Аннотация результатов, полученных в 2018 году
РНК бактерий модулируют широкий спектр физиологических ответов и регулируют ключевые этапы жизнедеятельности у целого ряда возбудителей заболеваний. Mалые РНК внутриклеточных патогенных бактерий могут не только адаптировать бактериальный транскриптом под меняющиеся условия, но также взаимодействовать с транскриптомом инфицированного организма, вмешиваясь тем самым в процессы антибактериальной защиты. В данном проекте мы формулируем идею о роли малых РНК M tuberculosis DrrS (MTS1338) и MTS0997 как регуляторов, запускающих каскад реакций для демпфирования повреждающих факторов макрофагов. Результаты выполнения проекта за 2018 год: 1. Определены метаболические пути, регулируемые малыми РНК DrrS и MTS0997 при росте микобактерий в культуре. Были получены knock-out штаммы M.tuberculosis с делетированными генами малых РНК MTS0997 и DrrS. Для определения функционального значения малых РНК мы провели сравнительный анализ данных полнотранскриптомного секвенирования КО штамма, штамма, оверэкспрессирующего малую РНК, и штамма дикого типа. DrrS: Оверэкспрессия DrrS приводит к изменениям в транскриптоме микобактерий, которые можно описать как «вход микобактерий в дормантность, индуцированную стрессом», что выражается в адаптации метаболизма к NO-индуцируемому и окислительному стрессам, а также активному взаимодействию с клетками иммунной системы. При повышении количества транскриптов DrrS: (1) усиливается экспрессия ряда транскрипционных регуляторов ответа на гипоксию, (2) активируется синтез белков защиты от окислительного и NO стресса, (3) происходит перестройка дыхательного метаболизма. Увеличивается экспрессия генов, ассоцированных с метаболизмом азота, (4) репрессируются процессы биосинтеза аминокислот и клеточного деления, (5) активируется транскрипция многих генов семейства PE/PPE и компонентов систем секреции ESX-1 и ESX-5. При анализе генов, меняющих свою экспрессию в KO DrrS по сравнению с диким типом, следует отметить, что среди генов, максимально понизивших свою экспрессию, представлено более половины генов DosR регулона, который играет важнейшую роль в обеспечении перехода микобактерий в дормантное состояние. Тем самым, транскриптомы KO DrrS и over DrrS функционально «зеркальны». Выявленные изменения характерны для микобактерий при персистировании в макрофагах. С учетом полученных ранее данных о том, что триггером экспрессии DrrS при инфекции in vivo является NO, можно заключить, что малая некодирующая РНК DrrS является активатором молекулярных механизмов, необходимых для выживания M. tuberculosis внутри макрофага (E. Salina et al, Journal of Infectious Diseases, under review). MTS0997: Транскриптом мутантного штамма не выявил явных метаболических путей, находящихся под контролем MTS0997. Гораздо более интересны результаты, полученные при анализе транскриптома штамма M.tuberculosis, оверэкспрессирующего MTS0997. Выявлено существенное повышение (до 20 раз) транскрипции генов Zur регулона (22 гена из 31). В его состав входят гены rpsR2 и rpsN2, кодирующие цинк-независимые альтернативные рибосомные белки (AltRPs), которые связываются с 30S рибосомными субчастицами при низких концентрациях ионов цинка, в отличие от их Zn-зависимых паралогов - канонических рибосомных белков. Также в Zur регулоне содержатся гены, кодирующие компоненты системы секреции ESX-3. Белок Zur является негативным регулятором генов Zur регулона. Он транскрибируется совместно с другим транскрипционным фактором, smtB. Согласно программе биоинформатического предсказания мишеней малых РНК COPRA MTS0997 имеет возможный сайт связывания в 5’UTR гена smtB. Если малая РНК MTS0997 негативно регулирует синтез белка Zur на бицистронной мРНК, то при оверэкспрессии этой малой РНК (что происходит при инфекции in vivo) снижается количество регулятора Zur, что приводит к активации генов Zur регулона. Эта гипотеза будет проверена в рамках гранта в 2019 г. 2. Создана модель для визуализации малых РНК в клетках инфицированных макрофагов методом конфокальной микроскопии. В наших предварительных экспериментах было показано наличие