КАРТОЧКА ПРОЕКТА,
ПОДДЕРЖАННОГО РОССИЙСКИМ НАУЧНЫМ ФОНДОМ

Информация подготовлена на основании данных из Информационно-аналитической системы РНФ, содержательная часть представлена в авторской редакции. Все права принадлежат авторам, использование или перепечатка материалов допустима только с предварительного согласия авторов.

 

ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ


Номер 18-16-00074

НазваниеНовые механизмы регуляции автофагии, роста и солеустойчивости: изучение и использование для повышения солеустойчивости ячменя

РуководительТютерева Елена Владимировна, Кандидат биологических наук

Организация финансирования, регионФедеральное государственное бюджетное учреждение науки Ботанический институт им. В.Л. Комарова Российской академии наук, г Санкт-Петербург

Года выполнения при поддержке РНФ2018 - 2020

КонкурсКонкурс 2018 года «Проведение фундаментальных научных исследований и поисковых научных исследований отдельными научными группами»

Область знания, основной код классификатора 06 - Сельскохозяйственные науки, 06-104 - Агробиотехнологии

Ключевые словаАвтофагия, запрограммированная клеточная гибель, цитоплазматический калий, калиевый канал GORK, засоление, рост, фитохромы, жасмонат, Arabidopsis, ячмень, устьичная регуляция, тканеспецифичные промоторы, стабильная трансформация, CRISPR/Cas9

Код ГРНТИ34.17.09


 

