Аннотация результатов, полученных в 2018 году
Одной из наиболее острых проблем современного здравоохранения является распространение штаммов бактерий, устойчивых к антибиотикам. Среди путей решения этой проблемы можно выделить разработку новых антибиотиков, основанных на новых принципах и потенциально менее подверженных развитию устойчивости. Одним из перспективных классов соединений, обладающих подобными характеристиками, являются антибактериальные лизины. Антибактериальные лизины представляют собой белки, которые расщепляют пептидогликан клеточной стенки бактерий, что приводит к лизису и гибели бактериальных клеток. Однако, как и любая новая технология, антибактериальные лизины не лишены недостатков. Данный проект направлен на поиск подходов к улучшению свойств антибактериальных лизинов. Все подходы будут отрабатываться на примере лизостафина – наиболее изученного антибактериального лизина, активного в отношении золотистого стафилококка. Одним из основных недостатков антибактериальных лизинов является их быстрое выведение из крови при системном введении, из-за чего требуется многократное введение относительно больших доз. В первый год выполнения проекта работы были посвящены разработке методик, позволяющих оценить активность лизостафина и его вариантов, а также попытке увеличить время нахождения лизостафина в крови с помощью двух разных подходов – димеризации и связывания с альбумином. Лизостафин представляет собой относительно небольшой белок размером 27 кДа, состоящий из двух доменов: пептидогликан-связывающего (или таргетирующего) домена, который, как следует из названия, отвечает за связывание лизостафина с клеточной стенкой бактерий, и каталитического домена, непосредственно осуществляющего гидролиз пептидогликана. В составе пептидогликана лизостафин гидролизует пептиды, состоящие из пяти остатков глицина, соединяющие между собой полисахаридные цепочки. Такие пентаглициновые сшивки характерны для клеточных стенок золотистого стафилококка. Для определения активности лизостафина и его вариантов были разработаны несколько методик. Во-первых, была разработана методика определения способности лизостафина лизировать клетки стафилококка. Методика основана на способности бактерий, как достаточно крупных частиц, рассеивать свет. Из-за этого суспензия бактерий достаточной концентрации выглядит мутной. Разрезание пептидогликана приводит к лизису бактерий, что визуально выглядит как просветление исходно мутной суспензии бактериальных клеток вплоть до получения полностью прозрачного раствора. Чем больше концентрация лизостафина и чем выше его активность, тем быстрее просветляется суспензия бактериальных клеток. Так, лизостафин в концентрации 1 мкг/мл просветляет суспензию бактериальных клеток с исходной концентрацией 1.2×10^9 клеток/мл наполовину за 11,0±1,0 минут. Эта методика позволяет оценить «интегральную» активность лизостафина, на которую влияют как ферментативная активность каталитического домена, так и эффективность связывания с пептидогликаном таргетирующего домена. Чтобы оценить ферментативную активность каталитического домена, необходимо измерить скорость расщепления им изолированного пентаглицинового пептида. Для этого была использована реакция нингидрина с аминогруппами пептидов с образованием окрашенного продукта. Чем больше аминогрупп присутствует в растворе, тем интенсивнее становится его окраска после реакции с избытком нингидрина, что можно детектировать спектрофотометрически. Поскольку лизостафин расщепляет пентаглицин на диглицин и триглицин, то есть один пептид на два пептида, количество аминогрупп