Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Мезенхимные стволовые клетки (МСК) из жировой ткани человека были выделены с помощью ферментативной обработки 0,2% раствором коллагеназы. Выделенные МСК имели фибробласто-подобную морфологию и экспрессировали CD-маркеры, специфичные для мезенхимной стволовой клетки: CD29, CD44, CD90, CD73 и CD166. В тоже время выделенные клетки не экспрессировали антигены гемопоэтических клеток (CD34, CD11b, CD19, CD45 и HLA-DR) и обладали способностью к направленной дифференцировке в адипо-, остео- и хондрогенном направлениях. Путем субклонирования целевых генов цитокинов из вектора-донора в лентивирусный плазмидный вектор были получены рекомбинантные плазмидные конструкции, необходимые для сборки лентивирусных частиц: pLX303-IFNA17 (интерферон альфа 17), pLX303-TRAIL (родственный фактору некроза опухоли апоптоз-индуцирующий лиганд), pLX303-IL2 (интерлейкин 2), pLX303-GM-CSF (гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор) и pLX303-PTEN (фосфатаза и гомолог тензина). Правильность сборки генетических конструкций подтверждали рестрикционным анализом и секвенированием. С использованием полученных плазмидных конструкций были получены рекомбинантные лентивирусы LV-IFNA17, LV-TRAIL, LV-IL2, LV-PTEN и LV-GM-CSF и проведена вирусная трансдукция МСК с последующей селекцией генетически модифицированных клеток путем культивирования в присутствии антибиотика бластицидина S. Таким образом, получены следующие стабильные клеточные линии: МСК-IFNA17, МСК-TRAIL, МСК-IL2, МСК-GM-CSF и МСК-PTEN. Также получена линия генетически модифицированных МСК, экспрессирующая репортерный ген дальне-красного флуоресцентного белка Katushka2S. Для получения стабильной культуры МСК-Katushka2S клетки сортировали по флуоресценции репортерного белка Katushka2S. Экспрессия IFNA17, TRAIL, IL2, PTEN и GM-CSF в генетически модифицированных МСК была проанализирована с помощью ПЦР-РВ и иммунофлуоресцентного окрашивания с использованием специфичных антител. Результаты ПЦР-РВ и иммунофлуоресцентного окрашивания показали значительное увеличение экспрессии IFNA17, TRAIL, IL2, PTEN и GM-CSF в генетически модифицированных МСК. Проведена оптимизация технологии получения искусственных микровезикул (иМВ) из МСК человека путем их обработки цитохалазином B. Были оптимизированы условия (время и скорость) центрифугирования и условия обработки клеток (концентрация вещества и время инкубации) цитохалазином B. Далее из нативных и генетически модифицированных МСК были выделены иМВ и экспрессия мРНК генов IFNA17, TRAIL, IL2, PTEN и GM-CSF в иМВ, выделенных из генетически модифицированных клеток была подтверждена методом ПЦР-РВ. Секреция рекомбинантных белков IFNA17, TRAIL, IL2, PTEN и GM-CSF в иМВ, выделенных из генетически модифицированных клеток, подтверждена вестерн блот анализом. Для определения размера и морфологии иМВ, выделенных из нативных и генетически модифицированных МСК, использовали цитофлуориметрический анализ и просвечивающую электронную микроскопию. Показано, что размер выделенных иМВ составил от 50 до 1000 нм, при этом размер иМВ, выделенных из нативных и генетически модифицированных МСК не отличался. Размер выделенных иМВ соответствует размеру экзосом и микровезикул, отделяющихся от клетки естественным путем. Далее была исследована экспрессия маркеров стволовой мезенхимной клетки на поверхности выделенных иМВ с помощью цитофлуориметрического анализа. Показано, что на поверхности выделенных иМВ из нативных и генетически модифицированных МСК экспрессия CD-макеров была ниже, по сравнению с экспрессией на поверхности родительских клеток. Анализ наличия ядерного и митохондриального компонентов показал присутствие митохондрий, окрашенных MitoTracker Green FM в 23,78 % иМВ, выделенных из МСК. Ядерный компонент окрашивали витальным флуоресцентным красителем Hoechst 33342, флуоресценция которого обнаруживалась в 7,5% выделенных из МСК