транскриптов малых РНК DrrS и MTS0997 в цитоплазме инфицированных макрофагов. Для детекции малых РНК нами созданы генетически кодируемые химерные РНК, состоящие из малой РНК и РНК аптамера (Broccoli), способного к флуоресценции под действием флуорофора DFHBI. Проведены эксперименты по выбору оптимального соотношения между длиной и разветвленностью вторичной структуры и интенсивностью флуоресценции химерной РНК. Созданы штаммы M.smegmatis, экспрессирующие выбранные оптимальные химерные конструкции. Эти штаммы использовали для инфекции клеток макрофагов мыши RAW264.7 и последующего анализа с помощью конфокальной микроскопии. Зелёные и красные сигналы колокализуются в клетках, что свидетельствует о флуоресценции химерных РНК в бактериях. На настоящий момент это первый пример визуализации малой бактериальной РНК при инфекции макрофагов бактериями. Подобранные на M.smegmatis условия (тип аптамера, концентрация флуорофора, условия инфекции на покровных стеклах для дальнейшей визуализации) будут использованы в экспериментах на M.tuberculosis. 3. Малая РНК DrrS замедляет процесс образования фаголизосом и увеличивает выживаемость микобактерий в макрофагах. Мы провели эксперименты по влиянию экспрессии DrrS на выживание микобактерий в макрофагах, для чего инфицировали клеточную линию RAW264.7 M.smegmatis-DrrS и контрольным штаммом, содержащим вектор pMV261. Экспрессия малой РНК приводит к значимому увеличению количества выживших микобактерий. Проведены эксперименты по колокализации M.smegmatis, экспрессирующих DrrS, и контрольного штамма с маркерами созревания фаголизосом (LysoTracker Red DND-99 и LAMP1). Для обоих штаммов наблюдается образование фаголизосом, однако в случае M.smegmatis-DrrS колокализация микобактерий с маркерами образования фаголизосом наблюдается реже. Эти эксперименты показали, что экспрессия DrrS в микобактериях, поглощенных макрофагами, способствует их выживанию в агрессивной среде макрофагов за счет замедления созревания фаголизосом. 4. Выбрана оптимальная модель инфицирования первичной культуры макрофагов. Проведены эксперименты по инфицированию штаммами M.tuberculosis дикого типа и KO MTS0997 перитонеальных макрофагов мыши, как неактивированных, так и предварительно активированных рекомбинантным IFN-γ. Оптимальная MOI 1:1. Активацию макрофагов при инфицировании микобактериями H37Rv и KO MTS0997 оценивали по уровню экспрессии мРНК цитокинов и хемокинов в системе in vitro. Проведенные эксперименты демонстрируют непосредственное воздействие малых РНК на экспрессию цитокинов и хемокинов, в частности, делеция малой РНК приводит к снижению экспрессии IL-11, IL-1b и CSF-2. Для оценки вирулентности M. tuberculosis штамма H37Rv и его мутантной формы KO MTS0997 начат долгосрочный эксперимент на мышах линий B6 и I/St. В первой временной точке - четыре недели после инфицирования - оценили уровень воспаления и инфильтрации легочной ткани зараженных мышей. Анализ морфологической картины легочной ткани показал, что в случае инфицирования мышей (как I/St, так и B6) мутантной формой микобактерий воспалительные изменения легочной ткани незначительны и представляют собой мелкие очаги скоплений макрофагов и мононуклеаров вокруг стенок крупных сосудов и бронхов, в то время как при инфекции мышей штаммом дикого типа отмечается сильное воспаление, местами детектируются гранулемы. Таким образом, делеция гена малой РНК MTS0997 приводит к существенному снижению вирулентности M.tuberculosis на ранних сроках инфекции.

Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Создана универсальная система векторов для валидации взаимодействия малой РНК с мишенью. Система состоит из двух плазмид, созданных на основе шаттл-векторов. С одной плазмиды (pMV306) идет транскрипция гена зеленого флуоресцентного белка (eGFP) с 5’ – нетранслируемой областью (5’-НТО) гена, предположительной мишенью малой РНК. Со второй плазмиды (pAMYC) экспрессируется исследуемая малая РНК. При взаимодействии малой РНК с мишенью интенсивность флуоресценции будет ниже, чем при отсутствии такого взаимодействия. В случае подтверждения мишени данную систему легко модифицировать