увеличивается в два раза, позволяя следить за ходом реакции по окраске реакционной смеси после обработки нингидрином. Для того, чтобы увеличить время пребывания лизостафина в крови, мы сконструировали два химерных белка. Один из них, Lst-HDD, состоит из лизостафина на N-конце белка и димеризационного домена на C-конце. Этот домен, представляющий собой α-спираль, позволяет белку формировать антипараллельные («голова к хвосту») гомодимеры. За счет этого увеличивается эффективная молекулярная масса белка, что должно препятствовать его прохождению через гломерулярный фильтр и замедлять его выведение через почки. Способность химерного белка к димеризации была подтверждена с помощью гель-фильтрационной хроматографии, а его активность была измерена с помощью разработанных методик. Активность Lst-HDD на клетках стафилококка оказалась в три раза ниже активности лизостафина (36,2±2,4 мин на 1 мкг/мл белка), хотя на ферментативную активность каталитического домена димеризационный домен не повлиял. Важно, что при внутривенном введении димеризация белка действительно способствовала его более медленному выведению из крови, хотя эффект не был значительным. Период полувыведения лизостафина оказался равен 2,1 часа, его площадь под фармакокинетической кривой – 4,3 мг*час/л. Для Lst-HDD эти показатели были равны 2,9 часа и 6,1 мг*час/л соответственно. Другой химерный белок, созданный на основе лизостафина – Lst-AlBD, вместо димеризационного домена содержал домен, способный связываться с альбумином крови. Идея заключается в том, что, связываясь с альбумином, белок, как и в случае димеризации, повышает свою эффективную молекулярную массу, что замедляет его выведение почками. Известно, что связывание с альбумином позволяет существенно замедлить выведение других рекомбинантных белков, однако как именно альбумин-связывающий домен повлияет на активность лизостафина, было не ясно. Альбумин-связывающий домен в составе белка Lst-AlBD сохранил способность связываться с альбумином – константа диссоциации комплекса Lst-AlBD с крысиным альбумином оказалась равна 4,5 нМ, что свидетельствует о высокоаффинном связывании. Как и димеризационный домен, альбумин-связывающий домен снижал активность лизостафина в отношении клеток стафилококка (22,1±1,6 мин на 1 мкг/м белка), особенно после связывания с альбумином (80,4±12,9 мин на 1 мкг/мл белка). Вероятно, размер белка является критическим для его взаимодействия с пептидогликаном. Интересно, что каталитическая активность такого белка в отношении пентаглицина оказалась, наоборот, выше активности лизостафина. Причина такого эффекта на настоящий момент не ясна. Наибольшее же отличие Lst-AlBD от лизостафина заключалось в скорости его выведения из крови животных. Время полувыведения Lst-AlBD оказалось равно 7.7 часа, а площадь под фармакокинетической кривой составила 385 мг*час/л. Так, при внутривенном введении одинакового количества лизостафина и Lst-AlBD крысам, Lst-AlBD мог быть обнаружен в их крови даже спустя 30 часов после введения, в то время как лизостафин практически полностью выводился уже через 4 часа. Таким образом, наиболее перспективным вариантом оказался Lst-AlBD – лизостафин с альбумин-связывающим доменом. Влияние альбумин-связывающего домена на активность лизостафина было не столь негативным, как влияние димеризационного домена, и перевешивалось значительным повышением времени пребывания белка в крови за счет связывания с альбумином. Мы будем проводить дальнейшую оптимизацию это варианта лизостафина, чтобы снизить отрицательное влияние альбумин-связывающего домена на активность лизостафина.