иМВ. Число иМВ, содержащих как ядерный, так и митохондриальный компоненты, составило 4,37%. С помощью мультиплексного анализа с использованием набора MILLIPLEX MAP Human Cytokine/Chemokine Panel 41 (Millipore, США) проведен сравнительный анализ молекулярного состава иМВ, выделенных из наивных и генетически модифицированных МСК. Показано, что секреция 38 аналитов оставалась без изменений в образцах нативных и генетически модифицированных МСК и выделенных из них иМВ. Отмечена значительная модуляция секреции следующих аналитов: основной фактор роста фибробластов (FGF-2), IL6 и IL7. Для оценки стабильности иМВ, выделенных из МСК, при различных условиях хранения (в физиологическом растворе при 25 °С; в физиологическом растворе при 4 °С; в физиологическом растворе подвергали замораживанию при -20 °С; подвергали лиофильному высушиванию и хранению при -20 °С) мы исследовали морфологию (с помощью просвечивающей электронной микроскопии) и сохранение способности к доставке своего содержимого в клетки-мишени. Показано, что после 14 суток хранения при 4°C в образцах иМВ сохраняются сферические структуры, диаметром от 70 до 1000 нм. После одного цикла замораживания/размораживания в образцах иМВ обнаруживаются также сферические структуры аналогичного диаметра. Однако при лиофильном высушивании/регидратации было обнаружено образование агрегатов, состоящих из множества иМВ. Для оценки целостности и сохранения способности к доставке своего содержимого иМВ, выделенные из нативных МСК и окрашенные красителем CFDA, которые хранились в различных условиях, через определенный промежуток времени наносили на клетки-реципиенты (SH-SY5Y, линия опухолевых клеток нейробластномы человека) и спустя 24 часа инкубации определяли процент клеток-реципиентов, обладающих зеленой флуоресценцией (CFDA+ -клетки), методом проточной цитофлуориметрии. Установлено, что хранение в физиологическом растворе при 4 °С, а также замораживание и хранение при -20°С обеспечило наилучшую сохранность целостности и способности к доставке своего содержимого препаратов иМВ. Поэтому данные условия могут быть рекомендованы для хранения препаратов иМВ до момента использования. Поскольку на следующем этапе работы планируется исследование иммуномодулирующей и противоопухолевой активности иМВ, выделенных из нативных и генетически модифицированных МСК, в совместных культурах опухолевых и иммунных клеток, а также их слияния с клетками-мишенями, было проведено исследование для оптимизации условий совместного культивирования нескольких клеточных типов и их разделения по популяциям после совместного культивирования. Для анализа поведения клеток аденокарциномы, мононуклеарных клеток периферической крови и МСК в ко-культуре проводили витальное флуоресцентное окрашивание клеток различными по спектру флуоресценции красителями, что позволило не только проследить самоорганизацию отдельных клеточных популяций в модели опухолевого микроокружения, но также отделить индивидуальные клеточные типы с помощью сортировки. После 72 часов ко-культивирования цитофлуориметрический анализ показал высокую степень взаимодействия клеток путем обмена мембранными компонентами, что выражалось в смешении спектров флуоресценции. Информация о публикациях в СМИ, посвященных результатам проекта: https://www.gazeta.ru/science/news/2018/12/25/n_12458935.shtml?updated, https://indicator.ru/news/2018/12/25/gmo-stvolovye-kletki-i-immunitet/. Таким образом, были выполнены все запланированные работы и выполнены все заявленные научные результаты на конец отчетного периода.

Аннотация результатов, полученных в 2019 году