для того, чтобы верифицировать установленное взаимодействие (внесение прямых и компенсаторных мутаций во взаимодействующие последовательности). Система векторов была использована для проверки предполагаемого взаимодействия малой РНК MTS0997 с 5’-НТО гена smtB, однако это взаимодействие не подтвердилось. Гиперэкспрессия малой РНК MTS1338 положительно влияет на влияет на выживаемость и стрессоустойчивость MTb. Используя подход RNA-seq, мы продемонстрировали, что изменения в экспрессии генов, сопровождающие гиперэкспрессию MTS1338 при росте микобактерий в культуре, указывают на снижение трансляционной активности и роста бактерий. Эксперименты по реактивации MTb in vitro показали, что MTS1338 не синтезируется de novo, и, по-видимому, не принимает участие в процессе выхода из покоя. Конститутивная гиперэкспрессия MTS1338 улучшает выживаемость MTb in vitro в условиях низкого pH, окислительного стресса и длительного голодания, а также при инфекции макрофагах линии THP-1. MTS0997 активируется как при входе в покой, так и при реактивации, участвуя в индукции липидного обмена у микобактерий при выходе из покоя. При этом гиперэкспрессия MTS0997 не приводит к изменениям выживаемости Mtb в макрофагах THP-1. Также не выявлено значимого повышения выживаемости этого штамма в стрессовых условиях in vitro. Выявлены транскриптомные изменения в MTb, происходящие при инфекции перитонеальных макрофагов мыши штаммами с делецией малых РНК В обоих транскриптомах мутантов меняется экспрессия генов, связанных с выживанием при гипоксии, окислительном стрессе, а также модуляции иммунного ответа хозяина. Выявлено снижение синтеза триацилглицеридов (TAG), на что указывает репрессия гена tgs1 и Rv2395A, вовлеченного в накопление TAG. Синтез и накопление TAG в форме липидных капель характерны для MTb во время персистирующей инфекции и являются отличительными признаками микобактерий при латентном туберкулезе. Изменения в транскриптоме ∆MTS0997 по сравнению с клетками контрольного штамма характеризуются подавлением экспрессии ряда генов, в первую очередь, 10 генов семейства PE/PE-PGRS. Большинство этих белков секретируется или локализуется в клеточной мембране, для многих показано участие в модуляции иммунного ответа. Снижается экспрессия генов, участвующих в остановке созревания фаголизосом: Mce2R и Rv2395A. Транскриптом штамма с делецией MTS1338 характеризуется как активацией, так и репрессией ряда генов. Среди генов с подавленной экспрессией, вовлеченных в процесс адаптации к стрессу внутри макрофагов, можно выделить SigH, один из 12 альтернативных сигма факторов MTb, который индуцируется при окислительном и NO стрессах. Было показано, что SigH необходим бактериям при хронической инфекции, а гены его регулона модулируют врожденный иммунитет при туберкулезе. Гиперэкспрессия MTS1338 в M.smegmatis приводит к замедлению роста бактерий in vitro, небольшому, но статистически достоверному увеличению выживаемости M.smegmatis в инфицированных макрофагах THP-1, а также к замедлению процесса созревания фаголизосом. Для объяснения этих фактов мы провели анализ изменений протеома и секретома в культуре M.smegmatis при гиперэкспрессии в бактериях MTS1338. Чрезвычайно интересным было обнаружение секретирующихся белков семейства Ag85 - Ag85A (FbpA) в штамме с гиперэкспрессией MTS1338, и Ag85C (FbpC) в контрольном штамме. Эти белки высокогомологичны и обладают сходными функциями - они являются эстеразами миколовых кислот. Тем не менее, их роль в биогенезе клеточной стенки различается. FbpC специализируется на миколировании арабиногалактана, тогда как FbpA необходим для синтеза корд-фактора (димиколата α-α’трегалозы (TDM). TDM необходим для блокирования слияния фагосома-лизосома и обеспечения роста в макрофаге. При входе в стационарную фазу синтез TDM снижается. В M.smeg-1338 активируется синтез белков системы секреции ESX-3. Таким образом, экспрессия малой РНК MTS1338 приводит к двум существенным изменениям в метаболизме M.smegmatis – этерификации миколовых кислот и синтезе корд-фактора (что приводит, в том числе, к замедлению созревания фаголизосомы), а также перестройке