ИНФОРМАЦИЯ ИЗ ЗАЯВКИ


Аннотация
Активация у растений механизмов ответа на стресс любого рода сопровождается остановкой и замедлением роста, а при длительном стрессовом воздействии приводит к изменению морфологии растения. Для сельскохозяйственно ценных культур это, как правило, негативно сказывается на урожае. До настоящего времени считалось, что остановка роста связана с перераспределением ресурсов растения – как правило, в форме ассимилятов – от продукции новой биомассы растущих органов в русло использования для энергообеспечения механизмов детоксикации и других процессов, активирующихся в ответ на стресс. Однако, в последнее время появились исследования, которые убедительно показывают, что остановка роста и запуск механизмов борьбы со стрессом представляют собой две отдельные генетические программы, которые функционируют в тесной связи, но тем не менее могут быть полностью разобщены у мутантов по соответствующим ключевым регуляторам этих программ (Campos et al. Rewiring of jasmonate and phytochrome B signalling uncouples plant growth–defense tradeoffs. Nat Commun. 2016; 7: 12570). Такие мутанты Arabidopsis thaliana в условиях стресса демонстрируют повышенную стрессоустойчивость и сильный рост, сравнимый либо превосходящий (видимо, за счет трансгрессивных эффектов) дикий тип. В цитируемой работе жасмоновая кислота выступает индуктором стрессового ответа, а фитохром В отвечает за остановку роста при активации жасмонатного сигналинга. Настоящий проект базируется на результатах исследований, проведенных в рамках двух поддержанных РНФ проектов (№14-16-00120 и №15-14-30008), где нами был охарактеризован новый потенциальный регулятор запуска ката- vs. ана-болических программ – локализованный в плазматической мембране клеток корня и замыкающих клеток устьиц наружу-выпрямляющий калиевый канал GORK, предположительно представляющий собой сенсор активных форм кислорода (Demidchik et al., рукопись в подготовке). Мутанты Arabidopsis, лишенные данного канала, в стрессовых условиях демонстрировали улучшенную выживаемость за счет снижения индукции запрограммированной клеточной гибели (ЗКГ; Demidchik et al. 2010) и автофагии (Demidchik, Tyutereva, Voitsekhovskaja, 2017), а также продолжали рост (Demidchik et al., рукопись в подготовке). Примечательно, что канал GORK является единственным местом утечки цитоплазматического калия из клеток корня Arabidopsis и злаков (Shabala, Cuin, 2008; Velarde-Buendía et al., 2013). По нашим данным (Demidchik et al., 2010; результаты проекта РНФ №15-14-30008) именно потеря клеткой калия является критическим триггером, активирующим автофагию и ЗКГ в условиях абиотического стресса, в том числе при засолении. В то же время известно, что истощение растений по калию вызывает активацию нескольких групп генов, но наиболее сильный ответ демонстрируют гены, регулируемые жасмонатом (Armengaud et al. 2004). Именно эти гены отвечают за остановку роста и индукцию стрессоустойчивости у Arabidopsis (Valezuela et al., 2014) и ячменя (Ahmad et al., 2016), при этом наиболее охарактеризована роль жасмоната в индукции устойчивости к некротрофным патогенам, а также к засолению. Последние исследования показали, что для жасмонат-зависимой остановки роста и изменений морфогенеза корней и побегов критически необходимо наличие другого ключевого регулятора роста и развития растений – фитохрома B, причем как в корнях, так и в побегах (Costigan et al., 2011); соответственно, мутанты Arabidopsis и томата, лишенные фитохрома B, демонстрировали высокий рост в условиях солевого стресса (Chen et al., 2013, Gavassi et al., 2017). В проекте планируется детально исследовать недавно выявленную (нашими и литературными данные) взаимосвязь ключевых регуляторных событий, имеющих место при ряде стрессовых воздействий - GORK-зависимой потери калия, индукции автофагии и ЗКГ, активации жасмонат-зависимых генов стрессового ответа, изменений роста и морфогенеза - на модели солевого стресса как наиболее изученной и наиболее актуальной с практической точки зрения, а также выявить регуляторное действие фитохрома В на эту цепочку событий. В качестве модельного объекта будут использованы растения Arabidopsis и ячменя, поскольку ведущая роль канала GORK в устойчивости к засолению охарактеризована наиболее полно для ячменя по сравнению с другими ключевыми для сельского хозяйства культурами (Shabala, Cuin, 2008; Adem et al., 2014). Далее, на модели растений ячменя, несущих мутацию chlorina f2 3613 и обладающих измененной экспрессией фитохромов (результаты проекта РНФ №14-16-00120; Тютерева и др., рукопись в подготовке) будет изучен механизм, обусловливающий ускоренное по сравнению с диким типом прорастание этих мутантов на среде, содержащей 100 мМ NaCl, согласно предварительным результатам. Наконец, мы планируем получить и исследовать мутанты-нокауты по каналу GORK, не экспрессирующие этот ген в клетках корня, но сохраняющие его экспрессию в клетках устьиц за счет комплементации нативным каналом GORK под промотором гена StKST1, специфично экспрессирующегося в устьицах у ряда однодольных и двудольных растений (Mueller-Roeber et al., 1995; Kelly et al., 2017). Предположительно такие растения будут высокоустойчивы к солевому стрессу за счет оптимизации стрессовых ответов корня при сохранении интакной устьичной регуляции. В проекте будут комплементированы мутанты gork1-1 Arabidopsis, а с помощью системы нокаутирования генов CRISPR/Cas9 планируется получение нокаутов ячменя по единственной копии гена GORK ячменя (BAK07979.1 в базе данных Genbank) с целью их дальнейшей устьично-специфичной комплементации каналом GORK. Анализ растений нокаутов будет проведен при помощи техники пэтч-кламп. Также при помощи электрофизиологических подходов будут протестированы линии ячменя с различной солеустойчивостью, что даст важнейшую информацию и функциональных перестройках GORK при выработки устойчивости к засолению. Чтобы определить, может ли потеря калия цитоплазмой клеток при солевом стрессе играть роль в увеличении смертности также и у клеток растений, эволюционно не обладающих калиевыми каналами GORK-типа, в проекте будет использоваться культура высокопродуктивного штамма зеленой водоросли Haematococcus pluvialis. H. pluvialis является крупнейшим мировым продуцентом астаксантина, однако, наиболее распространенный метод индукции биосинтеза этого вещества – подвергание водорослей солевому стрессу – связан с большими потерями биомассы из-за резкого увеличения клеточной гибели в этих условиях. Научная новизна проекта высока, поскольку он базируется на самых новых данных, полученных в том числе коллективом исполнителей. Высокая актуальность проекта для сельского хозяйства обусловлена, во-первых, широким распространением засоленных почв в мире (около 30% обрабатываемых земель); во-вторых, неуклонным увеличением площади почв, обедненных калием, в связи с усиленным выносом калия при получении высоких урожаев; в-третьих, предложенный подход пока что не исследован с точки зрения его потенциала для сельского хозяйства. Подход состоит в том, что для сельскохозяйственных культур, выращиваемых в условиях относительной стабильности светового и водного режима и регулярной обработки защитными средствами против патогенов, отключение ряда генетических программ, необходимых растениям в дикой природе для обеспечения максимально широкого спектра ответов на меняющиеся условия внешней среды, в особенности программ, связанных с остановкой роста и клеточной гибелью, может привести к получению сортов, способных давать высокий урожай в условиях стресса.