В настоящей работе проведено исследование противоопухолевой и иммуномодулирующей активности искусственных микровезикул (иМВ), полученных из нативных и генетически модифицированных мезенхимных стволовых клеток (МСК) со сверхэкспрессией цитокинов и белков-онкосупрессоров IFNA17, TRAIL, IL2, GM-CSF и PTEN, в культуре опухолевых и иммунных клеток in vitro. Искусственные микровезикулы из нативных и генетически модифицированных МСК получали по оптимизированному ранее протоколу с помощью обработки клеток цитохалазином В, веществом, вызывающим реорганизацию цитоскелета. Для анализа противоопухолевой активности иМВ МСК наносили на опухолевые клетки (клетки нейробластомы SH-SY5Y, карциномы почки A498, аденокарциномы легкого A549, карциномы толстой кишки HCT-116, меланомы M-14 и трижды негативного рака молочной железы MDA-MB-231) в концентрации 50 мкг/мл. Через 72 часа после добавления везикул оценивали жизнеспособность и пролиферативную активность опухолевых клеток. Жизнеспособность опухолевых клеток определяли с использованием набора APC Annexin V Apoptosis Detection Kit with PI (Biolegend, США). Результаты анализировали с помощью проточной цитофлуориметрии. Для анализа пролиферативной активности, опухолевые клетки предварительно окрашивали красителем CFDA (eBioscience, США). Затем клетки инкубировались с иМВ МСК в течение в течение 72 часов, после чего флуоресценцию CFDA оценивали с помощью проточной цитофлуориметрии. Для анализа экспрессии сигнальных молекул (p53, TGF-β, MMP2, MMP9, Bcl2, CAS3 и BAX) опухолевыми клетками после инкубации с иМВ МСК в течение 24 и 72 часов, опухолевые клетки снимали с культурального планшета, после чего выделяли общую РНК, проводили реакцию обратной транскрипции и полимеразную цепную реакцию в режиме реального времени (ПЦР-РВ) по технологии TaqMan. Нормализацию уровня экспрессии целевых генов проводили по уровню экспрессии 18S rRNA. Определение относительного уровня экспрессии исследуемых генов осуществляли с применением delta/deltaCT-метода. Мультиплексный анализ секреции цитокинов/хемокинов и факторов роста опухолевыми клетками после 24 инкубации с иМВ нативных или генетически модифицированных МСК проводили с использованием набора Human Chemokine 40-plex Panel (BioRad, США) на приборе Luminex 200 System (BioRad, США). Для анализа взаимодействия МСК с иМВ клеток SH-SY5Y проводили окрашивание клеточных мембран МСК и иМВ-SH-SY5Y с помощью флуоресцентных витальных красителей, входящих в состав набора Vybrant Cell Labeling Solutions kit (Thermo Fisher Scientific, США). Размер иМВ-SH-SY5Y анализировали с помощью проточной цитофлуориметрии с использованием SPHERO Nano Fluorescent Particle Size Standart Kit (Spherotech, США). Проточную цитометрию с визуализацией изображения выполняли с использованием 5-лазерного Imagestream X Mark II (Amnis-EMD-Millipore, США). Для исследования взаимодействия иМВ МСК и сфероидов, полученных из клеток SH-SY5Y, иМВ МСК и клетки SH-SY5Y окрашивали флуоресцентными витальными красителями. Опухолевые сфероиды получали методом «висячая капля». После формирования опухолевых сфероидов к ним добавляли 10 мкг иМВ МСК и культивировали в течение 24 часов. Далее проводили фиксацию сфероидов формалином. Результаты анализировали при помощи конфокальной микроскопии. Для анализа влияния иМВ клеток SH-SY5Y на иммунофенотип МСК, клетки окрашивали антителами к CD29, CD44, CD73, CD90 и CD105. Результаты анализировали с помощью проточной цитофлуориметрии. Миграционная активность иммунных клеток (мононуклеарных клеток периферической крови, МКПК) после взаимодействия с иМВ МСК, оценивали с использованием системы CIM-plate 16 на приборе RTCA xCelligence (ACEA Biosciences) в течение 35 часов. Для того чтобы проанализировать иммуномодулирующую активность иМВ МСК (20 мкг/мл) добавляли к МКПК и совместно культивировали в течение 72 часов. Активацию популяций МКПК определяли с помощью проточной цитофлуориметрии с помощью окрашивания антителами, специфичными к поверхностным маркерам (HLA-DR, CD25, CD8a, CD3, CD4, CD38, CD127 (IL-7Rα), CD183 (CXCR3), CD196 (CCR6), CD107a (LAMP-1) и CD56), характерным для различных популяций иммунных клеток человека. Анализ результатов проводили с помощью проточной цитофлуориметрии. Также проводили