метаболизма железа. Оба этих события характерны для начальных стадий MTb инфекции. Изучена выживаемость мутантных штаммов в первичных культурах макрофагов мыши и человека, а также изменения в спектре цитокинов. Различия в выживаемости микобактерий дикого типа, ∆MTS0997 и ∆MTS1338 в макрофагах были выявлены в системе с альвеолярными человеческими макрофагами. Альвеолярные макрофаги сильнее всего ограничивают рост ∆MTS1338. ∆ MTS0997, напротив, лучше всего выживает в макрофагах. Активацию перитонеальных макрофагов мыши, инфицированных различными микобактериями, оценивали по уровню экспрессии мРНК цитокинов в системе in vitro. Выявлены различия как при инфицировании микобактериями дикого типа и мутантными формами, так и при инфицировании разными мутантными формами. Инфицирование макрофагов H37RV wt и ∆MTS0997 приводит к увеличению экспрессии таких провоспалительных факторов как TNFa, IL-11, IL-1β и NF-IL6. Инфицирование макрофагов мутантной формой ∆MTS1338 приводит к достоверно большему усилению экспрессии NF-IL6, Aif1 и MARCO. Исследуемые мутантные штаммы разнонаправленно действуют на экспрессию таких генов, как TGFb, Aif1 и MARCO.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Определены эукариотические метаболические пути, регулирующиеся малыми микобактериальными РНК MTS1338 и MTS0997 при инфекции. Делеция гена малой РНК MTS0997: приводит к следующим изменениям в метаболизме макрофагов 1. Активация процессов цитоплазматической и митохондриальной трансляции. Активируется синтез большинства белков обеих рибосомных субъединиц, а также ряда нуклеопротеинов, вовлеченных в биогенез рибосом, в частности, в пре-rRNA процессинг (2'-гидрокси метилирование и псевдоуридинилирование рибозных остатков). Активирована транскрипция генов рибосомных белков митохондрий. 2. Активируется процесс окислительного фосфорилирования. Повышается экспрессия белков комплекса I (NADH убихинон-оксидоредуктазы), белков комплекса II (сукцинат-убихинон-оксидоредуктазы), белков комплекса IV (цитохром С- оксидазы). 3. убиквитин-зависимый протеолиз (активированы убиквитин-конъюгирующие белки Е2 и убиквитин-лигазы Е3) и образование протеасомы (активация синтеза компонентов 20S субъединицы протеасомы) и иммунопротеасомы. 4. Репрессируются процессы, связанные с ДНК-зависимой транскрипцией. Снижается экспрессия генов белков, содержащих цинк-фингерные домены. Снижается экспрессия белков ацетилирования гистонов, фактора инициации транскрипции Taf1, гистоновых деметилаз. Делеция гена малой РНК MTS1338 приводит к следующим изменениям: 1. остановка созревания фагосомы и презентации антигенов. 2. Репрессия синтеза белков клеточной адгезии 3. Нарушение TNF-сигнального пути. При сравнении списков дифференциально экспрессирующихся генов макрофагов, инфицированных мутантными по генам малых РНК микобактерий, выявились группы генов, с «зеркальным» изменением экспрессии, сериновые протеазы гранзимы, ингибиторы сериновых протеах серпины и матриксные металлопротеиназы. Определено воздействие малых микобактериальных РНК на экспрессию цитокинов при туберкулезной инфекции. По данным RNA-seq подтвержденным независимо количественным ОТ-ПЦР, в макрофагах, инфицированных мутантными штаммами, снижается экспрессия IL1b, Il5, IL12, повышается Il11. При инфекции ∆MTS1338 повышается экспрессия Il13, IL21, IL27, при инфекции ∆MTS0997 – повышается экспрессия Il21. Большой интерес представляет разнонаправленное изменение экспрессии провоспалительных IL6 и IL10, которые снижаются при инфекции ∆MTS1338 по сравнению с диким типом и повышаются при инфекции ∆MTS0997. Определены бактериальные метаболические пути, регулирующиеся малыми микобактериальными РНК при стрессах. Конститутивная оверэкспрессия MTS1338 в культивируемых микобактериях в отличие от MTS0997, положительно влияет на влияет на выживаемость и стрессоустойчивость MTb. Используя подход RNA-seq, мы продемонстрировали, что повышение выживаемости и стрессоустойчивости, обусловленное оверэкспрессией MTS1338, связано с повышением уровня экспрессии ряда транскрипционных регуляторов-металлосенсоров, таких как: cmtR, csoR, Rv2034, сadI. При