Ожидаемые результаты
В результате реализации проекта впервые будет изучена возможность направленного изменения экспрессии генов, кодирующих ключевой регулятор уровня калия в цитоплазме клеток корня - наружу-выпрямляющий калиевый канал GORK – для получения растений с высоким уровнем роста и продуктивности в условиях солевого стресса. Будет впервые охарактеризована взаимосвязь между GORK-опосредованной потерей цитоплазматического калия, запуском автофагии и ЗКГ и индукцией жасмонат-зависимых генов стрессового ответа и остановки роста, и роль фитохромной системы в этих процессах, у модельного растения Arabidopsis thaliana, а установленные закономерности будут проверены на растениях ячменя – культуре, обладающей высокой сельскохозяйственной значимостью в РФ и в мире. Основные результаты будут получены по следующим направлениям: (1) Будет определена взаимосвязь активации автофагии и ЗКГ, а также остановки роста, индуцированных потерей калия из клеток корня через каналы GORK при солевом стрессе, с системами жасмонатного и фитохромного сигналинга на модели Arabidopsis thaliana с использованием имеющихся в распоряжении коллектива мутантных линий (gork1-1, phyA, phyB, mor1, линии gork1-1, комплементированные нативной либо мутированной формой канала GORK) и трансгенных линий, экспрессирующих меченые флуоресцентными метками белки автофагосом, цитоскелета, а также сам канал GORK, в мутантных и диких генотипах; (2) Будет выявлена роль фитохромного сигналинга в остановке роста и запуске автофагии и ЗКГ при солевом стрессе для ячменя (модели: дикий тип, чувствительные к солевому стрессу сорта Donaria, Bonus, Tron; линии мутантов chlorina на основе этих сортов; дикий тип, устойчивые к солевому стрессу сорта, предоставленные ВИР им. Н.И. Вавилова: 24714- Енисей pallidum, районирован в Красноярском крае, К-19741 nutans Неполегающий, к-21872- Айхал pallidum, районирован в Якутии, к 23682 Донецкий 8 medicum); (3) Будет изучена роль ключевых известных на сегодняшний день регуляторов запуска автофагии – киназ TOR и KIN10, а также цитозольного фермента глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (GAPDH), в индукции автофагии при потере клетками корней цитоплазматического калия при солевом стрессе на модели Arabidopsis thaliana, с целью выявления компонентов, регулирующих данный процесс у растений; (4) Будет исследовано влияние нокаутной мутации gork, а также совместное влияние мутаций gork и мутаций по фитохромам А и В (phyA, phyB), на работу клеток устьиц на модели Arabidopsis thaliana; (5) Будут получены растения-мутанты gork1-1, комплементированные нативным каналом GORK под промотором гена StKST1, специфично экспрессирующегося в устьицах, на которых будет изучена их устойчивость к солевому стрессу и устьичная регуляция; (6) Будут проведены эксперименты по получению растений-нокаутов ячменя по гену ортологу AtGORK с помощью трансформации каллусов системой CRISPR-Cas9 и регенерации трансформантов (освоение метода планируется в рамках стажировки в The Sainsbury Laboratory, Великобритания, Dr. Matthew Moscou), и оценена устойчивость полученных растений к солевому стрессу; на основании результатов на модели Arabidopsis thaliana будут проведены эксперименты по комплементации этих растений нативным каналом GORK в устьицах. (7) Мутанты по GORK будут протестированы функционально при помощи техники пэтч-кламп. Также при помощи электрофизиологических подходов будет выявлена картина адаптационных функциональных перестроек GORK у солеустойчивых сортов ячменя. (8) Будет определено, связана ли высокая смертность клеток зеленой водоросли Haematococcus pluvialis (не содержащих канал GORK) в ходе индукции биосинтеза астаксантина солевым стрессом с потерей цитоплазматического -калия, аналогично высшим растениям. Результаты, которые будут получены в ходе реализации проекта, крайне важны для практического использования, поскольку являются базой для создания основ инновационной селекции солеустойчивых сортов в Российской Федерации. Инновационное сельское хозяйство в области растениеводства подразумевает совершенствование методов селекции в плане создания новых сортов сельскохозяйственных культур, обладающих высоким продуктивным потенциалом, а также освоение научно обоснованных систем земледелия и семеноводства. Полученные данные смогут быть использованы в разработке способов повышения продуктивности ячменя в условиях засоленности почв на основе селекции новых сортов. Часть результатов с большой вероятностью сможет быть использована в биотехнологических приложениях при выращивании микроводорослей. Планируется опубликовать результаты НИР в виде серии научных статей в ведущих научных журналах мира, что увеличит рейтинг и престиж российской науки.