мультиплексный анализ секреции цитокинов/хемокинов и факторов роста иммунными клетками (МКПК) после взаимодействия с иМВ МСК после 72 часов совместной инкубации. Для того, чтобы проанализировать противоопухолевую активность МКПК после взаимодействия с иМВ МСК, МКПК совместно культивировались с иМВ (20 мкг/мл) в течение 72 часов. Затем МКМП переносили на предварительно рассеянные опухолевые клетки на планшеты для xCelligence и обычные культуральные планшеты в соотношении 1:3 (опухолевые клетки:МКПК). Пролиферативная активность опухолевых клеток оценивалась с помощью прибора RTCA xCelligence (ACEA Biosciences, США) в течение 72 часов. Жизнеспособность опухолевых клеток оценивалась через 24 часа после культивирования с МКПК с использованием набора APC Annexin V Apoptosis Detection Kit with PI (Кат. №640932, Biolegend, США) с помощью на проточной цитофлуориметрии. Анализ полученных данных проводили при помощи программного обеспечения GraphPad Prism 7 (GraphPad Software) с использованием критерия Шапиро-Уилка и однофакторным дисперсионным анализом (ANOVA) с последующим post hoc тестом Тьюки. В результате выполнения работы проанализирована жизнеспособность опухолевых клеток до и после взаимодействия с иМВ, полученных из нативных и генетически модифицированных МСК со сверхэкспрессией IFNA17, TRAIL, IL2, GM-CSF и PTEN, определен уровень экспрессии мРНК генов p53, TGF-β, MMP2, MMP9, Bcl2, CAS3 и BAX опухолевых клеток и проведен мультиплексный анализ уровня секреции цитокинов/хемокинов и факторов роста опухолевыми клетками после взаимодействия с иМВ нативных и генетически модифицированных МСК. Показано снижение жизнеспособности клеток SH-SY5Y и М-14 через 72 инкубации с иМВ-TRAIL, иМВ-PTEN и иМВ-IFNA17. При этом иМВ не оказывали воздействия на пролиферативную активность клеток SH-SY5Y. При инкубации с иМВ-IFNA17 снижалась так же и пролиферативная активность клеток M-14. Также показано снижение жизнеспособности клеток A498 и A549 через 72 инкубации с иМВ-TRAIL, иМВ-IL2 и иМВ-IFNA17. При инкубации клеток A498 и A549 с иМВ-IFNA17 снижалась так же и пролиферативная активность. Жизнеспособность клеток HCT-116 снижалась через 72 инкубации с иМВ-TRAIL и иМВ-IFNA17. При инкубации с иМВ-IFNA17 снижалась так же и пролиферативная активность. С помощью ПЦР-РВ проанализирована экспрессия сигнальных молекул опухолевыми клетками после 24 и 72 часов инкубации с иМВ нативных или генетически модифицированных МСК. Показаны статистически значимые изменения экспрессии мРНК генов CAS3, Bcl2 и BAX в опухолевых клетках после инкубации с иМВ-TRAIL и иМВ-PTEN. Проведен мультиплексный анализ уровня секреции цитокинов/хемокинов и факторов роста опухолевыми клетками после взаимодействия с иМВ нативных и генетически модифицированных МСК. На примере клеток MDA-MB-231 показано, что уровень секреции IL6 был снижен в данных клетках, которые инкубировались с иМВ-TRAIL. Уровень секреции IL8 был снижен в образце MDA-MB-231, инкубировавшихся с иМВ-PTEN. Секреция MCP-1 была снижена в MDA-MB-231 после инкубации с иМВ-TRAIL и иМВ-PTEN. Не было отмечено изменений в секреции хемоаттрактантов Gro-a/CXCL1 и CX3CL1, уровень которых обычно повышен в клетках MDA-MB-231. Проведен анализ взаимодействия иМВ стволовых и опухолевых клеток с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии и проточной цитометрии с функцией визуализации. Показано, что иМВ опухолевых клеток способны сливаться с МСК и снижать экспрессию CD-маркеров (CD29, CD44, CD73, CD90 и CD105). Искусственные микровезикулы МСК также способны к слиянию с клетками опухолевых сфероидов. Нами также проанализирована миграционная активность и активация иммунных клеток (МКПК) после взаимодействия с иМВ, полученными из нативных и генетически модифицированных МСК. Не было обнаружено миграционной активности как у нативных МКПК так и у МКПК, которые культивировались с нативными и генетически модифицированными иМВ. Показано, что