Аннотация результатов, полученных в 2018 году
В ходе выполнения проекта проведены исследования комплексов человеческого сывороточного альбумина (ЧСА) с различными гидрофобными производными тетрафенилпорфиринов и протопорфиринов, и с производным фуллерена (PCBM). Проведено сравнение их свойств с растворимым в воде катионным порфирином (5,10,15,20-тетракис(N-метилпиридил-4′)порфирин (TMPyP4). Методом оптической спектроскопии показано, что исследованные гидрофобные производные тетрафенилпорфиринов и протопорфиринов образуют комплекс с ЧСА, однако для большинства из них формирование комплекса способствует лишь частичной дезагрегация порфиринов и повышению их растворимости в воде. Методом импульсного фотолиза показано, что в таких комплексах происходит тушение триплетного состояния порфирина и высокореакционные частицы под действием света не формируются. Показано, что тетра(гидроксифенил)порфирин (H2Ph-OH) образует комплекс с ЧСА, где преимущественно находится в мономерной форме. Методом флуоресцентной спектроскопии определены параметры комплексообразования для H2Ph-OH и метилового эфира протопорфирина (H2DP) с ЧСА. Показано наличие двух сайтов связывания с белком с константой ассоциации ~ 1E+05. Синтезирован спин-меченый ЧСА. Определены время корреляции движения и параметры анизотропии движения нитроксильной метки, селективно введенной в Cys-34 ЧСА. Показано, что изменение pH раствора в диапазоне от 6.5 до 8 и формирование комплексов с порфиринами TMPyP4, H2Ph-OH и H2DP не оказывают значительного влияния на спектры ЭПР и соответственно на локальное окружение метки. Обнаружено, что формирование комплекса с порфирином препятствует димеризации ЧСА. Метод дипольной ЭПР спектроскопии с использованием фотоиндуцированного триплетного состояния впервые применен для исследования биологически важной системы (комплексов с ЧСА), со сложной третичной структурой. Получены функции распределения по расстояниям между фотовозбужденным триплетом фотосенсибилизаторов TMPyP4, H2Ph-OH и нитроксильным радикалом, селективно введенным в ЧСА. Определена степень экранирования триплетной молекулы фотосенсибилизатора от молекул растворителя в комплексе с белком. Показано, что H2Ph-OH образует комплекс с ЧСА в двух сайтах связывания, расположенных в доменах IIa и IIIa, где порфирин экранирован от взаимодействия с молекулами воды.TMPyP4 образует комплекс с ЧСА преимущественно в одном сайте, в домене 1B, в котором сохраняется высокая доступность порфирина к молекулам растворителя. Получена функция распределения по расстояниям между медью в тетрафенилпорфирине и нитроксильным радикалом, селективно введенным в ЧСА. Показано наличие двух сайтов связывания. Исследован комплекс ЧСА с производным фуллерена (PCBM). Показано, что в ЧСА имеется два разных сайта связывания для PCBM, расположенных в доменах IIa (основной сайт) и IIIa. Определены параметры распределения электронной спиновой плотности (параметры D и E) фотовозбужденных триплетных молекул порфиринов TMPyP4 и H2Ph-OH в комплексе с ЧСА и в гомогенном растворе. Показано, что параметры D и E не изменяются при образовании комплекса с ЧСА и составляют D=0.9 ГГц и E=0.3 ГГц для TMPyP4, и D=0.4 ГГц и E=0.08 ГГц для H2Ph-OH. Сделан вывод о том, что формирование комплекса с ЧСА не влияет на распределение спиновой плотности в триплетной молекуле и, соответственно, порфирины сохраняют свою изначальную структуру в комплексе с белком. Определена эффективность генерации синглетного кислорода порфиринами H2Ph-OH и TMPyP4 в комплексе с ЧСА. Не смотря на то, что по данным ЭПР образование комплекса TMPyP4 с ЧСА не влияет на квантовый выход триплетного состояния и структуру порфирина, в комплексе с белком для данного порфирина обнаружено значительное понижение эффективности генерации синглетного кислорода. Для комплекса ЧСА с тетра(гидроксифенил)порфирином наблюдается эффективная генерация синглетного кислорода, что делает такую систему перспективной для использование в фотодинамической терапии и в качестве основы для создания наночастиц

Аннотация результатов, полученных в 2019 году