анализе уровня экспрессии малой РНК MTS1338 в штамме оver1338 под действием различных стрессов (NO, Н2О2, низкие значения рН) было обнаружено снижение ее уровня экспрессии в условиях окислительного стресса, но не под действием других стрессогенных факторов. Интересно, что вместе со снижением уровня экспрессии MTS1338 в штамме оver1338 под действием Н2О2 наблюдалось снижение уровня экспрессии целого ряда генов, таких как furA, являющегося маркером стрессового ответа и кодирующего глобальный контролирующий элемент, использующий катионы Fe(II) в качестве кофактора, связывающего оператор репрессированных генов, mazEF6 – модуль токсин-антитоксин, РЕ20 – возможный участник секреторного аппарата M. tuberculosis, а также ряда белков с неизвестной функцией (Rv3188, Rv3839). Oтдельного рассмотрения заслуживает белок Rv2617, недавно идентифицированный как фактор вирулентности микобактерий, вовлеченный в устойчивость к окислительному стрессу. Исследовано влияние экспрессии малых микобактериальных РНК на спектр микроРНК макрофагов. Инфекция штаммом ∆MTS1338 приводит к увеличению количества транскриптов miR-144, предсказанными мишенями которой являются мРНК гена Meis2, IL12rb2, IL13, serpine1; let-7c (предсказанная мишень - мРНК генов Klf4, serpine1) и к уменьшению количества транскриптов miR-96-5p (мишень Foxq1, miR-147 (мишень Tgf2β), miR466i (мишень wnt1). Таким образом, среди метаболических путей, опосредованных микроРНК, можно выделить негативную регуляцию транскрипции из-за повышения экспрессии транскрипционного репрессора Forkhead box protein Q1 (Foxq1) и снижения экспрессии транскрипционного активатора homeobox protein Meis2. Было показано, что Meis2 вовлечен в регуляцию транскрипции KLf4, Krueppel-like factor, который, в свою очередь, ингибирует CIITA/MHC-II-опосредованный путь антиген презентации в инфицированных макрофагах Инфекция штаммом ∆MTS0997 приводит к увеличению количества транскриптов miR-486a/b-5p (предсказанными мишенями которых являются мРНК генов Ncoa6, Xiap, Zfp970), miR-122-5p (предсказанные мишени - мРНК генов Shprh; Usp49), miR-29b-1-5p (предсказанные мишени - мРНК генов Kat6a, Zfp449, Zfp800). Группа выявленных предположительных мишеней вовлечена в процессы регуляции экспрессии посредством модификации гистонов. Повышение экспрессии микроРНК miR-486a/b-5p выявлено для макрофагов, инфицированных как ∆MTS1338, так и ∆MTS0997. Предсказанной мишенью для этих микроРНК является мРНК гена IL1a, который репрессируется также в обоих случаях. Определено влияние малых РНК на выживаемость в моделях туберкулезной инфекции. Показано, что микобактерии мутантные по генам малых РНК менее вирулентны в модели мышиной инфекции Была проведена сравнительная оценка вирулентности мутантных форм микобактерий и M. tuberculosis H37Rv дикого типа при инфекции мышей чувствительной к ТБ линии I/St. Было показано снижение бактериальной нагрузки в легких мышей при инфекции штаммом H37Rv-∆MTS1338, но не для штамма H37Rv-∆MTS099. Анализ морфологической картины легочной ткани показал, что для мышей линии I/St, инфицированных микобактериями H37RV, характерно более сильное воспаление и инфильтрация; очаговые диффузные скопления клеток, располагающиеся вокруг стенок крупных сосудов и бронхов. Гистологических различий в легочной ткани мышей, инфицированных мутантными формами MTS∆0997 и MTS∆1338, выявлено не было. Различия с диким типом отмечены в плотности клеток воспалительного инфильтрата, которая у мышей, зараженных мутантными штаммами H37Rv-MTS∆0997 и H37Rv-MTS∆1338, была значительно меньшей. Для групп мышей, инфицированных мутантными формами микобактерий, характерно снижение содержания нейтрофилов в легочной ткани и общего количества лимфоидных клеток по сравнению с инфекцией микобактериями H37Rv-wt. Также показано достоверное увеличение количества тканевых легочных макрофагах при инфицировании штаммом дикого типа, по сравнению с инфицированием H37Rv-MTS∆1338. Анализ выживаемости по Каплан-Майеру показал, что срок жизни мышей, инфицированных мутантными штаммами микобактерий, был достоверно больше, чем таковой в группе животных, инфицированных H37Rv.