число активированных Т-киллеров значительно увеличивалось после инкубации с иМВ-IL2. Также отмечено небольшое увеличение числа активированных Т-киллеров в образцах иМВ-PTEN. Не было обнаружено изменений после культивирования с иМВ-TRAIL и иМВ-GM-CSF. Число натуральных киллеров (НК клеток) было снижено (на 20-30%) во всех образцах МКПК, которые инкубировались с иМВ по сравнению с нативными МКПК. Не было обнаружено изменений в числе регуляторных Т-клеток в образцах, которые инкубировались с иМВ по сравнению с нативными МКПК. Число Т хэлперов первого типа снижалось в образце МКПК, которые инкубировались с иМВ-IL2, при этом увеличивалось число Т хэлперов второго типа. Число Т хэлперов 1-го и 2-го типа в других образцах МКПК не изменилось. Число Т хэлперов 17 также осталось неизменным. Мультиплексный анализ показал, что секреция IL2 была повышена в образцах МКПК, которые инкубировались с иМВ-IL2 и иМВ-IFNA17. В образце МКПК после инкубации с иМВ-IL2 также была увеличена секреция IL4. Cекреция IL10 в образце МКПК после инкубации с иМВ-IL2 была повышена. Изменения в уровне секреции макрофагальных белков воспаления MIP-1b/CCL15 и MIP-3a/CCL20 не наблюдалось. Экспрессия хемо-аттрактантов CX3CL1 и CXCL6 также не изменялась. На примере клеток линии MDA-MB-231 показано, что после добавления МКПК, инкубировавшимися с иМВ, выделенными из нативных и генетически модифицированных МСК, снижается пролиферация клеток MDA-MB-231, которые культивировались с МКПК, активированных иМВ-IL2. Через 24 часа после добавления МКПК после IL2 пролиферация MDA-MB-231 снизилась в 4 раза. Число здоровых клеток в образце MDA-MB-231 после 24 часов культивирования с МКПК после иМВ-IL2 было снижено на 35%. Снижение жизнеспособности опухолевых клеток опосредовано цитотоксической функцией CD8+ Т-клеток, активированных IL2. IL2, доставляемый с помощью везикул, стимулирует пролиферацию и активацию CD8+ Т-клеток, которые в свою очередь убивают опухолевые клетки путем экзоцитоза перфорин/гранзим-содержащих гранул, и Fas-лиганд (FasL) (CD95)-опосредованного апоптоза. Таким образом, проведено исследование противоопухолевой активности иМВ, полученных из нативных и генетически модифицированных МСК, в культуре опухолевых клеток in vitro, а именно получены данные по жизнеспособности, пролиферативной и метаболической активности опухолевых клеток до и после взаимодействия с иМВ, выделенных из нативных и генетически модифицированных МСК со сверхэкспресией IFNA17, TRAIL, IL2, GM-CSF и PTEN. Проведен анализ изменения уровня сигнальных молекул p53, TGF-β, MMP2, MMP9, Bcl2, CAS3 и BAX, а также уровня секреции цитокинов/хемокинов и факторов роста опухолевыми клетками до и после взаимодействия с иМВ, выделенных из нативных и генетически модифицированных МСК. Проведен анализ взаимодействия иМВ МСК с опухолевыми клетками и иМВ опухолевых клеток с МСК с использованием конфокальной лазерной сканирующей микроскопии и проточной цитометрии с функцией визуализации. Проанализирована миграционная активность иммунных клеток после взаимодействия с иМВ, полученными из нативных и генетически модифицированных МСК со сверхэкспрессией IFNA17, TRAIL, IL2, GM-CSF и PTEN. Исследована активации иммунных клеток после культивирования в присутствие иМВ, полученными из нативных и генетически модифицированных МСК со сверхэкспрессией IFNA17, TRAIL, IL2, GM-CSF и PTEN, и противоопухолевая активность активированных иммунных клеток в культуре опухолевых клеток in vitro. Таким образом, были выполнены все запланированные работы и выполнены все заявленные научные результаты на конец отчетного периода.