В ходе выполнения проекта в 2019-2020 г. проведены исследования комплексов человеческого сывороточного альбумина (Human Serium Albumin, HSA) с феофорбидом A (PhA) и фталоцианином (ZnPc) цинка. Методом оптической спектроскопии показано, что в присутствии HSA происходит частичная дезагрегация PhA и ZnPc до мономерной формы. Наличие мономерной формы данных соединений в комплексе с HSA также подтверждается данными импульсного ЭПР, где наблюдается появление сигнала от фотовозбужденного триплетного состояния в присутствии белка. Определены параметры распределения электронной спиновой плотности (параметры D и E) триплетных молекул PhA и ZnPc в комплексе с HSA и в гомогенном растворе. Показано, что параметры D и E не изменяются при образовании комплекса с HSA и составляют D=0.51 ГГц и E=0.5 ГГц для PhA и D=0.72 ГГц и E=0.160 ГГц для ZnPC. Сделан вывод о том, что формирование комплекса с HSA не влияет на распределение спиновой плотности в триплетной молекуле и, соответственно, порфирины сохраняют свою изначальную структуру в комплексе с белком. Определена степень экранирования триплетной молекулы фотосенсибилизатора от молекул растворителя в комплексе с белком. Показано, что PhA и ZnPc в комплексе с HSA расположены внутри кармана белка, где полностью экранированы от молекул растворителя. Получены данные, указывающие на протекание фотохимической реакции между ZnPc и HSA с образованием радикала. Для комплекса HSA-NIT/PhA методом ДЭЭР получена функция распределения по расстояниям между PhA и нитроксильным радикалом, где наблюдается 1 основной пик с <r>=2.5 нм. На основании литературных данных были рассчитаны ожидаемые расстояния между потенциальными сайтами связывания PhA и нитроксильным радикалом, введенным в Cys-34 HSA. Основной пик с <r> ~ 2.5 нм соответствует связыванию PhA с сайтом в домене IIA, который включает область вблизи Trp214. Определена эффективность генерации синглетного кислорода порфиринами (PhA, ZnPc, тетрагидроксифенил-порфирином (THPP) и 5,10,15,20-тетракис(N-метилпиридил-4′)порфирином (TMPyP4)) в комплексе с HSA. Эффективность генерации синглетного кислорода в буфере для THPP, PhA и ZnPC значительно ниже, чем для водорастворимого порфирина TMPyP4 вследствии образования агрегатов. При фотолизе комплексов HSA c PhA и ZnPC синглетный кислород не детектируется. Для ZnPc/HSA наиболее вероятной причиной отсутствия генерации синглетного кислорода в комплексе с HSA является протекание реакции между фотовозбужденным порфирином и HSA. Для PhA подавление генерации синглетного кислорода при связывании с HSA связано c локализацией порфирина глубоко внутри HSA, где он полностью экранирован от молекул растворителя и кислорода. В проекте проведено исследование различных факторов, влияющих на времена электронной релаксации фотовозбужденного триплетного состояния порфирина. Обнаружено, что на скорость фазовой релаксации триплета порфирина (1 / Tm) заметное влияние оказывают ядра растворителя, в результате фазовая релаксация в протонированных растворителях быстрее, чем в дейтерированных растворителях. На основе этого эффекта была предложена методика исследования локального окружения порфиринов в комплексах с биополимерами, включая альбумин (Статья с результатами исследования прошла этап рецензирования в журнале Molecules) C использованием разработанной методики показано, что при связывании TMPyP4 с HSA сохраняется высокая доступность порфирина к молекулам растворителя. Согласно данным ЭПР в комплексе с HSA не изменяется квантовый выход триплетного состояния, но синглетный кислород в растворе при фотолизе комплекса не детектируется. Для установления причины этого эффекта комплекс TMPyP4 с HSA исследован методом импульсного фотолиза. Обнаружено, что время жизни триплета TMPyP4 в буфере не зависит от мощности лазерного импульса, что свидетельствует об отсутствии бимолекулярного тушения и показывает, что триплетное состояние в основном тушится молекулярным кислородом. Когда TMPyP4 образует комплекс с HSA, форма спектров промежуточного поглощения остается той же самой, но время жизни триплетного состояния значительно изменяется: с каждым последующим лазерным импульсом наблюдается удлинение кинетики. Полученные данные демонстрируют необратимое расходование молекулярного кислорода во время реакции за счет его превращение в синглетный кислород, который в дальнейшем, вероятно, участвует в окислении HSA. Для проверки этой гипотезы проведено исследование способности TMPyP4 и THPP приводить к