Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Термин «саркома мягких тканей» объединяет целую группу редких нозологических форм, разнообразных в отношении биологических особенностей и прогноза заболевания. В этой связи особенно актуальным представляется выявление молекулярно-генетических маркеров, позволяющих повысить эффективность диагностики и лечения СМТ. В течение первого года проекта создана коллекция образцов от 294 больных, включающая широкий спектр существующих разновидностей СМТ. Разработаны и апробированы на клиническом материале тест-системы, позволяющие осуществлять дифференциальную диагностику 9 типов СМТ (рабдомиосаркома, синовиальная саркома, выбухающая дерматофибросаркома, саркома Юинга, светлоклеточная саркома, десмопластическая мелкокруглоклеточная саркома, миксоидная липосаркома, альвеолярная soft part саркома, воспалительная миофибробластическая опухоль). Наличие данного арсенала даёт возможность проводить уточняющую диагностику в сложных случаях, когда клинико-морфологические характеристики опухоли не позволяют установить конкретный гистотип; такая ситуация нередко встречается в практической онкологии и затрудняет выработку лечебной тактики. Сравнение существующих методов, позволяющих детектировать наличие транслокаций (FISH, ИГХ, RT-PCR), свидетельствует о том, что использование исключительно молекулярно-генетических методов анализа (оценка несбалансированной экспрессии участников транслокаций, прямое выявление химерных транскриптов) вполне достаточно для решения задач по уточнению типа СМТ и обнаружению предиктивных маркеров. Применение такого рода тестов возможно на базе любой лаборатории, где имеется оборудование для ПЦР и не зависит от наличия дорогостоящих и/или малодоступных реагентов. Проведена апробация метода таргетного высокопроизводительного секвенирования RNA Fusion Panel, который станет основным инструментом исследования на следующем этапе проекта. Этот подход позволил выявить транслокации в 7 из 11 образцов СМТ, негативных в отношении наиболее типичных перестроек; при этом были обнаружены две ранее не описанные перестройки. Получены сведения о молекулярно-генетических характеристиках пациентов с крайне редкой разновидностью СМТ - воспалительными миофибробластическими опухолями (ВМО). В отличие от других категорий СМТ, где выявление того или иного молекулярно-генетического события позволяет уточнить гистологический тип, при ВМО обнаружение транслокаций имеет предиктивное значение, позволяя назначить терапию таргетными препаратами - ингибиторами тирозинкиназ. Лекарственное лечение даёт возможность избежать проведения калечащих операций, которые, как правило, ведут к глубокой инвалидизации больных. Комбинация тестов на несбалансированную экспрессию наиболее частых участников транслокаций (ALK и ROS1) с последующим проведением RT-PCR и секвенированием химерного транскрипта позволила выявить транслокации у 12 из 28 больных ВМО (43%). Любопытно, что в группе ROS1-позитивных образцов все транслокации были представлены единственным вариантом - TFGex4/ROS1ex35. Последующее применение таргетного высокопроизводительного секвенирования кДНК позволило обнаружить другие, менее типичные перестройки, еще в 7 случаях. Такая высокая частота выявленных транслокаций (19 из 27, 68%) позволяет надеяться на успешное применение таргетной терапии кризотинибом у значительного числа больных.

Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Опухоли детского возраста, несмотря на относительно невысокую частоту, представляют собой важную медицинскую проблему. Саркомы составляют до 20% всех солидных новообразований у детей, причем около 90% случаев этого заболевания приходится на саркомы мягких тканей (СМТ). Эта группа опухолей включает в себя более 50 различных гистологических подтипов, многие из которых принципиально отличаются в отношении прогноза заболевания и возможностей лечения. Главной практической задачей нашего исследования является выявление молекулярно-генетических маркеров, позволяющих как предсказать ответ на назначаемую терапию, так и предоставляющих возможность проведения дифференциальной диагностики различных типов СМТ. Для этого нами разработаны тесты, направленные на диагностику основных типов транслокаций, характерных для СМТ, а также на оценку экспрессии опухолеспецифических антигенов. Плеоморфные саркомы – группа мезенхимальных опухолей со сложным паттерном генетических изменений. Они могут происходить из разных клеточных популяций, т.е., иметь миогенную, липогенную или нейрогенную дифференцировку. Однако, очень часто проведенное патоморфологическое исследование не позволяет установить происхождение опухоли: такие саркомы называют недифференцированными. Таким образом, в эту группу фактически попадают все непонятные случаи СМТ. Нами предпринята попытка охарактеризовать спектр молекулярных повреждений в недифференцированных плеоморфных саркомах как с целью возможного уточнения морфологического диагноза, так и для выяснения их потенциальной пригодности для иммунотерапии и таргетной терапии. Результаты исследования свидетельствуют, что иногда генетическое исследование действительно даёт основания изменить трактовку диагноза: в некоторых случаях НПС выявлены маркеры саркомы Юинга или дедифференцированной липосаркомы. В целом, тот или иной потенциально клинически значимый молекулярно-генетический маркер (транслокации, амплификация онкогенов, экспрессия опухолеспецифических антигенов) удалось выявить у 70% больных с НПС. Еще одной успешной точкой приложения молекулярно-генетических исследований стали воспалительные миофибробластические