Аннотация результатов, полученных в 2019 году
Антибактериальные лизины представляют собой белки, способные специфично связываться с клеточной стенкой бактерий и разрушать защитный пептидогликановый слой, приводя к гибели бактериальной клетки. В настоящий момент антибактериальные лизины рассматриваются как один из перспективных классов новых антибиотиков, способных помочь в борьбе с распространением антибиотико-резистентных штаммов патогенных бактерий. Данный проект направлен на поиск способов рациональной оптимизации антибактериальных лизинов с целью упростить дальнейшую разработку разнообразных соединений этого класса. Работа проводится на примере лизостафина – одного из наиболее активных и хорошо изученных антибактериальных лизинов. В предыдущем году работы были сосредоточены на поиске способов увеличить время жизни лизостафина в крови. Лизостафин, как и другие антибактериальные лизины, быстро выводится из системной циркуляции за счет почечной фильтрации. В предыдущем годы мы показали, что димеризация лизостафина за счет добавления в его структуру специального димеризационного домена хотя и способствует увеличению времени его пребывания в крови, достигаемый таким способом эффект незначителен, а кроме того, димеризация негативно влияет на бактериолитическую активность лизостафина. Однако, другой подход – добавление в структуру лизостафина альбумин-связывающего домена, благодаря чему белок образует в крови комплекс с сывороточным альбумином, – позволил увеличить время полувыведения лизостафина в несколько раз. К сожалению, взаимодействие с альбумином, как и димеризация, снижало активность лизостафина. В этом году нами было подготовлено и опубликовано две научных работы в журнале первого квартиля, описывающих результаты предыдущего года. Кроме того, интернет-издание PCR.news опубликовало заметку о полученных нами результатах (http://pcr.news/novosti/modifikatsiya-bakteritsidnogo-belka-prodlyaet-srok-ego-prebyvaniya-v-krovi/). Работы этого года были сосредоточены на попытках оптимизировать структуру лизостафина с альбумин-связывающим доменом таким образом, чтобы сохранить его долгое время жизни в системном кровотоке и восстановить бактериолитическую активность до уровня немодифицированного лизостафина. Для этого было выбрано два подхода, связанных с оптимизацией линкера – участка полипептидной цепи, соединяющего лизостафин и альбумин-связывающий домен. Первый подход заключается в выборе линкера с оптимальной для данного белка длиной и гибкостью. Известно, что при создании химерных белков, состоящих из двух функциональных частей (в нашем случае – лизостафина и альбумин-связывающего домена), на их активность в составе химерного белка решающую роль может оказывать природа соединяющего их линкера. Как правило, когда соединяются два домена, обладающих ферментативной активность в отношении каких-либо низкомолекулярных субстратов, максимальное разнесение доменов в пространстве за счет длинных и жестких линкеров позволяет сохранить их исходную активность. Однако, в случае с антибактериальными лизинами картина осложняется тем, что их субстратом является не какое-либо низкомолекулярное соединение, а пептидогликан, обладающий сложной и до конца не изученной пространственной структурой, размеры которого во много раз больше размеров самих лизинов. Как в этом случае скажется длина и гибкость линкера между лизином и дополнительным доменом на активность химерного белка заранее не известно. Для того, чтобы это выяснить, были созданы генетические конструкции, кодирующие 6 вариантов лизостафина с альбумин связывающим доменом, соединенных разными линкерами: коротким и длинным гибкими линкерами, состоящими из чередующихся остатков аминокислот глицина и серина, более жесткими коротким и длинным линкерами из чередующихся остатков пролина и аланина, а также коротким и длинным линкерами, формирующими вторичную структуру α-спирали и обладающими максимальной жесткостью. Наибольшей бактериолитической активностью обладал вариант белка с жестким α-спиральным линкером, однако не с длинным, а с коротким его вариантом. По-видимому, более компактная и жесткая структура белка выгоднее для бактериолитической активности лизинов. Другим подходом, связанным с оптимизацией линкера между лизостафином и альбумин-связывающим доменом, является использование гидролизуемого линкера. В крови человека и животных присутствует большое количество протеолитических ферментов, благодаря чему возможно создание линкера, содержащего в себе сайт гидролиза