследование особенностей никотиновых ацетилхолиновых рецепторов методами сайт-направленного мутагенеза и флуоресцентной детекции кальция XXXIII Зимняя международная молодёжная научная школа "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии", ИБХ РАН, Москва, стр. 95 (год публикации - 2021)

5. Скрипка М.И., Кудрявцев Д.С. Низкомолекулярные и пептидные синтетические лиганды никотиновых рецепторов Материалы Международного молодежного научного форума «ЛОМОНОСОВ-2021», [Электронный ресурс] – М.: МАКС Пресс, 2021 (год публикации - 2021)

6. Скрипка М.И., Сон Л.В., Кудрявцев Д.С., Кашеверов И.Е., Цетлин В.И. Исследование синтетических лигандов никотиновых ацетилхолиновых рецепторов методом флуоресцентной детекции ионов кальция XXXIII Зимняя международная молодёжная научная школа "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии", ИБХ РАН, Москва, стр. 167 (год публикации - 2021)

Возможность практического использования результатов
Результаты работ подтверждают гипотезу о высокой эффективности аземиопсина в качестве системного миорелаксанта, не вызывающего гиперкалиемии. Исследования аналогов аземиопсина и его производных говорят о возможности управления длительностью времени жизни такого активного вещества с помощью введения значительных аминокислотных замен, укорочения полипептидной цепи и включения ковалентных модификаций на основе жирных кислот.