опухоли (ВМО). Транслокации с участием тирозинкиназ удалось выявить в 84% этих сарком; при этом слияния генов были обнаружены во всех ВМО с локализацией в легких. Практически все известные перестройки, найденные в ВМО, являются потенциальными мишенями для терапии, поэтому высокая клиническая ценность тестирования транслокаций у больных ВМО не вызывает сомнений. Кроме того, выявлен редкий случай воспалительной миофиброластической опухоли печени у ребенка 11 месяцев. Печень крайне редко поражается этим видом опухоли. Именно молекулярно-генетическое исследование - выявление специфической транслокации TPM3ex6/ALKex20 - позволило установить правильный диагноз. Наиболее часто перестройки с участием ALK встречаются у пациентов младшего возраста; они, как правило, ассоциированы с более доброкачественным течением заболевания. Данной пациентке было проведено радикальное хирургическое лечение, дополнительное лекарственное лечение не потребовалось. На выборке ВМО нами была продемонстрирована высокая конкордантность между различными методами выявления ALK–транслокаций. Совпадение результатов, полученных с помощью ПЦР и ИГХ является практически идеальным; в то же время, технология FISH способна давать как ложноположительные, так и ложноотрицательные результаты. Применение таргетного РНК-секвенирования позволило выявить некоторые ранее не описанные транслокации: в частности, новые химерные транскрипты описаны у больных с НПС и ВМО. Следует отметить, что подавляющее большинство перестроек, выявленных в этом исследовании, были обнаружены с помощью ПЦР-тестов. Принимая во внимание относительно низкую стоимость такого подхода, целесообразно использовать ПЦР для первоначального анализа СМТ и проводить высокопроизводительное секвенирование только в тех опухолях, которые являются отрицательными по результатам ПЦР.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Продолжено изучение молекулярно-генетических характеристик опухолей мягких тканей, в которых на предыдущем этапе проекта не было выявлено молекулярных повреждений. Основные усилия третьего года проекта были направлены на описание молекулярно-генетических характеристик недифференцированных плеоморфных сарком (НПС). В частности, установлено, что повышенная экспрессия белка EZH2, являющаяся перспективной мишенью для таргетной терапии, не выявлена ни в одном из 30 образцов НПС. Феномен микросателлитной нестабильности обнаружен только в одном из 42 образцов НПС (2,4%); молекулярно-генетический анализ подтвердил диагноз синдрома Линча. Установлено, что недифференцированные плеоморфные саркомы редко возникают на фоне дефектов системы mismatch–репарации ДНК, однако, с учетом возможностей иммунотерапии у таких пациентов, скрининг на наличие микросателлитной нестабильности оправдан с практической точки зрения. Проведена оценка мутационной нагрузки (tumor mutation burden, TMB) в образцах НПС. Медиана показателей мутационной нагрузки составила 8,5 мутаций на 1 Мб (4-37 мутаций на Мб). 12 из 19 опухолей (63%) имели низкий (менее 10 мут/Мб), а 7 (37%) - высокий (более 10 мут/Мб) TMB. Таким образом, в целом для НПС характерна невысокая частота соматических мутаций, что не исключает существование единичных случаев с высоким TMB, перспективных в отношении иммунотерапии. Проведен анализ спектра соматических мутаций в недифференцированных плеоморфных саркомах (n = 19). К неоднократно выявленным в выборке НПС молекулярным повреждениям относились: амплификация HER2, мутации TP53, EGFR, ARID1A, NOTCH3, SMO, CREBBP, APC, CARD11, MLH1, TSC2, ATR, BRCA2, PTEN, ROS1, SLX4, NBN, NF1, PTCH1, PIK3CA. Мутации в кодоне 600 гена BRAF, являющиеся маркером чувствительности к вемурафенибу, обнаружены в 2 из 42 (5%) НПС. Установлено, что у двух пациентов НПС развились на фоне наследственного заболевания (нейрофиброматоз 1 типа). Еще у двух пациентов были выявлены наследственные мутации NBN и NSD1, однако, их причастность к патогенезу новообразования остается неясной. Завершено исследование воспалительных миофибробластических опухолей (ВМО) – разновидности сарком мягких тканей, при которых часто находят мишени для таргетной терапии. В течение третьего года проекта набрано еще 18 опухолевых образцов от пациентов с ВМО. Транслокации ALK, ROS1, NTRK3 были обнаружены в 16 опухолях (89%). Выявлены следующие варианты перестроек: TFGex4-ROS1ex35 (n = 5), ETV6ex5-NTRK3ex15 (n = 2), RANBP2ex18-ALKex20 (n = 2), DCNT1ex26-ALKex20 (n = 1), EML4ex2-ALKex20 (n = 1), TPM3ex6-ALKex20 (n = 1), TFGex6-ALKex20 (n = 1). Кроме того, обнаружены три ранее не описанных транслокации - CLTC-18bpint19-20ALKex20, RANBP2ex18-ins93bp-ALKex20 и RRBP1ex10/ALKex20. Установлено, что мутации c-kit нехарактерны для воспалительных миофибробластических опухолей (ВМО). Опубликована работа, обобщающая полученные сведения о молекулярно-генетических характеристиках ВМО [Preobrazhenskaya et al, 2020]. Проведен поиск предиктивных маркеров (транслокаций) в выборке детских опухолей 34 детских опухоли разнообразной гистологии (низкодифференцированная саркома, папиллярная мезотелиома брюшины, рабдомиосаркома мочевого пузыря, светлоклеточная саркома почки, саркома Юинга, альвеолярная рабдомиосаркома, опухоль оболочек периферических нервов мягких тканей, дерматофибросаркома, миксоидная липосаркома, NUT-карцинома, ангиосаркома) были исследованы на предмет наличия перестроек ALK, ROS1, RET, NTRK1/2/3, имеющих предиктивное значение. Транслокации выявлены в 5 случаях (15%). Двое пациентов с NUT – карциномами и выявленными перестройками NSD3-NUTM1 и BRD4-NUTM1 включены в клиническое исследование нового таргетного препарата.