одной или нескольких таких протеаз. При удачном подборе последовательности линкера, обладающего оптимальной кинетикой гидролиза, можно добиться создания пула долго циркулирующего в крови, но слабо активного химерного белка, из которого по мере гидролиза линкера протеазами крови высвобождается быстро выводящийся, но высокоактивный вариант исходного белка (в нашем случае – нативного лизостафина). В результате анализа литературы было выбрано 4 разных последовательности линкера, гидролиз которых был показан in vitro или in vivo. Созданы генетические конструкции, кодирующие соответствующие химерные белки. Один из таких белков наработан в E. coli, показана его способность лизировать клетки стафилококка. Как и ожидалось, в комплексе с альбумином бактериолитическая активность белка снижается. В настоящий момент ведется отработка и оптимизация методик изучения скорости гидролиза линкера протеазами сыворотки крови. Основная проблема связана с негативным влиянием сывороточных белков на многие стандартные методики. Еще одним перспективным способом улучшения антибактериальных лизинов может быть рациональный подбор каталитических и таргетирующих доменов. Большая часть антибактериальных лизинов, действующих на грам-положительные бактерии, состоит из двух (иногда больше) доменов, один из которых связывается с клеточной стенкой, а другой обладает каталитической активностью и непосредственно расщепляет пептидогликан. В настоящий момент нет работ, которые бы систематически исследовали выбор таргетирующих доменов и влияние компонентов клеточной стенки, с которыми они связываются, на активность лизинов. Однако в зависимости от конкретной мишени, с которой связан таргетирующий домен, а также аффинности этого домена, будет существенно меняться расположение лизина в сложной трехмерной структуре пептидогликана, что в свою очередь повлияет на доступ каталитического домена к своему субстрату (в случае лизостафина – поперечным пентаглициновым мостикам). Таргетирующий домен лизостафина связывается с теми же пентаглициновыми сшивками в пептидогликане, которые являются мишенью его каталитического домена. Мы выбрали 3 других домена, связывающихся с разными компонентами клеточной стенки стафилококка: LysM-домен, взаимодействующий с полисахаридной частью пептидогликана, GW-модуль, связывающий тейхоевые кислоты, и аффибоди-домен (небольшой белковый домен, специально модифицированный для взаимодействия с какой-либо мишенью), специфичный в отношении белка A, в норме ковалентно иммобилизованного на клеточной стенке стафилококка. Были созданы генетические конструкции, кодирующие химерные белки, состоящие из каталитического домена лизостафина и выбранных таргетирующих доменов, проводится наработка и очистка этих белков. Кроме того, для контроля и визуалиации того, как выбранные таргетирующие домены взаимодействуют с клетками стафилококка, были созданы химерные белки, состоящие из этих доменов и красного флуоресцентного белка mRFP1. Из-за влияния доменов в этих химерных белках друг на друга потребовалась оптимизация их взаимного расположения для получения белков, обладающих флуоресцентными свойствами. В настоящий момент ведется изучение связывания флуоресцентных белков с клетками стафилококка. Помимо запланированных на этот год экспериментов, были проделаны дополнительные работы, необходимость которых стала очевидной в ходе выполнения проекта. Например, было обнаружено, что выделение вариантов лизостафина с помощью никель-хелатной хроматографии существенно снижает активность таких белков. Никель-хелатная хроматография является удобным и широко распространенным способом очистки рекомбинантных белков, при которой белок, дополнительно несущий на одном из концов несколько (обычно 6) остатков гистидина, взаимодействует с сорбентом, содержащим ионы никеля, за счет хелатирования ионов никеля остатками гистидина. Лизостафин, однако, содержит 4 остатка гистидина в активном центре своего каталитического домена, которые в норме связывают ион цинка. При его очистке на сорбенте с большим количеством ионов никеля, по-видимому, происходит замещение ионов цинка в активном центре на ионы никеля, что и приводит к снижению активности. Кроме того, известно, что лизостафин может связывать и второй ион цинка (или никеля либо другого металла), еще больше ингибирующий его активность. Несмотря на это, во многих работах, в том числе опубликованных в высокорейтинговых журналах, используется лизостафин, очищенный с помощью никель-хелатной хроматографии (например, Gonzalez-Delgado et al. Two-Site Recognition of Staphylococcus Aureus Peptidoglycan by Lysostaphin SH3b. Nature Chemical Biology, 2019). Для того, чтобы решить эту проблему, была разработана методика восстановления активности лизостафина после очистки на никель-хелатной хроматографии, позволяющая заменить ионы никеля не ионы цинка и удалить лишние, ингибирующие ионы цинка из структуры белка. В следующем году мы планируем подготовить публикацию с описанием этой методики. Другим интересным направлением исследований, открывшимся в ходе выполнения проекта, оказалась возможность детально исследовать влияние различных условий, таких как температура, pH и концентрация солей на разные стадии бактериолитического действия лизостафина. Для того, чтобы лизировать бактериальную клетку, лизостафин должен вначале связаться с пептидогликаном за счет таргетирующего домена, затем гидролизовать пентаглициновые мостики с помощью каталитического домена, после чего возможен собственно лизис клетки при достижении определенной степени разрушения пептидогликана. Однако в литературе отсутствуют работы, которые бы исследовали влияние условий среды на каждый из этапов действия лизостафина. Вместо этого авторы как правило ограничиваются изучением влияния условий на совокупный процесс лизиса клеток, наблюдая скорость просветления суспензии стафилококковых клеток под действием лизостафина. При этом детальное понимание того, как различные условия среды влияют на различные стадии действия лизостафина и лизинов вообще, поможет разработать подходы к рациональной оптимизации структуры лизинов, в частности, к выбору таргетирующих и каталитических доменов. В ходе выполнения проекта в наших руках оказались все необходимые методики и реактивы, в связи с чем было решено провести такое исследование в отношении лизостафина. Было показано, что концентрация NaCl слабо влияет на гидролиз пентаглицина, однако оказывает выраженный стимулирующий эффект на лизис бактериальных клеток. При этом характер связывания таргетирующего домена с пептидогликаном также меняется при добавлении все большего количества NaCl, однако этот эффект не связан с повышением аффинности домена к пептидогликану. Исходя из полученных результатов, которые подтверждаются и недавно опубликованными литературными данными, в пептидогликане стафилококка имеются два независимых сайта связывания для таргетирующего домена лизостафина. При этом полученные нами результаты указывают на то, что добавление NaCl маскирует один из этих сайтов, не влияя на связывание с другим. Возможно, один из сайтов связывания представляет собой «непродуктивный» сайт, связывание с которым ингибирует работу лизостафина, что могло бы объяснить повышение скорости лизиса клеток в присутствии NaCl. При повышении температуры повышались как скорость гидролиза пентаглицина, так и скорость лизиса клеток. Интересно, что повышение pH существенно влияло на скорость гидролиза пентаглицина, однако эффект pH на лизис клеток был выражен слабее. В следующем году планируется подготовка публикации по полученным результатам.

Аннотация результатов, полученных в 2020 году
Антибактериальные лизины – ферменты, расщепляющие пептидогликан клеточной стенки бактерий, что приводит к их осмотическому лизису и гибели. В настоящий момент эти белки рассматриваются как один из перспективных вариантов для замены или дополнения к существующим антибиотикам с целью борьбы с резистентными штаммами бактерий. Хотя у лизинов есть множество преимуществ, главное из которых – их способность действовать на бактерии, устойчивые к другим антибиотикам, у них есть и ряд недостатков. Данный проект направлен на разработку подходов, за счет которых можно было бы улучшить эффективность применения антибактериальных лизинов. Работа ведется на примере лизостафина как одного из наиболее активных и хорошо изученных антибактериальных лизинов. Лизостафин – небольшой белок (27 кДа), состоящий из двух доменов: каталитического и таргетирующего (пептидогликан-связывающего). Первый из них отвечает за гидролиз пептидогликана, второй- за связывание с бактериальной клеткой. Лизостафин активен в первую очередь в отношении золотистого стафилококка – одного из наиболее важных патогенов человека, часто устойчивого к традиционным антибиотикам. В этом году работа велась по нескольким направлениям, основными из которых были исследование возможности повысить эффективность лизостафина в отношении бактериальных биопленок, изучение влияния таргетирующего домена лизостафина