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Проведено исследование биораспределения иМВ МСК на ксенографтной модели нейробластомы человека. Для этого была получена линия генетически модифицированных клеток нейробластомы SH-SY5Y со сверхэкспрессией ffLuc. Далее была получена ксенографтная модель нейробластомы человека путем подкожного введения клеток SH-SY5Y-ffLuc в составе Матригеля. Через три недели после введения клеток SH-SY5Y-ffLuc, было показано, что введённые клетки сформировали образования, которые легко визуализировались как в области бедра, так и в области под правой ключицей. При этом в области левой ключицы, где была введена смесь среды и Матригеля, биолюминесценции обнаружено не было. Также с помощью ПЦР-РВ проанализирована экспрессия мРНК гена Katushka2S в различных органах подопытных животных. Было показано, что уровень экспрессии гена Katushka2S была увеличена в 1,2, 1,3, 1,2 (p < 0.0001, n = 3) раза в тканях печени, легких и селезенки животных, получивших инъекцию иМВ-Katushka2S по сравнению с животными, которым иМВ-Katushka2S не вводились. При этом, в тканях головного мозга, почек и сформировавшейся опухоли увеличения экспрессии гена Katushka2S обнаружено не было. Таким образом, показано, что иМВ не обладают тропизмом к опухолевой ткани в сравнении с родительскими клетками. Проведено исследование иммуномодулирующих свойств иМВ, выделенных из нативных и генетически модифицированных МСК, экспрессирующих цитокины IL2, GM-CSF и IFNA17. Для анализа иммуномодулирующего действия иМВ-IL2 in vivo иммунокомпетентным мышам BALB/c внутривенно вводили 50 мкг иМВ. Через 72 часа периферическую кровь собирали и мононуклеарные клетки периферической крови (МКПК) мыши выделяли и окрашивали антителами, типичными для популяций иммунных клеток мыши. Мы не обнаружили, что введение иМВ-IL2, иМВ-GM-CSF или иМВ-IFNA17 влияет на количество CD45+CD3+CD4-CD8+ Т-клеток или популяцию CD45+CD3+CD4+CD8- Т-клеток мышиных МКПК. Мы отметили тенденцию к уменьшению количества как CD4+ T-клеток, так и CD8+ T-клеток после введения иМВ, а также тенденцию к увеличению количества CD4+ T-клеток после инъекции иМВ-IL2, иМВ-GM-CSF или иМВ-IFNA17 и CD8+ T-клеток после инъекции иМВ-IL2 в образец мышиных МКПК. Однако статистически значимой разницы обнаружено не было. Вероятно, это может быть связано с тем фактом, что человеческие белки имеют более низкую афинность к мышиным рецепторам в сравнении с человеческими белкам. Чтобы лучше оценить влияние введенных иМВ на иммунный ответ мышей, мы также оценили уровни цитокинов/хемокинов в сыворотке мышей через 72 часа после введения иМВ. Секреция провоспалительных цитокинов IL3, IL13 и хемокина MCP-1 была повышена после введения нативных иМВ и иМВ-BFP по сравнению с контрольной группой PBS. Уровень этих белков оставался неизменным после инъекции иМВ-IL2, при этом не показывая значительных отличий от контрольной группы, которая получила только инъекцию PBS. Повышенная секреция провоспалительных цитокинов у мышей, которым вводили нативные иМВ и иМВ-BFP, может указывать на воспалительный ответ иммунной системы. Это также подтверждается наблюдаемой тенденцией к увеличению уровней провоспалительных цитокинов IFN-γ, IL2, IL5, IL12p40 и MIP-1α в сыворотке мышей после введения нативных иМВ или иМВ-BFP, но не иМВ-IL2. Однако уровень G-CSF, который стимулирует пролиферацию моноцитов в ответ на вирусные и бактериальные инфекции, был снижен у мышей, получавших нативные иМВ и иМВ-BFP. Это подтверждает, что воспалительный ответ был вызван введением нативных иМВ и иМВ-BFP, а не инфекцией. Интересно, что такой же эффект не наблюдался после инъекции иМВ-IL2. Также стоит отметить, что уровень эотаксина, который является хемоаттрактантом для эозинофилов при аутоиммунном воспалении, был значительно снижен после введения иМВ-IL2 по сравнению с инъекцией других образцов иМВ, подтверждая, что иМВ-IL2 не вызывают аутоиммунного ответа. В образцах после введения иМВ-GM-CSF наблюдалось значимое увеличение секреции провоспалительных цитокинов IL6 и IL12p40, а также тенденция к увеличению цитокинов TNF-α, GM-CSF и IL12p70. Вероятно, увеличение уровня секреции этих цитокинов в сыворотке мышей после введения иМВ-GM-CSF может быть связано с тем, что содержащийся в