фоторазложению HSA методом электрофореза в полиакриламидном геле (SDS-PAGE). Для комплекса TMPYP4 / HSA в SDS-PAGE обнаружено значительное уширение полосы мономера HSA после 40 минут облучения, что указывает на изменение структуры белка. Для комплекса mTHPP / HSA при фотолизе деградация белка не наблюдается. Проведена оценка влияния фотолиза порфиринов на вторичную структуру HSA методом круговом дихроизме (CD). После фотолиза комплекса TMPyP4 / HSA зарегистрировано уменьшение доли α-спиралей в структуре HSA, сопровождаемое увеличением доли антипараллельных β-структур, что свидетельствует о частичной дестабилизации альбумина. Для комплекса THPP / HSA не наблюдается каких-либо существенных изменений в спектрах CD после фотолиза. Данные дипольной ЭПР спектроскопии показывают, что TMPyP4 располагается в центре четырехспирального пучка субдомена IB. Данные сайт включает 4 цистеина, 2 гистидина и 1 метионин, которые, согласно литературным данным, являются наиболее вероятными мишенями для окисления синглетным кислородом. Для комплекса THPP с HSA методом импульсного ЭПР показано, что порфирин локализуется в субдомене IIIA HSA. Согласно данным ESEEM THPP находится внутри связывающего кармана HSA, где доступ молекул воды и кислорода к фотосенсибилизатору затруднен, что является причиной низкой эффективности генерации синглетного кислорода и отсутствия разложения белка при фотолизе THPP в комплексе с HSA. (Статья с результатами исследования находится на рецензировании в Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology). Проведены исследования наночастицы альбумина (NP HSA) в комплексе с перспективными фотосенсибилизаторами. Получены наночастицы альбумина с использованием метода десольватации (коацервации). Средний размер синтезированных наночастицы альбумина согласно данным динамического рассеяния света (DLS) составляет 100 нм. Формирование наночастиц альбумина приводит к появлению новых полос поглощения в оптических спектрах в районе 400-700 нм, что потенциально может негативно повлиять на способность фотосенсибилизаторов в комплексе с NP HSA генерировать синглетный кислород из-за уменьшения доли поглощаемого излучения. Образование комплекса с наночастицами приводит к возрастанию интенсивности полос поглощения для PhA и THPP в сравнении со спектрами в буфере вследствие частичной дезагрегации соединений, и величина этих изменений сравнима с эффектами, которые наблюдаются при связывании с альбумином. Обнаружена, что в ходе синтеза NP HSA методом десольватации даже при небольшом содержании спин-меченого альбумина (10% по отношению к немеченому HSA) белок выпадает в осадок при добавлении этанола. Это, по всей видимости, связано с тем, что спин-меченый альбумин значительно изменяет агрегационные свойства формирующихся наночастиц. Проведено сравнение двух методов приготовления наночастиц: в первом случае добавление фотосенсибилизаторов в раствор производилось вместе с этанолом (десольватирующим растворителем); во втором — после стабилизации наночастиц глутаральдегидом. На примере PhA показано, что обе методики обеспечивают одинаковое связывание порфирина c NP HSA и сравнимую эффективность генерации синглетного кислорода, однако, согласно данным DLS добавление порфирина до стабилизации глутаральдегидом приводит к уменьшению размера получаемых частиц до 70 нм. Для комплексов с NP HSA с THPP, PhA и TMPyP4 результаты ESEEM показывают, что порфирины, включая водорастворимый TMPyP4, находятся внутри наночастиц и экранированы от молекул растворителя. Согласно полученным, доля молекул растворителя в ближайшем окружении TMPyP4 в комплексе с HSA составляет 80%, а при образовании комплекса с NP HSA это значение уменьшается до 30 %. Несмотря на это для всех трех порфиринов при связывании с NP HSA эффективность генерации синглетного кислорода в растворе значительно увеличивается (до 12 раз) в сравнении с данными для комплексов с HSA. Максимальную эффективность генерации синглетного кислорода мы зарегистрировали в комплексе NP HSA с THPP, как в сравнении со значениями для этого порфирина в буфере и в комплексе с мономерным белком, так и в сравнении с другим гидрофобным порфирином PhA. Таким образом, комплекс NP HSA c THPP является наиболее перспективной системой для использования в фотодинамической терапии.