 

ОТЧЁТНЫЕ МАТЕРИАЛЫ


Аннотация результатов, полученных в 2018 году
1. Проведены эксперименты по установлению временного хода индукции автофагии в корнях проростков Arabidopsis thaliana экотипа Wassilewskija (Ws-0) и полученной в Ws-0 методом T-ДНК-инсерционного мутагенеза мутантной линии gork 1-1, содержащей нонсенс-мутацию в гене AT5G37500, кодирующем канал GORK (gated outwardly-rectifying K+ channel). Выявлены наиболее сильно индуцирующие автофагию концентрации NaCl и периоды максимумов образования автофагосом. Показано, что выраженная автофагия в клетках корня дикого типа индуцируется за 6-8 ч экспозиции в буфере, содержащем 50 mM NaCl, тогда как в клетках мутанта gork 1-1 накопление автофагосом наблюдается только через 10-12 ч солевого стресса. Этаблированы методы визуализации мертвых и живых клеток корня Arabidopsis thaliana в условиях солевого стресса с помощью нескольких специфичных флуоресцентных красителей (DAPI, диацетат флуоресцеина, пропидиум иодид). Проведена предварительная оценка уровня индукции клеточной смерти дикого типа и мутанта при солевом стрессе (100 mM NaCl, длительность экспозиции 2 ч). Изучена динамика роста корней проростков на фоне нескольких концентраций NaCl в фитагелезированной среде. Растительный материал собран, проводится выделение РНК для выявления точки активации экспрессии маркерного гена жасмонатного сигналинга при адаптации к солевому стрессу и исследование уровней экспрессии фитохромов А, В. 2. За отчетный период было проведено размножение семенного материала солеустойчивых сортов ячменя из коллекции генетических ресурсов растений ВИР. На основе полевого изучения образцов ячменя проведена оценка элементов продуктивности солеустойчивых сортов ячменя при выращивании в условиях Ленинградской области. Проведены серии экспериментов по оценке солеустойчивости растений ячменя Donaria и chlorina f2 3613 в гидропонной системе выращивания. Изучен рост проростков ячменя в условиях солевого стресса. Проведен скрининг используемых в проекте линий и сортов ячменя на солеустойчивость при выращивании на белом свету. Растительный материал собран, проводится выделение РНК для выявления точки активации экспрессии маркерного гена жасмонатного сигналинга JIP23 и исследования уровней экспрессии фитохромов А, В и С. Опробован метод ранней проростковой диагностики устойчивости к засолению и показана средняя степень солеустойчивости как у дикого типа Donaria (44-45%), так и мутанта chlorina f2 3613 (40-41%). Адаптирован метод оценки динамики флуоресценции хлорофилла с помощью ПАМ-флуориметрии, проведена оценка базовых параметров фотохимической активности фотосистемы II (F0, Fm, Fv/Fm) в листьях мутанта ячменя chlorina f2 3613 при выращивании в гидропонной культуре в условиях солевого стресса (150 мМ NaCl). 3. С использованием гидропонной системы выращивания начаты эксперименты по исследованию влияния дальнего красного света на развитие проростков ячменя в условиях солевого стресса (150 mM NaCl). Выявлено значительное подавление прорастания и торможение роста проклюнувшихся семян в условиях засоления. Собран листовой (отдельно колеоптили и настоящие первые листья), а также корневой материал для последующей экстракции РНК и оценки уровня экспрессии генов интереса. 4. Выполнено исследование активности TOR-киназы в ответ на солевой стресс в трансгенных линиях Arabidopsis thaliana со сверхэкспрессией белка SK6 (субстрата TOR-киназы), меченой тегами FLAG и НА. Растительный материал собран и находится в обработке. 5. Проведены эксперименты по стимуляции автофагии и визуализации автофагосом в клетках микроводоросли Haematococcus pluvialis. при добавлении тиомочевины, голодании культуры (на фоне исключении нитратов из среды) и под воздействием ионов тяжёлых металлов (Ni2+). Отработана методика визуализации автофагосом с помощью иммуномечения антителом к ассоциированному со зрелыми автофагосомами ATG-8 белку. 6. Запланированные на отчетный 2018 год исследования успешно выполнены. Получены экспериментальные данные и адаптирован комплекс методов, необходимых для решения задач проекта, запланированных на последующие этапы его выполнения.

 

Публикации

1. Рабаданова К. К., Тютерева Е. В., Демидчик В. В., Войцеховская О.В. Исследование индукции автофагии при стрессе: роль калия в регуляции TOR-киназы у Arabidopsis thaliana Труды XIV Съезда Русского ботанического общества и конференции «Ботаника в современном мире» (г. Махачкала, 18-23 июня 2018 г.)., Т. 3: Споровые растения. Микология. Структурная ботаника. Физиология и биохимия растений. Эмбриология растений. – Махачкала: АЛЕФ, 2018. С. 325-326 (год публикации - 2018).

2. Рабаданова К.К, Тютерева Е.В., Демидчик В.В., Войцеховская О.В. Роль калия в регуляции TOR-киназы при стресс-индуцированной автофагии у Arabidopsis thaliana Материалы IV (XII) Международной ботанической конференции молодых учёных в Санкт-Петербурге 22–28 апреля 2018 года, СПб.: Изд-во СПбГЭТУ «ЛЭТИ». C. 180. (год публикации - 2018).

3. Тютерева Е. В., Рабаданова К. К., Добрякова К.С., Демидчик В.В., Войцеховская О.В. Роль автофагии в стрессовых ответах растений Труды XIV Съезда Русского ботанического общества и конференции «Ботаника в современном мире» (г. Махачкала, 18-23 июня 2018 г.), Т. 3: Споровые растения. Микология. Структурная ботаника. Физиология и биохимия растений. Эмбриология растений. – Махачкала: АЛЕФ, 2018. С. 343-345. (год публикации - 2018).