на его антибактериальную активность, а также анализ литературы с целью составить представление о вероятности появления устойчивости к антибактериальным лизинам при их применении в клинической практике. Биопленки представляют собой бактериальные сообщества, в которых бактериальные клетки собраны в плотные агрегаты за счет взаимодействий между собой и с компонентами биопленочного матрикса. В состав матрикса как правило входят полисахариды, внеклеточная ДНК и белки, при этом конкретный состав зависит от вида и штамма бактерий и условий культивирования. Биопленки часто образуются на имплантируемых устройствах, протезах и катетерах, что влечет за собой риск развития бактериемии. Кроме того, основной проблемой, связанной с образованием биопленок, является их повышенная устойчивость к антимикробным соединениям. В том числе биопленки более устойчивы и к действию антибактериальных лизинов и, в частности, лизостафина. Одним из подходов к борьбе с биопленками, в некотором смысле комплементарным антибактериальным лизинам, является применение ферментов, разрушающих полимерные молекулы матрикса биопленок, таких как ДНКазы, протеазы и полисахарид-гидролазы. Разрушение матрикса приводит к дисперсии бактериальных клеток, благодаря чему они становятся более чувствительны к воздействию антимикробных соединений. В рамках работ, проводимых в этом году, мы исследовали эффективность лизостафина в смеси с белком дисперсином B в отношении биопленок золотистого стафилококка, а также создали химерный белок, состоящий из лизостафина и дисперсина B одновременно (далее Lst-DspB). Дисперсин B – гликозид-гидролаза, расщепляющая основной полисахарид матрикса биопленок золотистого стафилококка, поли-N-ацетилглюкозамин (PNAG). Действие как лизостафина, так и дисперсина B на биопленки зависело от условий их культивации. При выращивании биопленок в среде TSB с добавлением 1% глюкозы и 2% хлорида натрия, лизостафин полностью разрушал биопленки в концентрации больше 2 мкг/мл. Однако дисперсин B на такие биопленки не действовал. По всей видимости, использованные нами штаммы золотистого стафилококка не продуцируют PNAG при культивации в такой среде. Напротив, при добавлении в среду 1.5% крысиной плазмы, биопленки хотя и становились намного прочнее, приобретали чувствительность к обработке дисперсином B (в концентрации 500 мкг/мл наблюдалось полное разрушение биопленок). Однако к лизостафину такие биопленки были более устойчивы, даже в концентрации >10 мкг/мл (очень высокая концентрация для лизостафина) полная элиминация биопленок не достигалась. При сравнении активности химерного белка Lst-DspB с лизостафином и дисперсином оказалось, что энзиматическая активность обоих ферментов полностью сохраняется в составе химерного белка. Однако бактериолитическая активность Lst-DspB почти в 15 раз ниже активности лизостафина. Мы уже наблюдали такой эффект в случае лизостафина с альбумин-связывающим доменом в комплексе с альбумином. Увеличение размера молекулы лизостафина за счет добавления больших белковых модулей (образования комплекса с альбумином или слияние с дисперсином B) сохраняет энзиматическую активность белка, но снижает его бактериолитическую активность. Тем не менее, эффективность Lst-DspB в отношении биопленок золотистого стафилококка была в несколько раз выше по сравнению с простой смесью лизостафина и дисперсина B. Такое повышение эффективности связано либо с таргетированием дисперсина B к клеткам стафилококка за счет таргетирующего домена лизостафина, либо за счет ко-локализации бактериолитической и гликозид-гидролазной активностей лизостафина и дисперсина B. Изучение механизма повышения эффективности химерного белка Lst-DspB в отношении биопленок стафилококка представляет собой интересную задачу как с практической, так и с теоретической точки зрения. Как уже было отмечено, лизостафин состоит из двух доменов, каталитического и таргетирующего (пептидогликан-связывающего). Хотя каталитический домен лизостафина и способен расщеплять пентаглициновые пептидные сшивки в пептидогликане золотистого стафилококка, нарушая его связность и приводя к лизису бактериальной клетки, он является не очень эффективным ферментом. Это было продемонстрировано другими исследователями ранее, а также подтверждено нами в этом году с использованием разработанной в ходе выполнения проекта методики определения каталитической активности лизостафина (публикация находится на рецензии в журнале Antibiotics, Q1, импакт-фактор 3.9). Высокая бактериолитическая