Аннотация результатов, полученных в 2018 году
При реализации проекта получены геномные и модельные олигонуклеотиды, модифицированные гуанидино-i-clamp остатками и способные образовывать i-мотивы при слабокислых и физиологически релевантных значениях pH. Показано, что данная модификация обладает стабилизирующими свойствами, сравнимыми с предложенной нами ранее i-clamp модификацией. Мы исследовали кинетику сворачивания (folding)/разворачивания (unfolding) нативных и модифицированных i-мотивов при умеренных, близких к физиологическим скачках рН (эксперименты с остановленным потоком (stopped flow)) для оценки применимости этих структур для разработки рН-сенсоров с быстрым откликом. Данная модификация оказывала незначительное негативное влияние на скорости сворачивания и разворачивания i-мотивов в псевдофизиологических условиях и при околофизиологических изменениях рН, но при этом обеспечивала заметную термодинамическую стабилизацию. В процессе исследований, мы впервые продемонстрировали быстрые реакции геномных i-мотивов на pH-стимулы, что говорит в пользу концепции геномных i-мотивов в качестве регуляторных элементов. Результаты данного исследования опубликованы в журнале Computational and Structural Biotechnology Journal (VB Tsvetkov, TS Zatsepin, AV Turaev, VM Farzan, GE Pozmogova, AV Aralov, AM Varizhuk. (2019) DNA i-Motifs With Guanidino-i-Clamp Residues: The Counterplay Between Kinetics and Thermodynamics and Implications for the Design of pH Sensors. Computational and Structural Biotechnology Journal, 17, 527-536) (https://doi.org/10.1016/j.csbj.2019.04.006) Далее, были проведены исследования аналогов бензотиазолового оранжевого (BO) c одним, двумя или тремя метилбензотиазолилметилиденовыми заместителями в 1-метилпиридиниевом кольце. Мы проанализировали параметры флуоресценции данных красителей в комплексе с различными ДНК структуры, в том числе неканоническими вторичными структурами, включая G-квадруплексы (G4) и i-мотивы (IM). Все красители эффективно различали G4 и одноцепочечные ДНК. Би- и тризамещенные производные имели в основном сходные распределения относительных интенсивностей флуоресценции. Монозамещенные производные проявляли повышенную чувствительность к параллельным G4. Все красители были особенно чувствительны к структуре G4 с дополнительным дуплексным модулем (тромбин-связывающий аптамер TBA31), предположительно благодаря отличному способу связывания (взаимодействие с сочленением двух модулей). В частности, BO показал значительное (по меньшей мере, 160-кратное) увеличение квантового выхода флуоресценции в комплексе с TBA31, по сравнению со свободным красителем, что может быть использовано для разработки систем биоимиджинга на основе пары аптамер-краситель. Квантовые выходы флуоресценции 2,4-бизамещенного производного в комплексе с хорошо изученными G4 из промоторов онкогенов были в диапазоне 0,04-0,28, то есть сравнимыми с квантовыми выходами «золотого» стандарта, тиофлавина T (ThT) с теми же G4. Используя ряд известных соединений с высоким и низким сродством к теломерным G4 и G4 промоторов онкогенов, мы продемонстрировали применимость 2,4-бизамещенного производного в FID-анализе (замещение флуоресцентного интеркалятора) для профилирования G4 лигандов. Мы также показали, что данное производное повышало температуру плавления гибридных и параллельных G4 в присутствии дцДНК. Таким образом, данный лиганд выглядит перспективным кандидатом на роль селективного G4-стабилизирующего агента. Результаты проведенных исследований опубликованы в журнале Biochimie (Anton V.Turaev, Vladimir B.Tsvetkov, Maria V.Tankevich, Igor P.Smirnov, Andrey V.Aralov, Galina E.Pozmogova, Anna M.Varizhuk) Benzothiazole-based cyanines as fluorescent “light-up” probes for duplex and quadruplex DNA. (2019) Biochimie, in press (https://doi.org/10.1016/j.biochi.2019.04.018)

Аннотация результатов, полученных в 2019 году
В отчетный период были более точно исследованы стабилизирующие свойства ненуклеозидных вставок на основе пролинола, содержащих различные феноксазиновые производные. Данные модификации не нарушают вторичной структуры i-мотивов, нооказывают незначительный стабилизирующий эффект (до +1,7°С). Также, был опробован новый феноксазиновый остов для конструирования G4-стабилизирующих лигандов. Оптимизация длины протонированных аминоалкильных линкерных групп проводилась с помощью компьютерного моделирования. В результате были синтезированы два лиганда с двумя линкерными группами, по-разному ориентированными относительно друг друга (под 180 и 90°), и один лиганд с одной линкерной группой. Лиганды с двумя линкерными группами значительно повышали термостабильность G-квадруплексных структур (повышали температуру плавления до 20 ° C) и проявляли селективность к G4 по сравнению с дуплексной ДНК. Полученные результаты обеспечивают перспективные лиганды G4 для дальнейших биологических исследований и открывают возможность для разработки новых агентов на основе феноксазина, взаимодействующих с G4. Кроме того, также были проведены исследования стабилизирующих свойств 1,3-диаза-2-оксофеноксазина в состава параллельных дуплексов в присутствии ионов серебра. Данный флуоресцентный аналог цитозина способен образовывать стабилизирующие пары оснований X – Ag (I) –X и X – Ag (I) –C в ДНК дуплексах, что подтверждается температурно-зависимой УФ-спектроскопией и люминесцентной спектроскопией. DFT расчеты пар оснований в присутствии иона серебра (I) предполагают наличие синергетической водородной связи. Моделирование с помощью молекулярной динамики (MD) целых дуплексов ДНК недвусмысленно подтверждает геометрическую гибкость данных пар оснований с синергетической водородной связью. При связывании иона серебра (I) с парами оснований X: X или X: C максимум излучения люминесценции испытывает смещение в красную область с 448 на 460 нм при возбуждении при 370 нм. Важно отметить, что при связывании иона серебра (I) свечение 1,3-диаза-2-оксофеноксазина существенно не гасится. Фактически, интенсивность люминесценции даже увеличивается при образовании пары оснований X – Ag (I) –C, что, как ожидается, будет полезным для разработки биосенсоров. Как следствие, пары 1,3-диаза-2-оксофеноксазиновых оснований, стабилизированные ионом серебром (I), представляют собой первые пары оснований с ионом металла с сильной флуоресценцией (https://link.springer.com/article/10.1007/s00775-019-01682-1).