везикулах белок повлиял на созревание дендритных клеток. В то же время, тенденция к увеличению уровня секреции GM-CSF связано с тем, что IL6 аутокринно стимулировал дендритные клетки продуцировать больше GM-CSF для поддержания созревания. В образцах после введения иМВ-IFNA17 наблюдалась тенденция к увеличению цитокинов TNF-α, IL6 и IFN-γ. Тенденции к увеличению в секреции TNF-α, IL6 и IFN-γ могут свидетельствовать о том, что IFNA17, содержащийся в везикулах, могу повлиять метаболизм иммунных клеток мышей. Проведено исследование противоопухолевой активности иМВ, полученных из нативных и генетически модифицированных МСК, содержащих белки-онкосупрессоры и иммуномодулирующие цитокины IFNA17, TRAIL и PTEN. Для оценки противоопухолевой активности иМВ была получена ксенографтная модель опухоли молочной железы (MCF7) с использованием иммунодефицитных мышей линии BALB/c Nude. Нативные иМВ, иМВ-IFNA17, иМВ-PTEN и иМВ-TRAIL были введены непосредственно в область опухоли в количестве 100 мкг в 100 мкл PBS на 1, 7 и 14 сутки терапии. На 21 сутки было обнаружено, что рост опухоли у животных, получивших инъекции иМВ-TRAIL, достоверное замедлился по сравнению с опухолями, в которые были введены PBS, нативные иМВ или иМВ-IFNA17 и иМВ-PTEN. Индекс Ki-67 был статистически ниже в образцах опухоли после введения иМВ-TRAIL по сравнению с опухолями животных, которым вводили PBS или нативные иМВ. В группах с введением иМВ-IFNA17 и иМВ-PTEN также не отмечалось различий индекса Ki-67. Однако индекс Ki-67 был снижен и в образце опухолей, в которые вводились нативные иМВ, что указывает на то, что скорее всего, подавление пролиферации опосредовано введением самих везикул, а не специфично иМВ-TRAIL. Уровень секреции апоптотического белка каспаза 3 был значительно выше в образцах опухолей, в которые вводились иМВ-TRAIL (в 1,9 раз) по сравнению с контрольной группой животных, которым вводили PBS и нативными иМВ (увеличение по сравнению с контрольной группой в 1,4 раза). В группах с введением иМВ-IFNA17 и иМВ-PTEN также не отмечалось различий в экспрессии каспазы 3. Вероятно, введение иМВ-TRAIL приводит к индукции апоптоза в опухолевых клетках. Окрашивание DAPI было использовано для определения того, связано ли вызванное иМВ-TRAIL снижение пролиферативной активности клеток с индукцией апоптоза. Введение животным в опухоли иМВ-TRAIL приводило к индукции конденсации и фрагментации хроматина, которая визуализировалась как интенсивная пикнотическая голубовато-белая флуоресценция внутри ядер клеток. Число апоптотических телец было незначительным, что говорит о том, что апоптоз в тканях не достиг поздней стадии. В образце тканей после введения нативных иМВ также наблюдалось небольшое количество пикнотических ядер. Однако их было значительно меньше по сравнению с образцом иМВ-TRAIL. В образце тканей опухоли после введения PBS окрашивание ядер было равномерное, не было отмечено явной конденсации хроматина или апоптотических телец. Таким образом, проведено исследование биораспределения, иммуномодулирующих и противоопухолевых свойств искусственных микровезикул мезенхимных стволовых клеток. Показано, что иМВ не обладают тропизмом к очагам опухолеобразования в сравнении с родительскими клетками. Внутривенное введение иМВ, содержащих IL2, GM-CSF и IFNA17, приводило к изменению цитокинового профиля сыворотки крови подопытных мышей. Наибольшее иммуномодулирующее действие оказывали иМВ-IL2. Также было показано, что иМВ-TRAIL обладают противоопухолевым действием при внутриопухолевом введении, что проявлялось увеличением числа апоптотических клеток в ткани опухоли, повышенной секрецией каспазы 3, а также уменьшением размера опухоли. Остальные исследуемые цитокины не проявляли выраженных противоопухолевых или иммуномодулирующих эффектов in vivo. Информация о публикациях в СМИ, посвященных результатам проекта: https://nkckfu.ru/tpost/v06en91ah1-novie-puti-vozdeistviya-na-opuholevie-kl