активность лизостафина достигается за счет его таргетирующего домена, благодаря которому фермент концентрируется в пространстве клеточной стенки – то есть месте повышенной концентрации его субстрата, пентаглициновых сшивок. Таргетирующий домен лизостафина связывается с пептидной частью пептидогликана, в том числе пентаглициновыми сшивками, которые являются субстратом каталитического домена. Мы решили проверить, как повлияет на активность лизостафина его перенаправление на другие компоненты клеточной стенки, отличные от пептидогликана, например, тейхоевые кислоты или ковалентно иммобилизованные в клеточной стенке белки. Для этого мы заменили таргетирующий домен лизостафина на GW-домен, связывающий тейхоевые кислоты (отрицательно заряженные линейные полимеры фосфатов и многоатомных спиртов, закрепленные либо в мембране, либо на пептидогликане), а также на домен аффибоди, связывающий белок A – один из белков клеточной стенки стафилококка. Кроме того, за счет конъюгации с флуоресцентным белком mRFP1, мы смогли изучить связывание этих доменов с клетками стафилококка. Как выяснилось, домен аффибоди, взаимодействующий с белком A, обладает почти в два раза большей аффинностью к клеткам стафилококка по сравнению с таргетирующим доменом лизостафина, а кроме того, каждая клетка может связать в три раза больше домена аффибоди. Тем не менее, бактериолитическая активность каталитического домена лизостафина с аффибоди в качестве таргетирующего домена оказалась примерно в 15-20 раз ниже. Напротив, GW-домен связывался с клетками стафилококка в три раза хуже (хотя и в большем количестве), но в составе химерного белка с каталитическим доменом лизостафина обладал сравнимой бактериолитической активностью. Все это указывает на нетривиальную зависимость бактериолитической активности лизостафина от конкретного молекулярного рецептора его таргетирующего домена, аффинности к клеткам и количества молекул белка, способных связываться с одной клеткой. Интересно отметить, что, хотя нам пока и не удалось найти таргетирующий домен, который помог бы улучшить бактериолитическую активность лизостафина, GW-домен обладал наибольшей активностью в растворах с низким содержанием солей, то есть именно в тех условиях, где нативный лизостафин наименее эффективен. То есть замена таргетирующего домена позволила изменить условия, оптимальные для действия лизостафина. Одним из ключевых свойств любого антибактериального соединения, к которым относятся и лизины, является вероятность развития к ним устойчивости. В конце концов, именно распространение устойчивых штаммов бактерий привело к потребности в разработке новых антибиотиков. Традиционно в литературе упоминается низкая вероятность развития устойчивости к лизинам. Однако это противоречит узкой специфичности действия таких ферментов, а также известным примерам, когда такая устойчивость все-таки развивается, либо уже присутствует в природе. Для того, чтобы прояснить этот вопрос, мы провели анализ литературы, посвященной устойчивости к различным ферментам, расщепляющим пептидогликан бактериальных клеток. В результате проведенного анализа стало очевидно, что развитие устойчивости к большинству лизинов действительно маловероятно in vitro – то есть за счет культивации бактерий в искусственных условиях в присутствии лизинов и отборе наиболее устойчивых вариантов. По всей вероятности, все дело в том, что для развития устойчивости к лизинам необходимо приобретение новых функциональных элементов (генов, кодирующих белки, модифицирующие пептидогликан или напрямую ингибирующие действие лизинов за счет связывания с ними), а не накопление точечных мутаций или геномных перестановок, которые легко получить селекцией in vitro. Напротив, многочисленные примеры устойчивости к различным лизинам, наблюдаемые в природе, показывают, что избежать действия лизинов вполне возможно. Мы предполагаем, что при применении лизинов в клинической практике появление устойчивых штаммов будет связано в первую очередь с горизонтальным переносом генетических детерминант устойчивости между исходно устойчивыми и чувствительными видами внутри бактериальных сообществ. К сожалению, на настоящий момент возможность такого распространения детерминант устойчивости к лизинам экспериментально не исследована. Таким образом, изучение этой возможности представляет собой важную и интересную задачу. Проведенный анализ литературы был оформлен в виде обзорной статьи и опубликован в журнале Critical Reviews in Microbiology (Q1, импакт-фактор 7.3).